PRÁTICA DE ANTIBIOGRAMA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA
DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA CLÍNICA
JAMILE ROCHA MEDEIROS
RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLIGA CLÍNICA
Petrolina-PE
2017
JAMILE ROCHA MEDEIROS
RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLIGA CLÍNICA
Trabalho apresentado à disciplina de Microbiologia Clínica, do Curso de Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Vale do São Francisco, como requisito parcial para obtenção da nota final.
Orientador(a): Andrea Colombo
Petrolina-PE
2017
PRÁTICA DE ANTIBIOGRAMA
INTRODUÇÃO
Antibiograma ou Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos é uma prova utilizada para alguns grupos de bactérias, principalmente as que adquirem resistência facilmente.
Os testes para a detecção de resistência são realizados em bactérias isoladas de amostras representativas de um processo infeccioso, no qual a sensibilidade aos antimicrobianos não é previsível ou quando existem problemas de resistência à antibióticos Por estes fatores o antibiograma é uma das principais funções do laboratório de microbiologia clínica.
O meio que deve ser utilizado para esta prova é o Ágar MüellerHinton por possuir propriedades que permitem o crescimento da maioria dos microorganismos não permitindo que seu perfil nutricional interfira na sensibilidade ou resistência das bactérias aos antibióticos. O mesmo é um meio de cultura em placas recomendado para a realização de antibiograma (teste de sensibilidade), é rico proteínas e carboidratos que fornece o substrato ideal para o desenvolvimento e crescimento de cepas bacterianas de interesse clínico. O teste é feito utilizando-se discos de difusão antibióticos depositados sobre a superfície do meio onde se inoculou, por espalhamento, uma amostra de uma cultura bacteriana previamente crescida em meio líquido.
O antibiograma é indicado sempre que o microorganismo causador da infecção não tenha um comportamento definido em relação a determinadas drogas, com o objetivo de determinar a concentração inibitória mínima do antibiótico a ser testado, diante de uma bactéria.
Os antibióticos normalmente atuam sobre a síntese protéica bacteriana impedindo a sua reprodução ou causando a sua morte.
OBJETIVO
Realizar o método antibiograma, verificar a sensibilidade ou resistência das bactérias aos antibióticos determinados.
MATERIAS
Placa de Petri;
Discos de difusão de antibióticos;
Cultura bacteriana;
Bico de Bunsen;
Alça de Drigalski.
PROCEDIMENTO
- A cultura previamente preparada em caldo nutriente.
- Devemos estar atento às técnicas para não haver contaminação da amostra ou do meio de cultura, à ser preparado, por bactérias do meio ambiente.
- Abrimos o tubo, contendo o caldo nutriente com as bactérias cultivadas, por trás do bico de Bunsen.
- Flambamos a abertura do tubo antes e depois da coleta do material.
- Para espalhar a amostra pela placa com ágar utilizamos a alça de Drigalski.
- Esta deve ser flambada antes do uso.
- E logo após o procedimento deve ser flambada novamente.
- Espalhadas as bactérias pelo ágar, coletamos dos vidros contendo antibióticos com a pinça, que deve ser flambada antes do manuseio, os discos de difusão de antibióticos, nada mais são que pequenos discos de papel poroso embebidos em antibiótico.
- Devemos estar atentos para que os discos fiquem bem aderidos ao ágar, para haver uma boa difusão e não descolarem durante o manuseio.
- Terminados estes procedimentos, encaminhamos a placa de Petri para a estufa.
- No dia determinado conferimos as placas contendo as bactérias cultivadas.
RESULTADO E DISCUSSÃO
Com o auxilio de uma régua, foi medido o diâmetro dos halos inibitórios de cada disco. Após a medição, as colônias bacterianas foram analisadas para determinar se houve sensibilidade ou resistência a cada antimicrobiano testado.
Tabela 1: Resultados
	SIGLA
	NOME
	TAMANHO DO HALO
	RESULTADO
	IPM 10
	IMIPENEM
	55mm
	SENSÍVEL
	NOR 10
	NORFLOXACIN
	37mm
	SENSÍVEL
	CFO 30
	CEFACLOR
	35mm
	SENSÍVEL
	ATM 30
	AZTREONAN
	NÃO FORMOU HALO
	SUSCEPTÍVEL
 Foi observado o crescimento bacteriano, principalmente nas áreas ao redor dos discos de antimicrobianos. O antibiótico presente nos discos difunde-se no meio de cultura sólida, atingindo concentrações decrescentes em torno do disco. A presença de crescimento em torno dos discos indica a sensibilidade do microrganismo ao antibiótico, ou seja, as colônias presentes no halo de inibição representam bactérias mutantes sensíveis à ação de antibiótico. Enquanto a ausência de crescimento indica a susceptibilidade ao antibiótico.
 Imagem 1: Placa de petri com os discos de antibiótico
 
 Fonte: próprio autor.
PRÁTICA DE ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM POSITIVOS
INTRODUÇÃO
Identificar um dado organismo como espécie baseia-se no preenchimento das características atribuídas àquela espécie. O reconhecimento da fonte ou origem do espécime (ambiente, espécie animal, tipo de patologia e localização) do organismo é às vezes fundamental para identificação. A execução inadequada de um teste preliminar pode confundir e prejudicar todo processo de identificação. Na rotina laboratorial são utilizados certos testes chaves para reduzir o trabalho, o custo e abreviar o tempo requerido para diagnóstico.
O processo de identificação dos microrganismos é efetuado através da determinação de um número mínimo de propriedades. Portanto, quanto menor o número de observações efetuadas, maior o risco de erros de identificação. Usualmente é necessário utilizar organismos como controles positivos e negativos para a execução de cada teste.
As colorações simples, diferenciais ou estruturais, mesmo se combinadas com diferentes tipos de cultivo e observação das características das colônias, não são suficientes para a identificação de bactérias isoladas. 
Devem-se utilizar outras técnicas ou metodologias que, combinadas com as outras características descritas anteriormente, possibilitem determinar com precisão qual a bactéria com que se está trabalhando e/ou pesquisando.
Os principais testes usados para identificação bacteriana são: fermentação de carboidratos, teste da catalase, teste de utilização de citrato, teste da coagulase, teste da bacitracina, novobiocina e optoquina, produção de H₂S, teste do indol, entre outras.
O gênero Staphylococcus pertence à família Micrococcaceae. São cocos Gram-positivos agrupados em cachos, imóveis aeróbios, não capsulados. Os estafilococos são membros da flora normal da pele e mucosa humana, podendo ser encontrados nas narinas anteriores de praticamente todas as crianças e em aproximadamente em 50% doa adultos. O Staphylococcus aureus esta frequentemente envolvido em infecções supurativas da pele e mucosa feridas pós-operatórias. E também responsável por um tipo de intoxicação alimenta e está ocasionalmente envolvido em septicemia, meningite, endocardite, osteomielite e outras infecções. O Staphylococcus epidermidis é um importante agente da endocardite e esta envolvido em infecções geniturinárias e infecções com agente secundário, o Staphylococcus saprophyticus esta relacionado com infecções do trato urinário.
OBJETIVO
Conhecer os princípios das provas bioquímicas utilizadas na identificação de espécies microbianas. 
Executar técnicas e interpretar resultados de identificação de espécies bacterianas através de provas bioquímicas.
MATERIAIS
Meio de ágar sangue;
Amostra;
Meio manitol salgado (7,5% NaCl);
Alça de Drigalski;
Bico de bunsen
PROCEDIMENTO
A amostra fornecida foi inoculada na placa de Petri no meio Ágar Sangue pela técnica de esgotamento, para isolamento das colônias e logo depois de colocada em estufa para crescimento das colônias. 
Após o crescimento das colônias no meio Ágar Sangue, repicar colônia bem isolada para meio Manitol Salgado, por técnica de esgotamento.
Realizaçãodo teste da catalase: colocar sobre uma lâmina uma porção da colônia isolada, evitando tocar no meio de cultura, adicionar uma gota de peróxido de hidrogênio 3% e observar.
Espalhamos novamente as bactérias pelo ágar, coletamos dos vidros contendo antibióticos com a pinça, que deve ser flambada antes do manuseio, e aderimos a placa de Petri, os discos de difusão de antibióticos, nada mais são que pequenos discos de papel poroso embebidos em antibiótico. Devemos estar atentos para que os discos fiquem bem aderidos ao ágar, para haver uma boa difusão e não descolarem durante o manuseio. Terminados estes procedimentos, encaminhamos a placa de Petri para a estufa.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
No meio Ágar Sangue houve crescimento das colônias que sofrem β-hemólise ou hemólise total, que é caracterizada pela lise completa das hemácias que rodeiam a colônia, ocorrendo uma zona transparente (zona de lise total) ao redor da colônia.
O ágar manitol contém alta concentração de sal, o que inibe o crescimento da maioria das bactérias, com exceção dos estafilococos. Staphylococcus aureus cresce de maneira excelente, produzindo colônias com zonas amarelas devido à fermentação do manitol, na amostra analisada houve crescimento com mudança de coloração de laranja para amarelo.
O teste da catalase ocorreu a formação de bolhas de ar, indicativo de teste positivo para catalase.
Com esses resultados, foi indicativo de Staphylococcus aureus.
Imagem 2: Meio Manitol Salgado Imagem 3: Meio Manitol Salgado(Resultado)
 
Fonte: próprio autor. Fonte: próprio autor.
PRÁTICA DE UROCULTURA
INTRODUÇÃO
Na urocultura observa-se diversas normas ou cuidados para que os resultados possam ter boa correlação com a clínica. A primeira delas é a coleta, que pode ser pelo método não invasivo ou pelo método invasivo, conforme a necessidade.
No método não invasivo, o paciente deve ser orientado para colher a primeira urina da manhã ou no mínimo após retenção vesical de 2 a 4 horas. A urina deve ser colhida em recipiente estéril após rigorosa antissepsia (asseio) da genitália com água e sabão sem outro produto que deixem resíduos. Desprezar o jato inicial (10-15ml) e colher o jato médio (JM). (CARVALHO, 2015)
No método invasivo a urina poderá ser colhida por punção suprapúbica (PSP, adequada p/anaeróbios) ou através de cateteres. Esta metodologia não é muito recomendável porque pode introduzir germes na bexiga, além de não ser bem aceita pelos pacientes e alguns médicos. CARVALHO, 2015)
A cultura de urina usando o laminocultivo é destinado ao cultivo, contagem e identificação parcial de microorganismos causadores de infecções do trato urinário, em específico a Escherichia coli. Outra utilização importante é como sistema de transporte, pois possibilita o início da cultura desde o local de coleta até o local de incubação. O preparo do paciente e da amostra é bem simples. A amostra deve ser coletada impreterivelmente antes do início de qualquer terapia antimicrobiana para que o exame tenha real significação clínica e orientar o paciente a coletar a primeira urina da manhã. Orientar sobre a assepsia dos genitais externos conforme a rotina estabelecida pelo laboratório. O primeiro jato deve ser desprezado, coletando-se o jato médio cuidando para que no momento da coleta, o paciente não toque acidentalmente nas bordas do frasco. Após a coleta, fechar o frasco e levar imediatamente ao laboratório. (LABORCLIN, 2014).
OBJETIVO
A cultura de urina ou urocultura tem como objetivo diagnosticar uma possível infecção do trato urinário (ITU).
MATERIAIS
Materiais e Equipamentos
Amostra – Urina; 
Placa de Petri com o meio de cultura ágar Cled;
Alça de Drigalski;
Bico de Bunsen.
PROCEDIMENTO
Semeadura semi-quantitativa em placa: 
Imergir alça calibrada de 0,001mL na amostra e depositar no centro do meio de cultura; 
Espalhar o material por toda a superfície do meio com o auxílio de uma alça de Drigalski;
Meio de semeadura CLED;
Realizou-se a contagem das colônias na placa e determinou-se o nº de UFC/mL da amostra.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Na contagem das colônias obteve-se 300 colônias em 10µl, fazendo o cálculo para 100µl:
300colônias - 10µl
X colônias - 100µL
X = 300 x 100/10
X = 3 x UFC/mL
De acordo com o quadro clínico do paciente, que é um paciente do sexo masculino de 62 anos de idade e usa cateter, foi diagnosticado infecção do trato urinário (ITU).
Imagem 4: Meio CLED (RESULTADO)
Fonte: próprio autor.
PRÁTICA DE COPROCULTURA
INTRODUÇÃO
Coprocultura é um exame bacteriológico das fezes, onde permite fazer a cultura de microrganismos de forma a poderem ser identificados. A metodologia tradicional para a detecção de patógenos entéricos invariavelmente emprega a combinação de meios de cultura, geralmente um meio seletivo em placa e um caldo de pré-enriquecimento. 
As doenças diarréicas continuam sendo uma freqüente causa de morte ainda nos dias atuais, especialmente em países em desenvolvimento. A incidência anual e o perfil etiológico das diarréias em diferentes populações podem variar de acordo com os diversos fatores de risco, tais como a idade muito jovem, deficiências nutricionais, higiene inadequada de alimentos e do próprio corpo, ausência de cuidados sanitários básicos, acesso a suprimentos de água contaminados e até mesmo o verão, estação do ano que sempre registra o maior número de casos de internações devido às diarréias. Nos países industrializados, a freqüência de casos de diarréia por criança é de somente 0,5 a 2 episódios/criança/ano, enquanto que em países em desenvolvimento este número pode alcançar facilmente os 10 episódios/ criança/ano. Nos países industrializados as diarréias por rotavírus predominam, enquanto que nos países em desenvolvimento as bactérias são comumente encontradas nos casos de diarreia (SOUZA, 2002).
OBJETIVOS
Isolar germes enteropatogênicos de fezes e observar as características morfológicas das colônias dos princiapais germes.
MATERIAIS
Alça de platina;
Bico de Bünsen;
Amostra;
Meio de cultura MacConkey em placa de petri;
Meio de cultura TSI em tubo; 
Meio de cultura Citrato de Simons em tubo;
Meio de cultura SIM;
Meio de cultura MIO.
PROCEDIMENTO
A amostra fornecida foi inoculada em placa de MacConkey por espalhamento, para isolamento das colônias, em tubos contendo meio SIM e meio MIO, e em tubo contendo meio CITRATO DE SIMNOS e TSI, mas nestes apenas na superfície inclinada do meio. As culturas foram incubadas, para então proceder-se a análise dos resultados, identificando a espécie bacteriana com base nas informações tabeladas fornecidas na aula prática.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Tabela 2: Resultados da aula prática
	Testes
	Resultado da Amostra
	MacConkey
	Positivo – coloração rosa
	Oxidase
	Positiva
	Meio Citrato de Simons
	Negativo - coloração verde
	Meio TSI
	Não fermentadores de carboidratos;
Produção de gás com bolhas e rompimentos;
Produção de H₂S – negativo
	Meio SIM
	Motilidade – negativa; 
Indol – positivo;
Produção de H₂S – negativo.
	Meio MIO
	Motilidade – negativa;
Indol – positivo (coloração vermelha);
Ornitina- positiva.
	O meio MacConkey, com pH neutro composto por peptona de caseína, peptona de carne, sais biliares, lactose e cloreto de sódio, permite o crescimento capazes de utilizar a lactose como única fonte disponível de carboidrato, acidificando o meio. Caso as células não sejam capazes de fermentar lactose, os aminoácidos do meio serão metabolizados e convertidos em amônia, aumentando o pH. No teste realizado, a amostra deu positivo, indicando a utilização da lactose e acidificação do meio.
O meio citrato de Simmons contém citrato de sódio como única fonte de carbono. Bactérias capazes de oxidar citrato produzem CO2, que ao reagir com o sódio forma carbonato de sódio, tornando o meio alcalino e o indicadorde coloração verde vira azul. O meio inoculado com a bactéria fornecida não apresentou alteração na cor, indicando que ela não é capaz de utilizar o citrato como fonte de carbono.
O meio TSI apresentou características não fermentadoras de carboidratos, houve a produção de gás com bolhas e rompimentos e negativo para produção de H₂S.
O meio MIO apresentou motilidade negativa, aparecimento de um anel de coloração vermelho indicando a presença do indol e negativo para produção de H₂S.
A partir dos resultados obtidos e comparando com a tabela fornecida na aula prática, foi possível determinar a espécie bacteriana, Escherichia coli.
Imagem 5: Meios de cultura Imagem 6: Indol positivo.
 
Fonte: próprio autor. Fonte: próprio autor.
 
Imagem 7: Teste da oxidase Imagem 8: Meio MIO
 
Fonte: próprio autor. Fonte: próprio autor.
Imagem 9: Meio MIO
Fonte: próprio autor.
CONCLUSÃO
Obtivemos um aprendizado em relação aos antibióticos adequados para cada bactéria, de acordo com seu grupo (ex.: Gram-negativo e Enterobactérias), que a forma de realizar o antibiograma exige um procedimento diferente do que é comumente usado para estriar e que deve-se manter a atenção e seguir todos os cuidados necessários para a realização correta do teste e obtenção de resultados confiáveis. O antibiograma facilita na investigação de antibióticos efetivos contra a proliferação de bactérias no organismo. As bactérias demonstraram alto grau de sensibilidade aos antibióticos utilizados, mas levando em conta o halo e a validade dos discos.
O experimento de coprocultura demonstrou que é possível identificar bactérias através de testes bioquímicos com uma boa precisão. A partir do perfil enzimático da colônia fornecida, comparando com dados na apostila de aulas práticas.
REFÊRENCIAS
CARVALHO, L. C. UROCULTURA - CULTURA DE URINA (UROCULTURA), publ. 2015. Disponível em: <<http://www.profluiscarloscarvalho.com.br/urocultura>>. 
LABORCLIN. Manual Urilab Trio Cromogênico, Rev. Em 2014. Disponível em: <<http://www.laborclin.com.br/produtos/500200/500215_bl.pdf >>. 
Souza EC et al. Etiologic profile of acute diarrhea in children in São Paulo. J. Pedriatr. 78:31-38, 2002.