Baixe o app para aproveitar ainda mais
Prévia do material em texto
Módulo 3 – Bioquímica - Biologia Molecular Armazenamento de informações genéticas de uma célula para outra é uma condição fundamental para a vida. Os ácidos nucléicos são importantes nesse armazenamento O DNA funciona como armazenamento e transferência de informações biológicas sendo a única função disponível dessa molécula. O RNA tem vários papéis, atuando como transportador, mensageiro, ribossomomais, RNA de transferência e catalítico, entre outros. Histórico do DNA Experimento de Griffith (1928) - bactérias são capazes de transferir informação genética através de um processo conhecido como transformação. Resumindo: As células rugosas (R) não causavam a morte do camundongo, as células lisas (S) já o levava a óbito. Quando as S foram expostas ao calor, ao ser aplicado o animal não morre, quando as células lisas mortas foram colocadas junto as células rugosas, o camundongo morre, e as células lisas sobrevivem. Griffith ainda não sabia qual molécula que fazia essa transformação de material genético. Avery, MacLeod e McCarty (1944) – A cepa / bacteria virulenta foi aquecida e passou um tratamento enzimático com protease, RNase e DNase, em seguida cada amostra é misturada com bactérias não virulentas. No frasco com protease e RNase acontecem transformações, aparecendo células novas lisas misturadas com células rugosas, não ocorre transformação no DNase, crescendo apenas células rugosas. Ou seja, a DNase degradava o DNA que passava a informação das células virulentas, por isso só restaram as células rugosas. Conclusão: O DNA é a molécula responsável pela transformação. Hershey & Chase (1952) - Bactérias marcadas com fósforo radioativo ou enxofre radioativo são infectadas por bacteriófago T2 não radioativo. Os bacteriófagos formados têm DNA radioativo e capa radioativa (Proteínas) , respectivamente fósforo e enxofre, ao final é observado que esse bacteriófagos radioativos ao transmitirem seu material genético, formaram fagos com DNA radioativo, e com a proteína radioativa não irá formar fagos marcados com radiação. Conclusão: O DNA é herdado pela progênie do fago. Gene: segmento de DNA que contém a informação necessária para a síntese de um produto biologicamente funcional, seja proteína ou RNA. Nucleotídeos -Diferentes funções no organismo: Moeda energética em reações metabólicas – ATP Respostas células a hormônios e outros estímulos extracelulares Componente estrutural de cofatores enzimáticos ou intermediários metabólicos Constituintes dos ácidos nucleicos: ácido desoxirribonucleico (DNA|) e ácido ribonucleico (RNA) Componentes da estrutura do ácido nucleico – base nitrogenada, pentose e fosfato. Observação: o nucleosídeo é a molécula sem o fosfato. A base nitrogenada é ligada covalentemente (no N-1 das pirimidinas e no N-9 das purinas) por uma ligação N-beta glicosídica ao carbono 1’ da pentose, e o fosfato liga-se ao carbono 5 da pentose por uma ligação éster Pirimidinas: citosina, timina e uracila Obs: Tem as duas nos ácidos nucleicos. Purinas: adenina e guanina Bases nitrogenadas secundárias: no DNA são mais comuns as formas metiladas, hidroximetiladas ou glicosiladas, tendo função de regulação e proteção da informação genética. No RNA, são encontradas de vários tipos, especialmente nos tRNAs. As bases nitrogenadas são básicas atuando como moléculas aromáticas, devido a ressonância das duplas ligações, se tornando plano nos casos das pirimidinas ou quase planar nas purinas. Por causa da ressonância podem ter formas tautoméricas dependendo do pH. Também tem capacidade de absorção de luz assim como os aminoácidos aromáticos, principalmente a 200 nanômetro. As bases nitrogenadas são hidrofóbicas e relativamente insolúveis em água e pH neutro, gerando uma estabilização na estrutura da molécula de DNA, pois as bases ficam empilhadas acontecendo ligações hidrofóbicas entre as moléculas e outros tipos de ligação como dipolo- dipolo e de Van der Waals. Caso aumente o pH ocorre o aumento das cargas e da solubilidade das bases nitrogenadas. São elas que fazem as ligações de hidrogênios ligando uma fita a outra fita, sendo a timina – adenina (ligações duplas) e guanina e citosina (ligações triplas). Os grupos funcionais das purinas e pirimidinas são anéis nitrogenados, grupos carbonila e grupo amino exocíclicos, os responsáveis pela formação das ligações de hidrogênios são os grupos amino e carbonila. Pentose – QUE DEFINE SE É RNA OU DNA. DNA: 2 D-desoxirribose e RNA D-ribose. A desoxirribose não tem o grupo hidroxila ligado ao carbono 2 da pentose, já na ribose está presente. Formam anel na forma de beta-furanose Purinas: C-2’ endo Pirimidinas: planar Fosfato – presente no carbono 5’na pentose, pode está em outras posições, determinando diferentes funções. ● Desoxirribonucleotídeos ( desoxirribonucleotídeo 5’-monofosfato) Ribonucleotídeos (ribonucleotídeo 5’ -monofosfato) Ligação fosfodiéster – o grupo 5’-fosfato de um nucleotídeo é ligado ao grupo 3’-hidroxila do próximo nucleotídeo. O esqueleto covalente dos ácidos nucleicos consiste em fosfato e resíduos de pentose alternados, e as bases nitrogenadas podem ser consideradas como grupos laterais ligados ao esqueleto em intervalos regulares. O esqueleto do DNA e do RNA são hidrofílicos ficam para fora. Os grupos hidroxila dos resíduos de açúcar formam ligações de hidrogênio com a água. Os grupos fosfatos, com um pKa próximo de 0, são completamente ionizados e carregados negativamente em pH 7, e as cargas negativas são, de um modo geral, neutralizadas pelas interações iônicas com cargas positivas nas ptns, nos íons metálicos e nas poliaminas. O DNA é mais estável do que o RNA, devido a ausência da hidroxila no carbono 2’. Quando exposto a condições alcalinas, o RNA é hidrolisado rapidamente, rompendo a ligação de fosfodiéster, formando como produto nucleotídeos 2’,3’- monofosfato cíclicos. Estrutura dos ácidos nucleicos Chargaff (1940) – Composição de bases no DNA varia entre as espécies, DNAs separados de diferentes tecidos de uma mesma espécie apresentam a mesma composição de bases.Não ocorre variações com a composição de bases em relação a idade, o estado nutricional e fatores ambientais. Independentemente da espécie, apresentam igual número de resíduos de nucleotídeos, ou seja, o número de guanina é igual a citosina, e o adenosina é igual ao número de timina. Dessa forma, conclui-se que a soma dos resíduos de purina é igual à soma dos resíduos de pirimidina. Rosalind Franklin e Maurice Wilking (1950) – Usaram o método eficaz da difração por raio X para analisar fibras de DNA, demonstrando um padrão característico, deduzindo que as moléculas de DNA são helicoidal com duas periodicidades, um pequeno e outro grande. Watson e Crick ( 1953) – Concluíram com as informações obtidas que o DNA seria uma molécula helicoidal , constituído por duas cadeias agrupadas em torno do mesmo eixo formando uma dupla hélice de orientação á direita, tendo um esqueleto hidrofílico de grupos fosfato e desoxirribose alternados fora dadupla-hélice, orientados para a água. As bases nitrogenadas empilhadas dentro da dupla hélice, com suas estruturas hidrofóbicas em forma de anel e quase planares muito perto uma da outra e perpendiculares ao eixo longitudinal. O pareamento perfeito das duas fitas cria um sulco maior e um sulco menor. Fitas paralelas e antiparalelas com extremidades 5’ e 3’. As fitas são complementares entre si. Em solução aquosa uma volta mede 66 Å equivalente 10,5 pares de bases. Forças importantes: ligações de hidrogênios entre as bases complementares e as interações de empilhamento de bases. Quanto mais bases Guanina e Citosina na molécula de DNA, mais separadas fico as fitas, devido às ligações triplas entre essas bases. Variação na estrutura do DNA A forma B é a mais estável das estruturas, a forma A é favorecida em soluções livre de água ( pouca água), dupla hélice à direita, mais larga e o número de bases por volto é 11. Observe na tabela abaixo as diferenças. O DNA pode ocorrer em formas tridimensionais diferentes. Extremamente flexível, rotações consideráveis em torno de vários tipos de ligações no esqueleto açúcar – fosfato e flutuação térmica pode produzir enovelamento, alongamento e desnaturação (fusão) das cadeias. Obs: Essas variações de conformação não afetam as propriedades do DNA. Refletem em 3 aspectos: As diferentes conformações possíveis da desoxirribose, a rotação em torno das ligações contíguas que constituem o esqueleto de fosfodesoxirribose e a rotação livre em torno da ligação C-1’- N-glicosídica. Devido a restrições estéricas, as purinas nos nucleotídeos púricos estão restritas as duas conformações estáveis com respeito à desoxirribose, denominadas syn e anti . As pirimidinas geralmente estão restritas à conformação anti, devido a interferência estéricas entre o açúcar e o oxigênio da carbonila no C-2 da pirimidina. Certas sequências de DNA adotam estruturais incomuns Palíndromo: palavra ou frase escrita de forma idêntica se for lida da esquerda para direita ou vice-versa, termo aplicado a regiões de DNA com repetições invertidas de sequências de base tendo simetria dupla nas duas cadeias de DNA. Tem potencial para formar estruturas cruciformes (em formato de cruz) ou em grampo. Quando a repetição invertida ocorre dentro de cada cadeia individual de DNA, a sequência é denominada repetição de imagem especular. Não tem sequência complementares e não formam grampos ou cruciformes. São regiões reconhecidas por enzimas específicas, sendo importantes na regulação e outros mecanismos. Quando se tem ligações de hidrogênio adicionais, principalmente no sulco maior, por exemplo, um par de bases pareado com um resíduo de guanina, são denominadas posições de Hoogsteen, e o pareamento do tipo não Watson-Crick é chamado de pareamento de Hoogsteen. Esse pareamento permite a formação do triplex de DNA, que são mais estáveis em pH baixo porque o trio C ≡ G . C+ requer uma citosina protonada. Acontece muito quando se tem muita pirimidina em um lado da cadeia, ou somente purinas O tetraplex G = 4 cadeias de DNA com proporção muito alta de resíduos de guanosina. Importância dessas variações de estruturas: Os palíndromos são sítios específicos que são reconhecidos por muitas enzimas ligantes de DNA, atuando no reconhecimento do DNA, e na formação do tRNA. No tetraplex G e no triplex é importante para diminuição da expressão gênica, com potencial de silenciar um gene. Propriedades químicas do DNA Temperaturas acimas de 80 grau célsius e valores de pH extremos causam desnaturação do DNA. O rompimento das ligações de H entre pares de bases e das bases empilhadas causam desenrolamento da dupla-hélice formando duas cadeias simples, podendo ser completamente separadas (desnaturação completa) uma da outra pela molécula inteira ou de parte da molécula (desnaturação parcial). Nenhuma ligação covalente no DNA é rompida. Renaturação: quando retorna a sua temperatura e pH iniciais Desnaturação parcial – 1 etapa rápida Desnaturação completa - 2 etapas, um lenta e outra rápida. Efeito hipocrômico: a renaturação e pareamento diminui a absorção de luz Efeito hipercrômico: a desnaturação aumenta a absorção de luz. Motivo: bases nitrogenadas serem aromáticas. A desnaturação depende da composição das moléculas de DNA, exemplo a C ≡ G e T-A, tendo ligações triplas vai aumentar temperatura de melting, assim gastando mais energia, ao contrário das ligações duplas. A desnaturação costuma iniciar em regiões ricas em AT Observação: Temperatura de melting – quando 50% das moléculas são enoveladas e 50% desnaturadas. Em RNA duplos as temperaturas são mais altas do que as temperaturas do DNA para iniciar uma desnaturação. São desconhecidas bases físicas para essa diferença. Hibridação do DNA A taxa de pareamento do DNA é afetada pela temperatura, pelo comprimento e pela concentração dos fragmentos de DNA a serem pareados, pela concentração de sais na mistura de reação e pelas propriedades da sua própria sequência ( complexidade e C ≡ G). Temperatura baixa: sequências curtas de moléculas de DNA com semelhanças coincidentes em partes distantes e heterólogas irão se parear improdutivamente e interferir com o alinhamento geral de cadeias complementares de DNA. Temperatura muito altas: desnaturação A maioria do reanelamento ocorre entre cadeias complementares de DNA murinho para formar duplex de DNA murinho, mas também pode ocorrer com o DNA humano. Quando juntam os dois podem formar duplex híbridos. Herança evolutiva comum facilitam a hibridização. Hibridação: duas amostras de DNA são aquecidas até desnaturar separadamente, são misturadas e resfriadas lentamente, as duas cadeias começam a se complementar e se anelam para formar o duplex. Transformações não enzimáticas Quando há um mal pareamento das bases nitrogenadas, se não ocorre o reparo pode gerar mutações. Desaminação – perda espontânea de seus grupamentos amino exocíclicos, processo lento. A desaminação da citosina a uracila pode ser o motivo da ausência de uracila no DNA, pois o organismo ativa o sistema de reparo e retira a uracila do DNA. Depurinação – purina é perdida pela hidrólise da ligação N-beta-glicosídica, formando sítio abásico ou sítio AP (sítio apurínico ou apirimidínico), essa reação acontece mais rapidamente em ácido diluído no laboratório. Luz UV - induz a condensação de dois grupos etilenos para formar um anel ciclobutano, tende a gerar dímeros pirimídicos ciclobutanos ou fotoproduto 6-4, introduz um ângulo ou dobra no DNA. [ acontece geralmente nas Timinas] Reagente químicos: agentes desaminantes - especialmente ácido nitroso (HNO2) ou compostos que podem ser metabolizados a ácido nitroso ou nitritos; Agentes alquilantes - dimetisulfato pode metilar a guanina para produzir O6 -metilguanina, a qual não pode parear com a citosina. São usados como conservantes alimentos processados evitando o crescimento de bactérias tóxicas.. Metilação do DNA -acontece com mais frequência na adenina e na citosina do que guanina e timina. Na E.coli a metilação auxilia na distinção do seu DNA do DNA exógeno por marcar seu próprio DNA com grupo metila e destruindo o exógeno sem metila ( sistema de modificações restritas) e também pode ocorrer o reparo dos pares de bases mal pareados mediado pela Dam metilase. Outras funções dos nucleotídeos: Carregadores de energia - O grupo fosfato ligado covalentemente na hidroxila 5’de um ribonucleotídeo pode ter um ou dois fosfatos adicionais ligados. Tendo nucleotídeos mono, di, trifosfatos. A hidrólise dessas moléculas geram energia química para várias reações celulares. Componentes de cofatores enzimáticos - forma coenzima A, FAD e NAD, entre outros. Eles não são estruturalmente relacionados, exceto pela presença de adenosina, em nenhum desses cofatores a adenosina faz a função principal, mas se for retirada resulta em uma redução drástica da atividade do cofator. Porque ADENOSINA ? porque ela é usada normalmente como moeda de troca para fornecer energia às reações, se fosse usar outro domínio poderia gerar mais gastos de energia, assim envolve uma forma de economia evolutiva. Moléculas reguladoras- mensageiros químicos - Atuam como segundos mensageiros dentro célula, onde recebem informações de hormônios ou sinais extracelulares, gerando a formação de AMP cíclico que transportam as informações para fora da célula. Em bactérias existe o regulador ppGpp, produzido em resposta a uma redução de velocidade da síntese proteica durante a falta de aminoácidos, esse nucleotídeo inibe a formação de RNAs transportadores e ribossomais, prevenindo a produção desnecessária desses ácidos nucleicos. Níveis de organização do cromossomo As moléculas de DNA são associadas com histonas formando nucleossomos, ‘’colar de contas’’, esses nucleossomos se reúnem formando fibras de cromatinas que se condensam formando o cromossomo. Replicação semiconservativa do DNA - síntese de duas moléculas -filhas de DNA híbridas, utilizando como molde a fita da molécula mãe. Experimento de Meselson-Stahl - 1957 Células foram cultivadas por muitas gerações em meio contendo apenas nitrogênio pesado, 15N. Depois essas células foram transferidas para um local com células contendo apenas 14N, formaram moléculas filhas de primeira geração híbridas. O DNA isolado gerou um única banda no gradiente de CsCl. No experimento seguinte, as células marcadas com nitrogênio pesado foram colocadas em um meio com nitrogênio 14 até dobrar em número. O DNA isolado desse segundo ciclo de replicação exibiu duas bandas no gradiente de densidade, um qual densidade igual aquela do DNA leve e a outra com a densidade do DNA híbrido. A replicação começa em uma origem e em geral segue bidirecionalmente. Jonh Cairns - utilizou moléculas de DNA de E.coli radioativo cultivando células em um meio contendo timidina marcada com trítio. Quando isolado foi possível observar que o DNA com um único cromossomo, dentro dela tinha uma volta adicional. Concluiu que essa volta foi crescendo ao longo do tempo formando duas moléculas de condições iniciais. Resumo: Existe uma origem, onde começa a replicação, e acontece em dois sentidos através das forquilhas de replicação que ficam nas extremidades das voltas. A síntese do DNA segue em uma direção 5’- 3’ e é semidescontínua. A fita contínua ou fita líder é aquela que a síntese 5’-3’ segue na mesma direção do movimento da forquilha de replicação. Já na fita descontínua ou retardada é aquela que a síntese 5’-3’ prossegue na direção oposta da direção do movimento da forquilha. Assim, na fita descontínua a enzima primase adiciona primers para que ocorra o início da síntese que é feita em pedaços pequenos, o fragmento de Okazaki, a ligase ligam os fragmentos deixando a fita contínua. O DNA pode ser degradados por nucleases ou DNases. Exonuclease: atuam na direção 5’-3’ ou 3’-5’ Endonuclease: reconhece sequência internas específicas de DNA, exemplo as enzimas de restrição. O DNA é sintetizado por DNA-polimerases DNA polimerase I - fornece a transferência do grupo fosforil. A hidroxila do carbono 3 ataca o fósforo alfa presente no dNMP e dNTP, formando uma ligação fosfodiéster, liberando um pirofosfato inorgânico. Essa reação envolve dois íons de Mg 2+ que estabilizam as cargas negativas. A DNApol precisa de uma fita molde e uma hidroxila livre, a primase é importante nesse processo, pois sintetiza um pequeno segmento iniciador (primer) que fornece hidroxila livre no 3’C para que ocorra a síntese pela polimerase na fita descontínua. Duas partes do sítio ativo do DNApol: sítio de inserção: onde o nucleotídeo que chega é inicialmente posicionado. Quando a ligação fosfodiéster é formada, a polimerase desliza para frente do DNA e um novo par de bases é posicionado no sítio de pós-inserção. Observação: É uma única molécula de DNA polimerase que vai sintetizar as duas fitas ( contínua e descontínua). ETAPAS DA REPLICAÇÃO DO DNA 1. Etapa de Iniciação: reconhecimento das origens de replicação por um complexo proteico; abertura localizada da dupla fita de DNA pela helicase, ou seja, sempre existe um local exato de abertura da molécula de DNA; síntese do primer (término dessa fase). 2. Etapa de elongação: ocorre a síntese continua na cadeia leading (líder) e a síntese descontínua na cadeia lagging (atrasada), pois aparentemente a síntese da fita contínua começa antes da síntese da fita descontínua. 3. Etapa de terminação: há várias sequências, chamadas de sequências ter, que são reconhecidas por proteínas Tus, que desaceleram e param a helicase. REPLICAÇÃO EM PROCARIOTO A polimerase reconhece a origem de replicação,a helicase rompe as ligações de hidrogênio fornecendo uma abertura nas fitas,ocorre adição de SSB que mantém a separação das fitas. A síntese da fita líder começa com a adição de um primer na origem de replicação pela primase (DNA G), ela interagem com a helicase (DNA B) formando um iniciador da fita líder ( dna G -dna B) que irá se mover em direção oposta. Os desoxirribonucleotídeos são adicionados a esse iniciador por um complexo DNA polimerase 3 ligado à helicase Dna B presa à fita de DNA oposta. Na fita retardada, a síntese é realizada em fragmentos de Okazaki. Os primers são adicionados (iniciador), a DNA pol 3 se liga ao iniciador e adiciona os desoxirribonucleotídeos. A helicase ligada na frente da DNA pol 3, desenrola o DNA na forquilha de replicação a medida que ela se move. Quando acaba o fragmento vem a primase novamente, e a DNApol 3 junto a braçadeira beta desliza formando mais nucleotídeos, ao finalizar o fragmento a braçadeira é deixada para trás. Após a síntese, a DNA ligase finaliza deixando a fita contínua, sem cortes, ou seja, ela forma ligações fosfodiéster entre a hidroxila 3’ de um fragmento e o 5’fosfato de outro. Terminação: tem uma sequência conhecida como Ter que funciona como sítiode ligação para a proteína Tus. Esse complexo Tus-Ter faz com que a replicação pare, a quando as duas forquilhas se encontram a replicação é parada, a topoisomerase 4 vai fazer uma quebra de uma das fitas duplas e separam os DNAs. REPLICAÇÃO EM EUCARIOTOS -Tem diversas origens de replicação; - Processo de abertura parecido com procarioto, mas tem uma proteína MCM2 que é análoga a DNA B helicase - Tem DNA polimerase: Delta : equivalente eucariótico da DNA pol III responsável pela replicação do genoma nuclear; possui atividade exonucleásica 3’ – 5’ Alfa : possui uma atividade primase Épsilon : reparação do DNA SEQUENCIAMENTO DE DNA Em 1977 Frederick Sanger fez o sequenciamento de moléculas grandes com uma certa facilidade. Sequenciamento de Sanger - Baseado nos análogos de nucleotídeos (desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo), diferença entre eles é a ausência de OH C2’ e não tem OH no C3’ no DNA, assim ele é um ddNTP. Qual a importância da utilização desse ddNTP ? é a OH livre no carbono 3’ é que vai fazer o ataque nucleofílico no fósforo alfa do trifosfato, gerando uma ligação fosfodiéster na fita crescente de DNA. Caso não tenha esse OH livre a ligação fosfodiéster não é formada e a replicação da fita de DNA fica interrompida. No laboratório podemos fazer in vitro essa replicação na ausência de OH 3’. É necessário a adição das 4 bases de DNA [ dATP, dGTP, dCTP, dTTP], primer (iniciador), DNA pol, Mg2+, condições importantes de sais. São feitos 4 tubos com essa preparação, no primeiro tubo é adicionado ddATP, no segundo ddCTP, no terceiro ddGTP e no último ddTTP. O primer é adicionado a sequência do DNA molde, a DNA polimerase começa a síntese, adicionado os nucleotídeos, quando o ddNTP é adicionado ocorre o interrompimento da síntese. As amostras são transferidas para quatro ‘’pistas’’ do gel de eletroforese, que são separados por tamanhos e tipo de nucleotídeo, o oligonucleotídeo mais curtos se movem rápido para baixo do gel. A leitura de baixo para cima fornece a sequência correta de DNA. No sequenciamento automático, as bases dos ddNTPs são marcadas com radiação, cada base tem uma cor, após a replicação e a parada de cada ponto, as amostras são desnaturadas. Em seguida são colocadas em um gel capilar, um detector vai identificar através das cores cada nucleotídeo. Muito vantajoso para moléculas grandes. Transcrição Funções do RNA - Armazenamento de informações - Catálise, tendo o RNA catalíticos ou ribossomas. Normalmente vemos a transcrição de um DNA em RNA, mas não podemos esquecer dos vírus que fazem a replicação do seu próprio DNA, ou seja, às vezes a informação que vem do DNA pode está contida nela mesmo, e não no RNA. A transcrição pode variar muito, tem genes que é transcrito a qualquer momento, a todo momento, outros que nunca são transcritos, pode variar de acordo com a natureza. Inicialmente o gene era considerado como uma porção que determinava o genótipo, depois acreditaram que era um material genético que formava uma enzima, mas nem todos geravam uma enzima. Posteriormente, observaram que ao ser traduzido se transformava em um polipeptídeo, uma proteína que não era um enzima. Atualmente a definição de genes é mais ampla, e é relacionada com qualquer porção do DNA que codifica uma sequência primária que é um produto do genes, que pode ser um polipeptídeo, proteína, enzima ou não, e um RNA que exerce sua função. O gene estruturalmente vai englobar um região regulatória, a parte de fato que vai ser traduzida e uma região de terminação de transcrição. Transcriptoma celular: todos os tipos de RNAs que são produzidas na célula. A maior parte do genoma de seres humano e mamíferos é transcrita em RNA, mas as formas predominantes de RNA transcrito não são aqueles três conhecidos (RNAs mensageiro,transportador e ribossômico), e sim RNA especiais, os microRNA, pequenos RNAS nucleares, as funções dos mesmos ainda está sendo descobertas. Tipos de RNA: Mensageiro: que atua na transcrição do código genético para ser traduzido na forma de polipeptídeos. Transportador: faz a ligação do anticódon com o RNA mensageiro, levando o aminoácido para síntese protéica. Ribossomais: montam a maquinaria para que a síntese de ptn ocorra. TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS RNA mensageiro policistrónico ( quando se tem um promotor e uma sequência de terminação e vários genes ou código para cadeia polipeptídicas independentes) ou monocistrónico (apenas um código para a cadeia polipeptídica, sem controlado por um promotor) O tamanho RNAm vai depende da cadeia polipeptídica. Uma trinca de nucleotídeo, o códon gera um aminoácido. Apesar de o RNA ser uma fita simples, ele pode parear, tendo uma forma helicoidal, assim como o DNA, pode ter a forma A, B e Z. Normalmente encontramos a forma A. A estrutura secundária do RNA é bem complexa, com presença de loop, grampos . O pareamento de RNA não segue o padrão do DNA, o modelo de Watson e Crick, ele pode fazer outros pareamentos. A estrutura é estabilizada pelo ligamento das bases por ligações de hidrogênio, o RNA pode ter estrutura tridimensional por exemplo, o RNA transportador. A síntese de RNA tem similaridade e diferença com a do DNA. - tem a ligação fosfodiéster - a síntese é feito na direção 5’ -3’ - precisa de apenas um fita de molde - dividida em três etapas: iniciação, alongamento e terminação. - Não precisa de um primer, nem de uma OH 3’ livre Em 1960 descobriu a RNA polimerase que depende do DNA, e de todos os 4 ribonucleosídeos 5’-trifosfatos (ATP, GTP, CTP E UTP) como precursores das unidades de nucleotídeos de RNA, bem como de Mg2+. A RNA pol alonga a fita de RNA ao adicionar unidades de ribonucleotídeos à extremidade hidroxila 3’, construindo o RNA na direção 5’-3’. O grupo hidroxila 3’ atua como nucleófilo, atacando o alfa fosfato do ribonucleosídeo trifosfato que chega e liberando o pirofosfato. A fita de DNA é copiada na direção 3’-5’ (antiparalela à nova fita de RNA), exatamente como na replicação do DNA. A RNA pol se liga ao promotor do DNA para iniciar a síntese. O duplex de DNA é desenrolado em um pequeno trecho formando uma bolha de transcrição permitindo que a RNA pol sintetize uma fita de RNA complementar a umas das fitas de DNA. Fita molde - a fita do DNA que é transcrita Fita não molde/ codificadora - é idêntica ao RNA formado, com U no lugar do T no DNA. RNA polimerase de E.coli é constituída de duas subunidades alfa, duas betas, uma beta e outra beta’ e um sexta subunidade, de um grupo denominado ômega, também tem um subunidade sigma que é importante para o reconhecimento do promotor. O sistema de revisão da RNA pol não é tão eficiente como o da DNApol, o pirofosfato não clivada no primeiro nucleotídeo é utilizado para o reparo de mal pareamento . A iniciação - começa nos promotores, em E.coli essa região é localizada entre par de base - 70e 30 ,antes do primeiro nucleotídeo que vai ser transcrito. Tem a região -10 e -35 que são sítios de interações importantes para o reconhecimento da subunidade sigma 70, sequência de consenso na região -10 é (5’) TATAAT(3’) na região -35 é (5’) TTGACA (3’). Existe um outro elemento de reconhecimento rico em AT, chamado de UP, ocorre entre as posições -40 e -60 nos promotores de certos genes altamente expressos. Esse elemento é ligado pela subunidade alfa da RNApol. A eficiência da RNA pol vai depender da sequência das regiões promotoras, os espaços entre elas e pela distância do sítio de início de transcrição. A iniciação é dividida em duas etapas 1) a subunidade sigma se liga a região promotora, tem um complexo fechado (em que o DNA ligado é intacto) e um aberto ( em que o DNA ligado está intacto e parcialmente desenrolado próximo da sequência -10) se formam em sucessão. 2) iniciada no interior do complexo, levando uma mudança conformacional que converte o complexo na forma de alongamento, seguida pelo movimento do complexo de transcrição para longe do promotor. A transcrição começa, a remoção do promotor é seguida de alongamento, ao se dissociar um ptn NusA se liga nesse local, atuando na estabilização do complexo durante o alongamento. Quando a transcrição termina a NusA se dissocia e a RNApol é reciclada. Existem várias subunidades sigmas, a 70 está envolvida com proteínas responsáveis pela manutenção celular, por isso ela tem que se liga facilmente a região promotora porque as proteínas são bastante expressadas, tendo um Kd baixo, constante de dissociação. Existem muitas dessas subunidades nas células para ter alta taxa de transcrição. Temos os promotores dos genes de choque térmico, que é utilizado quando a célula recebe ameaças, como o aumento repentino de temperatura. Quando tem o estresse térmico a subunidade sigma 70 é trocada pela subunidade sigma 32, assim a RNA polimerase se liga ao promotor. REGULAÇÃO Ocorre em qualquer etapa da transcrição, incluindo alongamento e terminação. Boa parte da regulação está direcionada para a ligação da RNA polimerase e etapas da iniciação da transcrição. A diferença nas sequências de promotores são apenas um dos vários níveis de controle. A ligação de proteínas a sequências tanto próximas quanto distantes do promotor também pode afetar a expressão gênica. A ligação de ptns pode ativar ou reprimir a transcrição. Na E.coli uma ptn ativadora é a receptora cAMP ( CRP) que aumenta a transcrição de genes que codificam enzimas que metabolizam outros açúcares além da glicose quando as células crescem na ausência da mesma. Repressores: ptn que bloqueiam a síntese do RNA em genes específicos. No repressor Lac, a transcrição dos genes para as enzimas do metabolismo da lactose é bloqueada quando a lactose está indisponível. Terminação da síntese de RNA Sequência na fita de DNA sinaliza uma pausa na síntese de RNA, a E.coli tem duas classes de sinais de terminação Independentes de rho - uma região que produz um transcrito de RNA com sequências autocomplementares rica em GC e AT, permitindo a formação de um estrutura em grampo, outra característica é um filamento com três resíduos U próximo da extremidade 3’do grampo. Dependentes de rho - tem uma sequência curta rica em CA que cria um grampo. 3 TIPOS DE RNA POLIMERASE NUCLEARES EM EUCARIOTOS Todos os três tipos de RNA polimerases agem do mesmo modo que a RNA polimerase dos procariontes. RNA polimerase I - responsável pela síntese de apenas um tipo de RNA pré ribossomal (ou pré-rRNA), que contém precursor dos rRNA 18S, 5,8S e 28S. Os promotores da Pol I são diferentes de uma espécie para a outra. RNA polimerase II - tem uma sequência, o TATA box de bases -30 e uma seq Inr (iniciador) próxima do sítio de início do RNA em +1. Presente em minoria. RNA polimerase III - produz tRNA, o rRNA 5S e alguns RNA pequenos especializados. A RNApol II precisa de muitos outros fatores protéicos para a sua atividade. Tem 12 subunidades, a maior (RBP1) apresenta um alto grau de homologia com a subunidade beta’ da RNApol bacteriana. Outra subunidade (RBP2) é estruturalmente semelhante à subunidade bacteriana beta, e duas outras (RBP3 e RBP11) exibem algum grau de homologia estrutural em relação às duas subunidades alfa bacteriana. Tem uma longa cauda de carboxila terminal consistindo em várias repetições de uma sequência - YSPTSPS-. A complexidade dessa polimerase está associada aos fatores de transcrição. Iniciação em eucariotos - Não é simplesmente a interação da RNA pol, existem diversos fatores que vão ser importante para que haja a formação do complexo de transcrição do RNA. O alongamento das fitas de DNA pela RNApol tanto em bactérias quanto em eucariontes é inibido pelo antibiótico actinomocina D, se insere em sequência de pares de bases G-C sucessivos, deformando o DNA que impede o movimento da polimerase. A acridina inibe a síntese de RNA de modo semelhante. A rifampicina inibe a síntese bacteriana de RNA ao se ligar à subunidade beta das RNApol bacterianas, impedindo a etapa da transcrição de distanciamento do promotor. Alfa amanitina interrompe a formação de RNA mensageiro nas células animais ao bloquear a Pol II, altas concentrações a Pol III. PROCESSAMENTO DE RNA Acontece em praticamente todos os eucariontes, e algumas moléculas de RNA de bactérias. Transcrito primário - molécula de RNA recém sintetizada. RNA MENSAGEIRO - EUCARIONTES 5’ quepe - um resíduo de 7-metilguanosina ligado ao resíduo de terminal 5’do mRNA por uma rara ligação trifosfato 5’,5’-trifosfato. Função: protege o mRNA das ribonucleases, importante para iniciar a tradução, pois atua no reconhecimento. Obs: Pode ocorrer a metilação das primeiras bases, uma enzima sintetizadora do quepe vai se liga a porção terminal da polimerase II que reconhece a extremidade 5’ do mRNA, faz a reação de ligação da 7-metilguanosina , a enzima sintetizadora é liberada e uma outra ptn, CTD se liga garantindo o processamento do mRNA. O RNA catalisa o splicing de íntrons 4 tipos de íntrons: I e II não precisam de enzimas, são autosplicing, não tem a necessidade de cofator de alta energia (ATP) para o splicing . No grupo I precisa de um nucleosídeo guanina ou de um cofator nucleotídeo, o grupo ‘3 da OH da guanina é usado como um nucleófilo, formando um ligação 3’,5’ - fosfodiéster normal com a extremidade 5’ do íntron. A OH 3’ do éxon que é deslocada nessa etapa age então como um nucleófilo em uma reação semelhante na extremidade 3’ do íntron. O resultado é a remoção precisa do íntron e ligação dos éxons. Na classe II, o padrão de reação é o semelhante exceto pelo nucleófilo na primeira etapa, que nesse caso é o grupo 2’ OH. Íntronsdo spliceossomo - a remoção é catalisada por um grande complexo proteico, spliceossomo, ocorre no seu interior. Classe III Spliceossomo é constituído por complexo de RNA-proteínas especializados, pequenas ribonucleoproteínas nucleares (snRNP) onde tem os 5 tipos snRNA (U1,U2,,U4,U5,U6) que tem a capacidade de reconhecimento da sequência de íntrons indicando para as ptns, o U1 se liga e parea com 5’ éxons e início do intron. OBSERVAÇÃO: o splicing não precisa da ATP, somente a montagem do spliceossomo que necessita do ATP. Classe IV - encontrada em certos tRNA, precisa de ATP e de uma endonuclease. A endonuclease de splicing cliva as ligações fosfodiéster em ambas as extremidades do íntron, e os dois éxons são ligados por um mecanismo semelhante à reação de DNA-ligase. Adição da cauda poli (A) - atua como sítio de ligação para ptns específicas e ajuda na proteção contra a destruição enzimática do mRNA ( eucariotos), em bactérias essa cauda estimula a destruição do mRNA. O transcrito é clivado no local onde ocorrerá a adição da cauda por um componente de endonuclease de um grande complexo enzimática associado ao CTD da RNA pol II. O local é marcado por dois elementos de sequência: um altamente conservada (5’) AAUAAA(3’), de 10 a 30 nucleotídeos no lado 5’do sítio de clivagem, e uma sequência menos bem definida rica em resíduos de G e U, de 20 a 40 nucleotídeos abaixo do local da clivagem. A clivagem gera um grupo livre 3’-hidroxila, onde serão adicionados pela polimerase poliadenilada os resíduos de A. Quando o transcrito primário passa por todo os processamentos - adição do quepe 5’, da cauda poliA e remoção dos íntrons, o mRNA já está madura. O processamento gera uma variabilidade na molécula de mRNA, dependendo do tipo de processamento que ele tiver. Ou seja, é o processamento que forma diferentes mRNA maduros que é determinado por diferentes fatores de processamento, que sinalizam o tipo de processamento necessário. Outros tipos de processamento: Escolha do sítio de poli A não é necessariamente no mesmo ponto, por exemplo o transcrito tem uma região A1 e A2, se for adicionada a cauda na região A2 o RNA vai ter mais informações genéticas, tendo diferença daquele que se ligou a região A1. Ex: diversidade nos domínios variáveis das cadeias pesadas da imunoglobulina. Temos também o splicing alternativos (mosca-da-frutas) que ocorre clivagem em duas regiões formando duas proteínas,na tradução. RNA ribossomais e tRNAs também sofrem processamento pode ocorrer por modificações pós transcricionais, desaminação, adição de metilas, as modificações das bases são importantes para que eles exerçam suas funções dando especificidade a cada um desses tipos de RNA. O processamento dos transcritos de pré-rRNA em bactérias: - Antes da clivagem, o precursor de RNA 30S é metilado em bases específica e sofre outras modificações. - A clivagem ocorre por endonuclease e exonuclease libera precursores de rRNAs e tRNAS. - Os produtos finais rRNA 16S, 23S e 5S. - rRNA maduros Observação: acontece o mesmo em eucariotos, mas em compartimentos diferentes (núcleo, nucléolo, citoplasma). Processamento dos transcritos de pré-rRNA em eucariontes - RNA nucleolares pequenos, ou snoRNA reconhecem sequências do rRNA promovem modificações nas bases, - o snoRNA se associa às proteínas,formando um complexo snoRNP que vão fazer pareamento com sequências específicas do rRNA para que ocorram as clivagens iniciais, formando pré 40S e pré-60S, - Após algumas clivagens adicionais (exonuclease) as subunidades ribossomais maduras são formadas no citoplasma. Processamento dos RNAs transportadores - corte da extremidade da 5’ -3’ por molécula de RNase P (5’) e RNase D (3’) ( RNA catalítica) - adição de uma trinca CCA na posição 3’OH, importante na ligação do aminoácido durante a tradução - a adição é feita pela nucleotidiltransferase do tRNA, não dependendo de um molde de DNA ou RNA - modificações das bases (metilação,desaminação ou redução) - splicing em eucariotos, remoção introns de 14 nucleotídeos. Todos os RNAs são processados!!! Ribozimas: são RNA catalíticos. Exemplos: - íntrons do grupo 1 que sofre autosplicing - RNase P que faz degradação da extremidade 5’ no processamento de tRNA - ribozima cabeça de martelo São bastante parecidas com as enzimas, em relação a sua especificidade, atividade de ativação e normalmente catalisam transesterificação e hidrólise da ligação fosfodiéster.Podem ser inativadas através de alguns mecanismo. A quantidade de mRNA em uma célula é importante para a regulação de uma expressão gênica. Exemplo, precisa de uma proteína em grande quantidade, a taxa de degradação será baixa em relação a taxa de síntese. Se quer manter as taxas, tem que ser iguais, ou diminuir a quantidade de proteína é aumentar a quantidade de mRNA. A degradação pode ser feita na E,coli por endonuclease e exonuclease 5’-3’, em eucariotos inferiores acontece o encurtamento da cauda poli (A), remoção da 5’ quepe, tendo degradação no sentido 5’-3’, em eucariotos superiores existe uma maquinaria responsável por essa degradação que é o exossomo, começando pela extremidade 3’ de rRNA, tRNA e mRNA. A enzima polinucleotídeo-fosforilase forma reversivelmente polímeros semelhantes ao RNA a partir de ribonucleosídeos 5’-difosfato, adicionando ou removendo ribonucleotídeos na extremidade 3’-hidroxila do polímero. RNA não dependente do molde do DNA Regulação da expressão gênica A concentração celular de um proteína é determinada pelo equilíbrio delicado de ao menos sete processos, cada um tendo vários pontos de regulação potenciais. 1. Síntese do transcrito de RNA primário (transcrição) 2. Modificação pós transcricional do mRNA 3. Degradação do RNA mensageiro 4. Síntese proteica (tradução) 5. Modificação pós traducional da ptns 6. Direcionamento e transporte de ptns 7. Degradação de ptns Genes constitutivos: produtos necessários em todos os momentos na célula, os que geram as enzimas. A expressão desses genes é chamada de expressão do gene constitutivo. Expressão gênica regulada: produtos gênicos que podem aumentar ou diminuir em resposta a sinais moleculares. Produtos gênicos que aumentam de concentração - induzíveis, o processo de aumentar sua expressão é a indução. Produtos gênicos que diminuam em concentração são repressíveis, e o processo é repressão. A RNA-polimerase se liga ao DNA nos promotores A regulação da iniciação da transcrição envolve alterações em como a RNApol interage com um promotor. A região promotora geralmente está próxima a sequência onde a RNA polimerase vai se ligar, e se estiver distante vai gerar uma diminuição na afinidade de ligação das RNA pol ao promotor, assim afetando a frequência de iniciação da transcrição. Três tipos de proteínas regulam a iniciação da transcrição pela RNA pol: Fatores de especificidade ( subunidade sigma): alteram a especificidade da RNA-pol para um determinado promotor ou conjuntos de promotores.Repressores: impedem o acesso da RNApol ao promotor. Ativadores: estimulam a interação RNApol-promotor. Fatores de especificidade - procariotos - A subunidade sigma da RNA pol que controla o reconhecimento e a ligação do promotor. Eucariotos - proteína de ligação TATA (TBP) pode ser considerada como fator de especificidade. Repressores (procariotos)- Se ligam ao sítio específico de DNA, operadores, geralmente próximo de um promotor ou dentro. A ligação da RNA-pol ou o seu movimento ao longo do DNA após sua ligação a ele (operador), é bloqueada quando o repressor está presente. Exemplo de repressor ligado (Regulação negativa). Alguns casos, o repressor está inativo e a molécula sinalizadora leva o repressor a se ligar ao operador. Ativadores - se ligam ao DNA e estimulam a atividade da RNApol em um promotor,trata-se de uma regulação positiva. Em eucariotos, a distância entre os sítios de ligação de ativadores ou repressores e promotores é superada fazendo alças (looping) no DNA entre eles. O processo de looping é facilitado em alguns casos por proteínas chamadas de reguladores arquitetônicos que se ligam a sítios de intervenção e facilitam o looping do DNA. Tem uma interação entre ativadores e a RNApol no promotor que é mediada por coativadores. Esses reguladores facilitam o contato dos ativadores, com o coativador e a RNApol II. Proteínas regulatórias têm domínios separados de ligação de DNA Ptns regulatórias geralmente se ligam a sequências de DNA específicas de ativação ou repressão da região promotora através da disponibilidade de sítios de ligações de hidrogênios que são distintos dependendo dos 4 tipos de bases complementares. Elas normalmente se ligam ao sulco maior, mas também é possível no sulco menor. São as cadeias laterais de aminoácidos das ptns regulatórias que se ligam aos pares de bases por meio de ligações de hidrogênios. Arg (citosina e guanina) e Asp (timina- adenina) . Outras possibilidade do reconhecimento das proteínas regulatória seria os palíndromos, que podem formar certas estruturas na fita de DNA, como grampos entre outros que são reconhecidas pelas ptns regulatórias. Motivos de ligação do DNA: Hélice-volta-hélice - uma volta beta entre dois segmentos helicoidais, um segmento é de reconhecimento da sequência de DNA. Dedo de zinco - uma alça alongada que é estabilizada por um único Zn2+ que é coordenado por 4 Cys, ou dois Cys e dois His. São encontrados vários desses motivos na ptn. Não é comum em bactérias. Domínios de interação proteína-proteína Motivos estruturais: Zíper de leucina - é uma alfa hélice anfipática com uma série de resíduos de aas hidrofóbicos concentrados de um lado, com a superfície hidrofóbica formando a área de contato entre os dois polipeptídios de um dímero. A cada sete posições ocorre resíduos de leucina lado a lado. Hélice-alça-hélice básica- duas alfa hélices anfipáticas ligadas por uma alça de comprimento variável, esse motivo é importante para interação com o DNA, fazendo o reconhecimento da sequência, e também na formação de dímeros. Muitos genes bacterianos são reunidos e regulados em óperons Óperons- grupo de genes e o promotor, acrescido de sequências adicionais que funcionam juntas na regulação. São comuns óperons com dois a seis genes transcritos, alguns contém 20 ou mais genes e são regulados por um promotor. Óperon lac - dois genes envolvidos no metabolismo da lactose, os beta-galactosidase , que quebra a lactose em galactose e glicose e/ou a polimerização da lactose em alolactose, e os da galactosídeo-permease (lactose permease) que transporta lactose para o interior da célula. REGULAÇÃO NEGATIVA DO ÓPERON LAC O óperon lac tem 3 genes que codificam a expressão de três proteínas, beta-galactosidase (Z), galactosídeo-permease (Y), e o tiogalactosídeo-transacetilase (A). O gene lac A é responsável por modificar os galactosídeos tóxicos para facilitar sua remoção da célula. Na ausência de lactose, os genes lac óperon são reprimidos. Mutações no operador ou em outro gene, o gene I, resultam na síntese constitutiva de produtos gênicos. O gene I é o repressor lac, o operador que ele se liga é adjacente ao sítio de início da transcrição. O repressor lac é transcrito a partir do seu próprio promotor, independente dos genes óperon lac. Ele tem dois sítios de ligação secundário para o repressor Lac [operador] O promotor (Pi) fica separado do repressor Lac, quando o repressor é expresso ele se liga ao operador O3 e O1 na região promotora dos outros genes do óperon Lac, ele também pode se ligar a outros operadores como o O 1 E O2 , como mostrar no desenho ao lado. É formado uma alça no DNA que impede a transcrição pela RNA-polimerase. O repressor ele pode ser desligado, se acontecer isso a lactose vai pode entrar na célula, ela se liga ao repressor gerando uma modificação nele que se solta da região operadora. Assim há maior chances da expressão do óperon Lac, quem faz a dissociação do repressor com a região operadora é a alolactose. [ EXEMPLO DE REPRESSOR INATIVO] REGULAÇÃO POSITIVA DO ÓPERON LAC A fonte primária de energia não é a lactose, sim a GLICOSE, mesmo que tenha lactose no meio, a bactéria vai preferir a glicose, porque ela já vai ter os genes de utilização da metabolização da glicose construtivo, que são sempre expresso. Caso ela escolha a glicose terá que metabolizar os genes do óperon lac, isso só ocorre na AUSÊNCIA de glicose. Glicose em altas concentrações, tem muitas moléculas de ATP, mas quando está em baixa quantidade, esse ATP é consumido ocorrendo desfosforilação, se tornando AMP que se transforma em AMP cíclico (cAMP) que atua como coativador da RNA-polimerase. A proteína receptora de cAMP ou CRP é uma ptn ativadora do óperon Lac Quando a lactose está AUSENTE, o repressor se liga ao operador e impede a transcrição dos genes lac. Não importa se a glicose está ausente ou presente. Se a lactose estiver presente, o repressor se dissocia do operador. Mesmo se a glicose e a lactose estiverem disponíveis, mas a quantidade de cAMP estiver baixa não ocorre a formação do CRP-cAMP, a RNA pol pode até iniciar a transcrição, resultando em um baixo nível de expressão gênica. Quando a lactose está presente e tem baixo nível de glicose, o nível de cAMP aumenta, formando o complexo CRP-cAMP que facilita a ligação da RNA pol, resultando no alto nível de expressão gênica. O CRP-cAMP é um regulon, pois regula vários óperons. ÓPERON DO TRIPTOFANO Existem diversos genes que são importantes na síntese de triptofano na célula de bactérias. Tem dois tipos de regulação, uma negativa e outra positiva A regulação negativa é semelhante, mas o oposto a do óperon lac. Existe um repressor do óperon do triptofano que é capaz de se ligar a triptofanos livres na célula, quando ocorre essa ligação o repressor muda sua conformação e podese ligar a região operadora, bloqueando a transcrição do óperon do triptofano. Ou seja, se já tem triptofano suficiente na célula não é necessário iniciar a síntese de mais triptofano. Atenuação da transcrição - o mRNA que transcreve o óperon do triptofano logo no início tem uma região chamada de peptídeo líder onde tem quatro sequências bem conservadas. Na sequência 1 tem um códon que traduz Metionina (onde começa a tradução), nessa sequência tem dois triptofano seguidos. A sequência 3 pode parear com a sequência 2 e/ou a 4. O determina esse pareamento é a presença em altas ou baixas concentrações de triptofano. Em altas concentrações, aumenta a concentração de tRNA de triptofano, o ribossomo rapidamente traduz a sequência 1 e bloqueia a sequência 2 antes da sequência 3 ser transcrita. A transcrição contínua leva à atenuação na estrutura atenuadora semelhante a um terminador formada pela sequências 3 e 4 rica em Guanina e Citosina seguida de Uracilas (gera uma desestabilização, onde o RNApol e mRNA se dissociam). Em baixas concentrações de triptofano, o ribossomo pausa nos códons Trp na sequência 1. A formação da estrutura pareada entre as sequências 2 e 3 impede a atenuação,pois a sequência não está mais disponível para formar a estrutura do atenuador com a sequência 4. Não impede a transcrição a estrutura 2:3, ao contrário da 3:4. TRADUÇÃO Propriedades-chave do código genético - um códon é um triplete de nucleotídeos que codifica um aminoácido específico, - a fase de leitura é sucessiva e sem sobreposição ( na maior partes dos casos) - sequência de DNA fita simples ou mRNA tem três fases de leitura possíveis - cada códon codifica um tipo de aminoácido que direciona a síntese de proteínas específicas São 64 códons possíveis, 61 codificam aminoácidos e 3 códons sinalizam a parada.Pode ter vários códons para um aminoácido. A fase de leitura começa quando a tradução de uma molécula de mRNA é iniciada, sendo mantida pela maquinaria de síntese que vai lendo a mensagem sequencialmente, de um códon para outro. Se algum nucleotídeo for pulado, todos os códons subsequentes ficarão fora de registro, resultando em uma proteína ‘errada’’ com seq de aas distorcida. Para iniciar a tradução é necessário o códon de iniciação AUG que codifica a Metionina. Os códons de paradas ( UAA,UAG e UGA) determina o término da tradução. Fase de leitura aberta (ORF) - fase de leitura sem códon de parada. Degeneração do código genético - quando uma aminoácido pode ser codificado por mais de um códon, essa degeneração não é uniforme, alguns aas são codificados por até 6 códons, outros por até 4 ou 3. Esses códons são idênticos em todas as espécies mostrando um ancestral comum na escala evolutiva. Um códon não pode sintetizar dois aminoácidos diferentes. O pareamento entre o códon e anticódon - o alinhamento entre os dois RNAs é antiparalelo, 3 pareamentos diferentes são feitos quando o anticódon do tRNA contém inosinato. Hipótese da oscilação 1. As duas primeiras bases de um códon no mRNA sempre estabelecem pareamentos fortes de bases do tipo watson Crick co as bases correspondentes no anticódon do tRNA e conferem a maior parte da especificidade do código. 2. A primeira base do anticódon (lendo na direção 5’-3’, essa base pareia com a terceira base do códon) determina o número de códons reconhecidos pelo tRNA. Quando a base do anticódon é C ou A, o pareamento de base é específico, e apenas um códon é reconhecido por aquele tRNA. Quando o primeiro base é U ou G, a ligação é menos específica, e dois códons diferentes podem ser ligados.Quando inosina (I) é o primeiro nucleotídeo (oscilante) de um anticódon, três códons diferentes podem ser reconhecidos - o número máximo para qualquer tRNA. 3. Quando um aminoácido é especificado por diversos códons diferentes, os códons que diferem em uma das duas primeiras bases requerem tRNAs diferentes. 4. Um mínimo de 32 tRNAs são necessários para traduzir todos os 61 códons (31 para codificar os aminoácidos e 1 para o início da tradução). A base oscilante (ou terceira base) do códon contribui para a especificidade, como pareia de forma frouxa, ela permite uma dissociação rápida entre tRNA e seu códon durante a síntese. Se todas as 3 bases tivessem fortes pareamentos, a dissociação seria muito lenta, limitando a velocidade da síntese. Mutações sem sentido - um novo par de bases substitui outro. São mutações silenciosas, nas quais os nucleotídeos são diferentes, mas o aa codificado permanece o mesmo. Mutação de transição - uma purina ou pirimidina é substituída por outra purina ou pirimidina.Ex: G-C substituído por A-T. As mudanças geralmente são pequenas nessa proteína codificada. Modificação da fase de leitura Não existe mudança de fase de leitura na tradução, quando estabelecido o quadro de leitura os códons são traduzidos sem haver sobreposição. No entanto, às vezes pode acontecer modificações que são importante para variedade de proteínas. Genes sobrepostos gag e pol do vírus do sarcoma de Rous - o mRNA do vírus é lido pelo ribossomo que não para no códon de parada, pois pula um nucleotídeo e muda a leitura do mRNA, assim é produzido duas proteína gag e pol ( transcriptase reversa do vírus) que ficam unidas e depois não separadas por um enzima. Edição do RNA : envolver a adição, deleção ou alteração de nucleotídeos no RNA afetando o transcrito traduzido. Ex: citocromo-oxidase das mitocôndrias de trypanosoma brucei - inserção de 4 resíduos de U produz um quadro de leitura revisada. Uma classe de RNA guias complementares ao produto editado, agem como molde para o processo de edição. O pareamento não é do tipo Watson-Crick. Outras modificações é a desaminação da adenosina formando inosina, em citidina é formado a uracila. A tradução de Apoliproteínas B de tamanhos diferentes no fígado e no intestino são codificadas pelo mesmo mRNA produzido a partir do gene da apoB-100, quando uma citidina-desaminase APOBEC do intestino liga-se ao códon CAA (Gln) do mRNA, ela converte o C em U, formando UAA (códon de parada). Ou seja, no fígado a ptn é toda traduzida, no intestino a tradução é parada antes formando a apoB-48. SÍNTESE PROTEICA Ribossomo formado de proteínas e rRNAs. Bactérias 70S ( 30S e 50S); eucariotos 80S (60S e 40S) complexo RNA transportador formado por 73 -93 resíduos nucleotídeos folha - de- trevo com 4 braços, o do anticódon, D, do aminoácido e braço T/C. CINCO ESTÁGIOS Estágio 1 - ativação de aminoácidos ( citosol) O grupamento carboxil de cada aminoácido é ativado para facilitar a formação da ligação peptídica e um elo deve ser estabelecido entre cada novo aa e a informação contida no mRNA que o codifica. Essa ligação covalente dos aas em cada tRNA específico gasta ATP, utilizando enzimas ativadorasdependentes de Mg2+, conhecidas como aminoacil-tRNA-sintases. Estágio 2 - Iniciação O mRNA se liga à subunidade menor do ribossomo e ao aminoacil-tRNA iniciador, depois a subunidade maior se liga formando um complexo de iniciação. O aminoacil-tRNA estabelece um pareamento de bases com o códon AUG do mRNA, que sinaliza o começo do polipeptídeo. Processo requer GTP promovido por fatores de iniciação. Estágio 3 - Alongamento O polipeptídeo nascente é alongado pela adição de unidades sucessivas de aminoácidos, as quais são ligadas covalentemente após serem levadas até o ribossomo e posicionadas corretamente pelo respectivo tRNA, o qual, por sua vez, realiza um pareamento de bases com o códon correspondente no mRNA. O alongamento requer proteínas citosólicas conhecidas como fatores de alongamento. A ligação de cada aminoacil-tRNA que entra e o movimento do ribossomo ao longo do mRNA são facilitados pela hidrólise de GTP à medida que cada resíduo é adicionado ao polipeptídeo nascente. Estágio 4: Terminação e reciclagem do ribossomo A conclusão da cadeia polipeptídica é sinalizada por um códon de parada no mRNA. O novo polipeptídeo é liberado do ribossomo, auxiliado por proteínas denominadas fatores de liberação, e o ribossomo é reciclado para um novo ciclo de síntese. Estágio 5: Enovelamento e processamento pós-traducional Para que possa atingir sua forma biologicamente ativa, o novo polipeptídeo precisa dobrar-se em sua conformação tridimensional apropriada. Antes ou depois de dobrar-se, o novo polipeptídeo pode sofrer processamento enzimático, incluindo remoção de um ou mais aminoácidos (geralmente da extremidade aminoterminal); adição de grupamentos acetil, fosforil, metil, carboxil, ou outros grupos a certos resíduos de aminoácidos; clivagem proteolítica, e/ou ligação de oligossacarídeos ou grupos prostéticos. Aminoacilação do tRNA pelas aminoacil-tRNA-sintases - Etapa 1 -formação de um intermediário ligado à enzima, o aminoacil-adenilato (aminoacil-AMP) Etapa 2 - o grupo aminoacila é transferido do aminoacil-AMP ligado à enzima para o seu tRNA específico. Ligação éster entre o aa e o tRNA Edição pelas aminoacil-tRNA- sintases Quantidade de energia de ligação disponível entre a enzima e o substrato - Ex: A valina é parecida com a Isoleucina, no entanto a interação que cada um tem com a enzima é diferente, devido a presença de um grupo de metileno no Ile. A quantidade de energia de ligação é um mecanismo de edição, pois possibilita o reconhecimento feito pela enzima do substrato correto, como o Ile tem o grupo de metileno ocorre a intensificação da ligação com o substrato, formando Ile-AMP ( intermediário). Sítio de edição - que é separado do sítio de ligação do aminoácido ao tRNA, não é mais considerado a disponibilidade de fazer a interação, mas o tamanho do aminoácido. A valina que é pequena acaba entrando no sítio hidrolítico, onde é hidrolisada e não completa a primeira etapa (formação do intermediário). Também pode ocorrer a hidrólise da ligação do éster entre aminoácidos e tRNA nos aminoacil-tRNA, essa hidrólise é bem acelerada em tRNA carregados incorretamente. Interação entre uma aminoacil-tRNA-sintase e um tRNA O reconhecimento do tRNA pelo aminoacil-tRNA ocorre pela a presença de pontos específicos e da estrutura de enovelamento tridimensional do tRNA. Os pontos e a estrutura são diferentes para cada tipo de tRNA. Alguns casos apenas uma base é responsável pelo reconhecimento. Códon de iniciação AUG - existem dois tRNA de metionina Em Procariotos têm um tRNA metionina e um tRNA metionina formilada. A Met-tRNA sintase reconhece os dois tRNA apesar de seres diferentes. O aminoácido incorporado em resposta ao códon de iniciação é o formilado, que impede a ligação do tRNA em outros códons. Em eucariontes, o tRNA que inicia é a metionina A iniciação da síntese de um polipeptídeo nas bactérias requer a subunidade 30S do ribossomo, o mRNA que codifica o polipeptídeo a ser produzido, o fMet-tRNAfMet iniciador, um conjunto de três proteínas denominadas fatores de iniciação (IF-1, IF-2 e IF-3), GTP, a subunidade 50S do ribossomo e Mg. O alinhamento correto do AUG iniciador no ribossomo, depende da sequência shine Dalgarno. A iniciação nas células eucarióticas requer vários fatores de iniciação, as extremidades 3’ e 5’ dos mRNAs de eucariotos são unidas pelo complexo protéico eIF4F. A subunidade eIF4E liga-se ao quepe 5’, e a proteína eIF4G liga-se à proteína ligadora da cauda poli(A) (PABP) na extremidade 3’ do mRNA. A proteína eIF4G também se liga ao eIF3, unindo o mRNA circularizado à subunidade 40S do ribossomo. Eucariotos não tem shine Dalgarno como bactérias, mas tem esse complexo que se move pela o mRNA até encontrar o AUG. A atividade enzimática que catalisa a formação da ligação peptídica é chamada de peptidil-transferase e que é feita pela subunidade maior do ribossomo, essa ligação peptídica é feita entre os aminoácidos formados. Terminação da síntese de proteínas em bactérias. A terminação ocorre em resposta a um códon de parada no sítio A. Primeiro, um fator de liberação, RF (RF-1 ou RF-2, dependendo do códon de parada presente), liga-se ao sítio A. Isso causa a hidrólise da ligação éster entre o polipeptídeo nascente e o tRNA no sítio P e a liberação do polipeptídeo completo. Finalmente, o mRNA, o tRNA desacilado e o fator de liberação saem do ribossomo, o qual se dissocia em suas subunidades 30S e 50S, auxiliado pelo fator de reciclagem do ribossomo (RRF), pelo IF-3 e pela energia fornecida pela hidrólise de GTP mediada por EF-G. O complexo formado pela subunidade 30S e pelo IF-3 está pronto para iniciar um outro ciclo de tradução. Importância do elevado custo energético da síntese proteica Cada um dos compostos fosfatados altamente energéticos gastos nesse processo têm papel fundamental na manutenção do alinhamento correto entre cada novo códon no mRNA e o seu respectivo aminoácido na extremidade crescente do polipeptídeo. Essa energia permite uma altíssima fidelidade na tradução biológica da mensagem genética do mRNA para a sequência de aminoácidos das proteínas. MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUCIONAIS Modificações aminoterminais e carboxiterminais Modificação de aminoácidos individuais- Ligação de cadeias laterais de carboidratos Adição de grupos isoprenila - ancorar a ptn na membrana Adição de grupos prostéticos Processamento proteolítico Formação de pontes dissulfeto TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE Importância da tecnologia do DNA - permitiu um avanço enorme nas ciências biológicas, pois possibilitou estudar as proteínas, entender sua catálise enzimática, estrutura (função), e também teve avanços nas rotas de informações e no metabolismo celular. A tecnologia possibilitou os estudos de processos bioquímicos mais complexos através do isolamento e estudo dos componentes de forma particular. Além disso, rompeu a maior dificuldade que era a baixa quantidade de substância de interesse, por meio de métodos que manipulamessa quantidade. CLONAGEM DO DNA Deve-se cortar o gene do cromossomo maior, anexá-lo a uma porção muito menor de DNA transportador e permitir que microrganismos façam muitas cópias dessa porção. O resultado é a amplificação seletiva de um determinado gene ou segmento de DNA, facilitando seu isolamento e estudo. A clonagem envolve cinco procedimentos gerais: 1. cortar o DNA-alvo em locais precisos.Endonucleases específicas de sequência (endonucleases de restrições) fornecem as tesouras moleculares necessárias. 2. Selecionar uma pequena molécula transportadora de DNA capaz de autorreplicação - Vetores de clonagem, geralmente plasmídeos ou DNAs virais 3. Juntar dois fragmentos de DNA de modo covalente - A enzima DNA-liga liga o vetor de clonagem e o DNA a ser clonado. Moléculas de DNA compostas por segmentos ligados de modo covalente a partir de duas ou mais fontes são chamadas de DNAs recombinantes. 4. Transportar o DNA recombinante do tubo de ensaio para uma célula hospedeira que irá proporcionar a maquinaria enzimática para a replicação do DNA. 5. Selecionar ou identificar as células hospedeiras que contém DNA recombinantes. Esses métodos utilizados são chamados de tecnologia do DNA recombinante ou, engenharia genética. Endonucleases de restrição - reconhecem e clivam o DNA em sequências específicas (de reconhecimento ou sítios de restrição) para gerar um conjunto de fragmentos menores. DNA-ligases - responsável por ligar os fragmentos ao vetor de clonagem adequado. Sistema de restrição-modificação - endonuclease de restrição e a metilase Tipos de endonucleases de restrição Tipo I e III são complexos grandes com múltiplas subunidades,contendo atividades tanto de endonuclease quanto de metilase. AMBAS se movem ao longo do DNA em uma reação com gasto de ATP. Tipo I - clivam o DNA em sítios aleatórios que podem estar a mais de 1.000 pb da sequência de reconhecimento. Tipo III - clivam o DNA a cerca de 25 pb da sequência de reconhecimento. Tipo II - não requer gasto de ATP e catalisam a clivagem hidrolítica de ligações fosfodiésteres específicas no DNA dentro da própria sequência de reconhecimento. Algumas endonucleases restrição fazem cortes ordenados nas duas fitas do DNA, deixando dois a quatro nucleotídeos de um fita sem par em cada extremidade resultante. Fitas sem pares são chamadas de extremidades adesivas , pois formam pares de bases entre si ou com extremidades adesivas complementares de outro fragmento. IMPORTÂNCIA!! Extremidades cegas - quando endonucleases clivam ambas as fitas do DNA nas ligações fosfodiésteres opostas, sem deixar nenhuma base sem par nas extremidades. Linkers:novas sequências de DNA que são feita através da inserçãode fragmentos sintéticos de DNA. VETORES DE CLONAGEM Plasmídeos - molécula de DNA circular que se replica separadamente do cromossomo hospedeiro 1. tem origem de replicação ou ori, sequência onde a replicação é iniciada por enzimas celulares; 2. contém genes que conferem resistência aos antibióticos tetraciclina (Tet r) e ampicilina (Amp r), permitindo a seleção de células que contém o plasmídeo intacto ou uma versão recombinante do plasmídeo. 3. várias sequências de reconhecimento únicas no pBR322 são alvo para endonuclease de restrição , fornecendo sítios onde o plasmídeo pode ser cortado e inserido em um DNA exógeno. 4. o tamanho pequeno que facilita sua entrada nas células e a manipulação bioquímica O número de cópias de plasmídeos depende do tipo de origem usada. Se for utilizar dois plasmídeos diferentes em uma célula é necessário que tenham origens diferentes,para que a regulação de um não interfira na do outro. Transformação - o plasmídeo e a célula bacteriana, geralmente a E.coli são incubados juntos a 0 grau celsius em uma solução de cloreto de cálcio, em seguida, submetidos a choque térmico, alterando rapidamente a temperatura para entre 37-43 graus celsius. Assim a célula bacteriana captam o DNA plasmidial. Eletroporação - impulso elétrico Marcadores de seleção - pode permitir tanto o crescimento de uma célula (seleção positiva) quanto matar a célula (seleção negativa). Marcador de triagem é um gene que codifica uma ptn que leva a célula a produzir uma molécula colorida ou fluorescente (quando a célula transporta o plasmídeo) 1. O pBR322 (plasmídeo) é clivado no elemento de resistência à ampicilina onde tem o gene PstI; 2. Fragmentos de DNA clonados são ligados ao plasmídeo clivado. Onde a ligação é bem-sucedida, o elemento de amp é interrompido. O de resistência à tetraciclina permanece intacto. 3. Células de E.coli são transformadas e, então, cultivadas em placas de ágar contendo tetraciclina para isolar as linhagens que incorporam o plasmídeo. 4. Após a seleção de células transformadas, todas as colônias têm plasmídeos e a ágar contém tetraciclina. 5. Colônias individuais são transferidas para posições correspondentes em placas adicionais. Uma contendo tetraciclina, a outra tetraciclina e ampicilina. 6. As células que crescem em tetraciclina (mas não em tetraciclina + ampicilina) contêm plasmídeos recombinantes com resistência à ampicilina interrompida, portanto o DNA exógeno. Células com plasmídeo, mas sem DNA exógeno, mantêm a resistência à ampicilina e crescem em ambas as placas. Bacteriófagos λ ( para fragmentos de DNA maiores) - região inútil é retirada e coloca o DNA de interesse - Mais eficiente que a transformação bacteriana com plasmídeos - 40.000 e 53.000 bp só é empacotado com esse comprimento, menor o fago não empacota Cosmídeos - podem conter DNAs exógenos de até 48 kb. - não possuem os genes dos fagos Cromossomos artificiais bacterianos (BAC) - clonagem de segmentos muito longos ( 100.000 a 300.000 pb) - usam de uma a duas cópias por célula - tem marcadores de seleção e de triagem ( beta galactosidase ) - parede celular tem que ser rompida para introduzir a cópia - produto azul: se o gene intacto for expresso; produto branco: expressão do gene interrompida Cromossomos artificiais de leveduras (YACs) - condições essenciais para manter dentro da levedura, origem de replicação, dois marcadores de seleção e sequências especializadas (telômeros e centrômeros) necessárias para a estabilidade e a segregação adequadas dos cromossomos na divisão celular; - o vetor é propagado como um plasmídeo bacteriano circular para se isolado e purificado; - ocorre a clivagem por BamHI, o cromossomo fica linear com extremidades teloméricas; - outra clivagem divide o vetor em dois braços cada um com um marcador de seleção diferentes; - o fragmento de DNA humano é adicionado entre os marcadores, ocorrendo a transformação - O YAC transforma as células de levedura (preparadas pela remoção da parede celular para formar esferoplastos) e as células são selecionadas para X e Y; as células sobreviventes propagam as inserções de DNA Alteração de genes clonados produz proteínas alteradas Aminoácidos específicos da estrutura primária podem ser substituídos individualmente por mutagênese sítio-direcionada. Se os sítios de restrição adequados se situam ao lado da sequência a ser alterada,
Compartilhar