BIOLOGIA MOLECULAR BÁSICA (resumo 1ª área)

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BIOLOGIA MOLECULAR BÁSICA
ÁREA 1
ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Os ácidos nucleicos são polímeros formados por cadeias de nucleotídeos. Sua composição (tipo e sequência) determinam suas características químicas, principalmente caracterizam sua interação com macromoléculas como proteínas. A conformação espacial está diretamente relacionada a funçã e à atividade das macromoléculas na célula. 
DNA
COMPOSIÇÃO QUÍMICA
O DNA é um polímero composto por unidades de desoxirribonucleotídeos. Ele é formado por:
Um açúcar (pentose)
Uma base nitrogenada 
Um grupamento fosfato
As bases nitrogenadaspodem ser de dois tipos:
Púricas: derivadas das purinas, que são a ADENINDA(A) e a GUANINA (G).
Pirimídicas: derivadas das perimidinas, que são as CITOSINA(C) e aTIMINA (T).
A ligação entre a base nitrogenadae a pentose é denominada LIGAÇÃO GLICOSÍDICA. A molécula composta pela base nitrogenada ligada ao açúcar, sem gurpamento fosfato, é denominada NUCLEOSÍDEO. Com o fosfato ligado a pentose, denomina-se NUCLEOTÍDEO. A molécula de DNA contém sempre nucleotídeos mono-fosfatados e os precursores para a sua síntese são sempre trifosfatados. 
Os desoxirribonucleotídeos formam cadeias sendo unidos entre si por ligações covalentes, formando PONTES FOSFODIÉSTER estabelecidas entre o grupamento fostfato (5’-PO4) e o grupamento hidroxílico (3’-OH) do carbono 3’ do nucleotídeo adjacente. Isso confere direcionalidadeas cadeias polinucleotídicas, por isso as cadeias polinucleotídeas são representadas na orientação 5’→3’.
HÉLICE DUPLA
A principal propriedade para esta função é a capacidade de “autorreplicação”. As desoxirriboses, ligadas umas as outras pelos grupamentos fosfato, ficam externas em relação às bases nitrogenadas. As ligações fosfodiéster das duas fitas estão em direções opostar (5’→3’ e 3’→5’), por isso são antiparalelas. Os aneis aromáticos das bases nitrogenadas são hidrofóbicos e ficam orientados para o interior da hélice dupla. Cada base nitrogenada de uma das cadeias está pareada com a base complementar na outra cadeia de DNA, este pareamente ocorre pela formação de PONTES DE HIDROGÊNIOentre as duas fitas.
Entre A, U e T são formadas duas pontes de hidrogênio e entre C e G são formadas três pontes dehidrogênio.Isto confere complementariedade ao DNA. CG precisam de mais energia para serem quebradas que AT.
Outras forças que estabilizam o DNA:
EFEITOS HIDROFÓBICOS: estabilizam o pareamento entre as bases. Os aneis das purinas e das pirimidinas, que estão voltados para o interior da hélice dupla, são mantidos por coesão interna de moléculas de água, e os sítios hidrofílicos das bases ficam expostos ao solvente nas cavidades.
EMPILHAMENTO DAS BASES:no interior da hélice dupla se estabelecem forças de Van der Walls entre os anéis aromáticos de bases adjacentes. 
CADEIAS DE AÇÚCAR-FOSFATO:são negativamente carregadas, interagem com cátions em solução, neutralizando a repulsão entre as duas cadeias e estabilizando a hélice dupla.
Na célula, a molécula de DNA, está quase sempre ligada a proteínas estruturais (HISTONAS). A formação da cromatina é o principal tipo de estruturação das moléculas de DNA na célula.
PROPRIEDADES QUÍMICAS
As propriedades mais importantes são:
-COMPLEMENTARIEDADE entre as bases nitrogenadas;
-ANTIPARALELISMOque confere direcionalidade as cadeias, e a capacidade de desnaturaçãoe renaturação da hélice dupla.
RNA
Uma molécula de DNA linear pode, em sua sequência de bases, armazenar informações genéticas (semelhante ao DNA), realizar um pareamento interno, formando uma estrutura secundária, expondo ou escondendo determinadas sequências e, assim interagir com outras moléculas; pode assumir uma conformação espacial, estrutura terciária, contendo superfícies que podem interagir com outra moléculas ou regiões internas que possam criar sítios de ligação com metais.; e promover catálise como enzimas.
Grande maleabilidade.
COMPOSIÇÃO QUÍMICA
Como o DNA, o RNA é composto por polímeros lineares de subunidades de nucleotídeos ligados entre si por ligações fosfodiéster 5’→3’. No entanto o açúcar presente é a RIBOSE e a base T é subsituida pela Uracila (U). O RNA é predominantemente de cadeia simples, mas forma regiões de cadeia dupla por pareamento interno.
O RNA é mais reativo que o DNA.
ESTRUTURA SECUNDÁRIA
Ocorre pareamento entre CG e AU. A estrutura secundária tipo GRAMPO são estruturas muito frequentes, compostas pelo pareamento interno de uma cadeia simples de RNA formando uma alça onde não existe pareamento. A estabilidade destes grampos é muito variável.
CLASSES DE RNA
Diferentes tipos de RNA estão presentes na célula com funções específicas. Os principais RNAs encontrados na célula que participam da síntese de proteínas são:
mRNA (RNA mensageiro): transfere a informação genética do DNA aos ribossomos, local onde ocorre a síntese de proteínas.
rRNA (RNA ribossômico): é componente majoritário dos ribossomos. 
tRNA(RNA transportador): transporta resíduos de aminoácidos até os ribossomos para a síntese das proteínas.
Existem RNAs CODIFICADORES e NÃO CODIFICADORES. Os codificadores são aqueles que contêm informação genética para a síntese das proteínas. Sâo os mRNAs.
Os demais RNAs são os não codificadores, o rRNAe tRNA.
GENES E GENOMAS PROCARIÓTICOS
Organismos unicelulares caracterizados pela ausência de organelas. O material genético encontra-se compactado em uma região denominada NUCLEOIDE, que não é separada do citoplasma por qualquer tipo de membrana.
ESTRUTURA BÁSICA
Um GENEpode ser definido como uma sequência de DNA que inclui todas as sequências nucleotídicas necessárias e suficientes para a síntese de pelo menos um produto correspondente. Em sua estrutura básica, cada gene é constituido por um região codificadora, que é a sequência nucleotídica que codifica seu produto, e pelas sequências reguladoras, que a flanqueiam controlando a sua expressão.
Cada gene está orientado de 5’3’. No DNA a fita com a orientação 5’3’ é denominada FITACODIFICADORA e a fita com a orientação 3’5’ é a FITA MOLDE, já que serve de molde para o RNA. O RNA transcrito é complementar à fita molde e tem a mesma orientação e sequência correspondente a da fita codificadora.
Em um gene procariótico típico, as sequências reguladoras que controlam a sua transcrição encontram-se adjacentes à região codificadora. As sequências reguladoras da transcrição são o PROMOTOR, situado na região flanqueadora 5’, bem no início (a montante da região codificadora), e o TERMINADOR, situado na região flanqueadora 3’, bem no final (a jusante da região codificadora). O promotor é o sítio no DNA onde a RNA-polimerase, enzima responsável pela transcrição do gene, se liga. O terminador é a sequência que determina a dissociação da RNA-polimerase da fita-molde e o final do processo da transcrição.Além das referidas sequências, podem estar presentes outros elementos reguladores, que são sítios de ligação de proteínas ativadoras ou reperssoras da transcrição. 
Os procariotos não costumam ter ÍNTRONS (sequências não codificadoras interrompendo um gene), isso diferencia os procariotos de eucariotos, já que em eucariotos é comum a presença de íntrons.
TAMANHO
Como os procariotos não são interrompidos por íntrons e não apresentam regiões reguladoras muito extensas, eles tem o DNA bem menor que o de eucariotos.
HOMOLOGIA ENTRE GENES 
Muitos genes apresentam similaridades em suas sequências nucleotídicas, as quais são denominadas HOMÓLOGAS. Elas ocorrem ao longo do processo evolutivo. 
Quando o evento evolutivo que gerou os genes homólogos é a duplicação de uma região cromossômica, os genes duplicados são PARÁLOGOS. No primeiro momento, uma duplicação gera cópias idênticas do segmento cromossômico, mas com o tempo eles podem sofrer alterações dependendo da pressão ambiental sobre o gene. Pode ser um benefício ter dois genes idênticos se a demanda daquele produto é alta na célula. Ou pode acontecer de uma das cópias divergir e acabar produzindo umproduto relacionado, mas não idêntico ao original, podendo ter funcionalidade distinta. Em alguns casos, a cópia ainda pode ser tornar não funcional.
Quando o determinante da presença de homologia entre dois genes são eventos de especiação, os genes então são denominados ORTÓLOGOS. Nesse caso, em genomas de espécies diferentes, os genes ortólogos são identificados como sequências similares, que codificam produtos também similares e com funções correspondentes em cada uma das espécies. Quanto maior o número de genes ortólogos em espécies diferentes, maior o grau de parentesco entre elas.
A TRANSFERÊNCIA GÊNICA HORIZONTAL, mediada por elementos genéticos móveis, é um processo marcante na evolução de organismos procarióticos e capaz de levar ao surgimento de genes ortólogos. Genes adquiridos dessa forma são denominados XENÓLOGOS.
FORMA, NÚMERO E ORGANIZAÇÃO EM REPLICONS
A maioria dos procariotos tem apenas um único cromossomo circular covalentemente fechado. Quando são moléculas de DNA menores e contendo um número mais limitado de genes essenciais, elas podem ser denominadas PLASMÍDEOS, mas ainda são partes do genoma.
Em procariotos os cromossomos são organizados em unidades de replicação, ou REPLICONS, que são segmentos cromossômicos que replicam a partir de uma origem de replicação.
DENSIDADE GÊNICA
Genomas procarióticos apresentam uma alta densidade gênica, principalmente se comparados a eucariotos. Procariotos tem o genoma, extensão das regiões codificadoras e reguladora dos genes e o número de genes por genoma reduzido.
ÓPERONS
É uma unidade funcional do genoma, na qual as duas ou mais regiões codificadoras de um produto gênico (de RNA ou proteico) ocupam posições adjacentes, estão coorientadas e tem a sua transcrição controlada por um mesmo conjunto de sequências reguladoras.
As diferentes regiões codificadoras presentes em um óperon são contrascritasem um único produto de RNA, que é por isso chamado de POLICISTRÔNICO. Um CÍSTRON equivale a um gene. A cotranscrição de mais de uma região codificadora, a partir de um mesmo conjunto da maquinaria reguladora, representa uma otimização da maquinaria reguladora da célula. A organização em óperons proporciona uma economia de espaço no DNA, o que é importante para pequenas células procariotas. Entre cada cístron existem as REGIÕES INTERCISTRÔNICAS.
DINÂMICA EVOLUTIVA DOS GENOMAS PROCARIÓTICOS
Procariotos tem diversos mecanismos moleculares que proporcionam variabilidade genética, são altamenteproliferativos e estão em geral expostos a condições ambientais bastante variáveis. Por causa disso os procariotos tem uma alta plasticidade genômina.
PRINCIPAIS PROCESSOS EVOLUTIVOS
Levam ao surgimento de novas sequências ou de novas combinações de sequências preexistentes, aumentando a complexidade de um genoma. A aquisição de novas sequências decorre de 3 maneiras:
DUPLICAÇÃO SEGUIDA DE DIVERGÊNCIA: uma segunda cópia da região genômia é gerada e os pares de genes duplicados podem então divergir pelo acúmulo diferencial de mutações ao longo do tempo.
TRANSFERÊNCIA GENICA HORIZONTAL: novas sequências são incorporadas ao genoma de uma espécie por processos mediados por ELEMENTOS GENÉTICOS MÓVEIS, como plasmídeos conjugativos, bacteriófagos e elementos transponíveis. Essa transferência é chamada horizontal porque pode ocorrer entre espécies sem uma relação linear.
FUSÃO DE RÉPLICONS: união covalente e estável a longo prazo de dois replicons originalmente independentes.
Elementos genéticos móveis
Segmentos de DNA que podem movimentar-se dentro dos genomas ou mesmo entre diferentes genomas. O conjunto de elementos genéticos móveis chama-se MOBILOMA. Existem 3 tipos de elementos genéticos móveis:
PLASMÍDEOS
BACTERIÓFAGOS
ELEMENTOS TRANSPONÍVEIS
Alguns elementos móveis não tem qualquer tipo de função.
PLASMÍDEOS
São elementos genéticos extracromossômicos com capacidade de replicação autônoma. São encontrados principalmente em procariotos, mas também tem em alguns eucariotos, como leveduras. Eles são um DNA de fita dupla circular.
Existem plasmídeos de vários tamanhos com muitos ou poucos genes. O elenco de genes presentes em um plasmídeos pode conferir funções e determinar fenótipos importantes para a célula hospedeira.
MOBILIDADE PLASMIDIAL EM BACTÉRIAS
A CONJUGAÇÃO BACTERIANAé a transferência de material genético através de um contato direto célula-célula. Esse processo depende da formação de longos apêndices na superfície da célula bacteriana. Então formam-se pontes citoplasmáticas entre as células associadas. O produto do evento de conjugação completo é a transferência do plasmídeo de uma célula a outra, com a retenção de uma cópia idêntica na célula doadora.
Os plasmídeos conjugativos podem inserir-se no cromossomo bacteriano ou em outros plasmídeos. Quando esses plasmídeos integrados transferem-se para células receptoras, transferem junto parte do cromossomo bacteriano. Na célula receptora, este DNA irá se recombinar com o DNA do cromossomo, tendo como consequência a recombinação genética entre as duas linhagens. A transferência ocorre com a passagem de uma fita de DNA da célula doadora para a receptora, começando sempre pela oriT.
BACTERIÓFAGO/FAGOS
São vírus de bactérias. Os fagos não possuem uma maquinaria metabólica própria, por isso são incapazes de se multiplicarem sem parasitarem outros organismos.
Os fagos se propagam em uma estrutura composta por um capsídeo proteico envolvendo o genoma viral. 
Fagos são replicons potencialmente letais, no entanto alguns bacteriófagos podem ser mantidos na forma de plasmídeos.
O ciclo de vida dos fagos podem ser de 2 tipo:
VIRULENTO: que se multiplicam dentro da célula hospedeira e originam vários fagos que são liberados após a lise celular.
TEMPERADO: podem integrar-se ao genoma bacteriano, formando uma linhagem lisogênica, ou entrar em ciclo lítico como os fagos virulentos.
Após a entrada do genoma viral em um hospedeiro suscetível, o fago pode entrar em:
CICLO LÍTICO:genoma do fago é expresso em uma sequência de eventos reguladores que requer fatores codificados tanto pelo fago quanto pela bactéria. Logo após a infecção expressam-se os genes iniciaisdo fago. Eles codificam proteínas reguladoras que determinam a transcrição dos genes intermediáriose estes determinam a transcrição dos genes tardios. Ao final do ciclo, as novas partículas virais formadas são liberadas e podem infectar novas células hospedeiras suscetíveis.
CICLO LISOGÊNICO: fagos temperados são capazes de perpetuar o seu material genético sem provocar a morte da célula hospedeira. Nesse processo, o genoma do fago se integra no genoma bacteriano. O processo é reversível, de forma que o genoma do fago pode ser eventualmente liberado, sendo possível sua entrada em um cíclo lítico. A bactéria que carrega uma cópia do genoma viral integrada no seu cromossomo é chamada LISOGÊNICA, e o genoma do fago, que mantém a capacidade potencial de lise da célula hospedeira, é denomiado PRÓFAGO. Bactérias lisogênicas possuem imunidade contra a infecção adicional por outros fagos do mesmo tipo.
Certos fagos possuem a capacidade de transferir pequenos segmentos de DNA do cromossomo bacteriano de uma célula para outra em um processo denominado TRANSDUÇÃO.
ELEMENTOS DE TRANSPOSIÇÃO/TRANSPOSONS
São segmentos de DNA que são capazes de se locomover de um ponto a outro de um cromossomo, mudar de cromossomo e saltar do genoma de uma espécie a outra. Eles estão presentes em quase todos os genomas já estudados, tanto de procariotos como de eucariotos.
Eles são muito diversos podendo variar quanto ao mecanismo de transposição que empregam e aos genes que possuem (podem atém não possuir nenhum gene).
Para fazer a transposição pode-se usar um intermediário de DNA, os transposons. Esses elementos empregam uma enzima chamada de TRANSPOSASE que, em alguns casos, pode retirar o elemento do seu sítio e transpô-lo para um novo sítio. A transposase pode manter o elemento em seu sítiooriginal e transpor uma cópia dele para um novo sítio.
O mecanismo de transposição utilizado pelos retrotransposons sempre resulta no aumento do número de cópias, pois o elemento que origina a nova cópia nunca sai de seu sítio original e, por isso, é chamado de TRANSPOSIÇÃO REPLICATIVA. O mecanismo de corte e colagem utilizado pelos transposons de DNA, pode manter o número de cópias dos elementos transponíveis no genoma, pois no processo chamado de TRANSPOSIÇÃO CONSERVATIVA/TRANSPOSIÇÃO SIMPLES/TRANSPOSIÇÃO NÃO-REPLICATIVA, o transposon sai de seu sítio de origem e vai ocupar um novo.
GENES E GENOMAS EUCARIÓTICOS
Os eucariotos possuem diversos tipos de organelas, principal diferença entre eucariotos e procariotos.
GENES EUCARIÓTICOS
Genes eucarióticos e procarióticos apresentam a mesma estrutura básica, no entanto eucariotos possuem estruturas mais complexas que os procariotos.
ESTRUTURA BÁSICA E OCORRÊNCIA DE GENES INTERROMPIDOS EM EUCARIOTOS
Genes eucarióticos tem a região reguladora a montante da região codificadora, incluindo o promotor, bem mais extensa e contém um número de elementos reguladores muito maior que em procariotos. Um gene eucariótico pode conter elementos reguladores distais situados a milhares de pares de bases da região codificadora.
Em eucariotos ocorrem sequências intervenientes, os ÍNTRONS, que interrompem a região transcrita do gene e a dividem em vário segmentos, os ÉXONS. Os íntrons estão no DNA genômico e são trancritos para o RNA precursor, porém são removidos durante o processamento do RNA, dando origem ao RNA maduro.
A medida que se avança na escala evolutiva aumenta a tendência geral no número de íntrons. Isso determina que o tamanho médio dos genes seja maior em espécies eucarióticas complexas.
GENOMAS NUCLEARES EUCARIÓTICOS
Existe uma ampla variação entre o tamanho de genomas eucarióticos, comparando o conteúdo de DNA haplóide, o chamado VALOR C. Considera-se os tamanhos mínimos de genoma observados em cada filo, parece haver uma tendência ao aumento de tamanho que acompanha, até certo ponto, a crescente complexidade anatômica e funcional observada entre metazoários, desde nematóides até cordados.
O PARADOXO DO VALOR C pode ser observado em muitos grupos taxonômicos e descreve uma frequente falta de correlação entre a complexidade biológica dos organismos e os tamanhos dos respectivos genomas. O paradoxo do valor C resulta da presença de uma grande quantidade de sequências não associadas a genes, isso faz com que o tamanho do genoma não reflita diretamente o número de genes nele presente. Essas sequências intergênicas são constituidas, em grande parte, por elementos transponíveis e outras classes de DNA repetitivo.
COMPOSIÇÃO DE SEQUÊNCIA
Um aspecto funcional importante é a possibilidade de um mesmo gene poder gerar mais de uma proteína diferente. Isso pode acontecer por meio da utilização de códons de iniciação ou término detradução alternativos e/ou splicing alternativo. 
A fração de genes que sofrem splicing alternativo é maior em organismos mais complexos.
Outro fator importante em eucariotos é a densidade gênica, definida como a distância média entre genes individuais ao longo de um genoma. A densidade gênica depende da proporção de sequências intergênicas no genoma, com tendência a aumentar mais que o número de genes à medida que avança na escala evolutiva.
FAMÍLIAS DE PARÁLOGOS, GENES ÚNICOS E PSEUDOGENES
A ocorrência de duplicação gênica determina uqe muitos genes façam parte de FAMÍLIA DE PARÁLOGOS, cujo grau de parentesco pode variar de 30% a 100% ao longo de todo o gene ou, pelo menos, em um ou mais de seus éxons. Em contra partida, os genes que não fazem parte de nenhuma família em um genoma são os GENES ÚNICOS.
A medida que se avança na escala evolutiva se percebe o aumento da % de genes em famílias.
A origem de famílias gênicas por duplicação e divergência por mutação leva também a formação de muito parálogos não funcionais, os PSEUDOGENES.
A tendência do aumento do número de genes em famílias de eucariotos mais complexos é acompanhada também pelo aumento do número de famílias diferentes e do número de genes em cada família.
Em alguns casos genes idênticos presentes em CÓPIAS MÚLTIPLAS servem para suprir a necessidade elevada de certos produtos gênicos.
ELEMENTOS TRANSPONÍVEIS
São sequências de DNA capazes de se integrarem em outros lócus genômicos implicando no aumento do seu número de cópias no genoma.
ÓPERONS EUCARIÓTICOS
É muito mais difícil encontrar óperons em eucariotos, é muito mais comum cada gene ser transcrito em um produto de RNA monocistrônico.
GENOMAS DE ORGANELAS
Mitocôndrias e plastídeos são organelas que apresentam genoma próprio, que diferem tanto em estrutura como em composição gênica dos genomas nucleares eucarióticos. São os GENOMAS EXTRANUCLEARESe contêm essencialmente um elenco de genes relacionados às funções de cada organela, centradas na síntese de ATP como fonte de energia.
A presença de genoma próprio é resquício da origem evolutiva dessas organelas. Mitocôndrias e plastídeos evoluiram a partir de bactérias que foram internalizadas, inicialmente como endossimbiontes.
Os genomas de organelas são constituidos por moléculas de DNA de fita dupla, em geral circulares, chamados de, no caso das mitocôndrias, de mtDNA e, no dos plastídeos, de ptDNA. São pequenos, contém genes que codificam funções relacionadas, organizados em óperons e muitas das proteínas por eles codificadas são mais parecidas com as de bactérias.
Os processos de replicação de genomas de organelas e de expressão de seus genes são autônomos, isto é, ocorrem nas próprias organelas. 
REPLICAÇÃO DO DNA
O conjunto de enzimas que atuam na replicação chama-se REPLISSOMO. O DNA pode ser tanto de fita dupla quanto de fita simples (no caso de vírus).
Existem algumas regras básicas que se aplicam a todos os organismos que se replicam:
A REPLICAÇÃO É SEMICONSERVATIVA
A REPLICAÇÃO É SEMIDESCONTÍNUA
A ADIÇÃO DE NUCLEOTÍDEOS É SEMPRE NO SENTIDO 5’3’
A REPLICAÇÃO SEMPRE INICIA EM SEQUÊNCIAS ESPECÍFICAS CHAMADAS ORIGENS
REPLICAÇÃO UNIDIRECIONAL E BIDIRECIONAL
O processo de replicação inicia na origem e prossegue sequencialmente ao longo da fita de DNA, em uma ou ambas as direções até o término, formando uma bolha de replicação. Nessa bolha de replicação encontra-se a região do DNA que já foi replicada e flanqueada por regiões onde a síntese das novas fitas ainda não foi realizada.
Na replicação UNIDIRECIONAL, uma forquilha de replicação (replissomo) parte da origem e segue replicando o DNA em uma só direção. Na replicação BIDIRECIONAL duas forquilhas de replicação deixam a origem em direções opostas.
A replicação ocorre de forma SEMICONSERVATIVA, sendo cada fita de DNA copiada no sentido 5’3’. As duas fitas de DNA parental devem ser separadas e cada uma servirá de molde para a síntese das novas fitas de DNA. É semiconservativo porque as moléculas de DNA geradas, após a replicação, contêm somente uma das fitas recém-sintetizada e a outra corresponde à fita do DNA parental (molde).
PROTEÍNAS ENVOLVIDAS NA REPLICAÇÃO
DNA-polimerase: necessárias tanto para a replicação do DNA como para o processo de reparação do DNA. Diferentes processos metabólicos são realizados por DNA-polimerases específicas, sendo algumas delas proteínas multifuncionais. As DNA-polimerases de todos os organismos realizam a mesma reação enzimática, que consiste na incorporação de nucleotídeos trifosfatados na extremidade 3’-OH livre, sintetizando a fita no sentido 5’3’. Portanto, para que a DNA-polimerase possa realizar a incorporação de bases no DNA é necessária a síntese prévia de pequenas sequências de ribonucleotídeos, denominados INICIADORES/PRIMERS. A seleção do nucleotídeo a ser adicionado depende exclusicamente da complementaridade de bases com fita-molde. 
DNA-polimerse I e III: participam no processo de replicação.
DNA-polimerase II: repara lesões do DNA.
Todas as DNA-polimerases não só fazem a polimerização (síntese do DNA),mas também fazem o papel de exonucleases (remoção de nucleotídeos a partir da extremidade da molécula de DNA).
Nas DNA-replicase existe uma atividade de exonuclease no sentido 3’-OH para 5’-P (3’5’), que tem a função de remover nucleotídeos adicionados incorretamente na fita nova do DNA. É uma correção de erro, pois permite que a própria DNA-polimerase, que está realizando a síntese, remova o nucleotídeo com pareamento incorreto. O processo ocorre da seguinte forma:
“Um nucleotídeo é adicionado na cadeia nova crescente pela atividade de polimerização da DNA-polimerase III, formando o pareamento das bases; a enzima faz o movimento de uma base para adicionar o próximo nucleotídeo de um novo pareamento; sendo o pareamento de bases anterior incorreto, a enzima fica impedida de continuar a polimerização e, movendo um nucleotídeo para trás, coloca-se em contato com o nucleotídeo que deve ser removido com a atividade de exonuclease 3’5’; e o nucleotídeo com pareamento de bases incorreto é removido e um novo nucleotídeo pode ser adicionado na reagião onde ocorreu a correção de erro.”
OUTRAS PROTEÍNAS ENVOLVIDAS NO REPLISSOMO
DNA-polimerase
Helicases
Proteínas SSB
Primases
Ligase
Topoisomerase
A forquilha de replicação deve conter uma HELICASE, com função de quebrar as pontes de hidrogênio entre as bases, separando as duas fitas de DNA. Essa abertura das fitas é necessária para a forquilha de replicação possa se movimentar e, portanto, todas as DNA-polimerases replicando DNA de fita dupla dependem da ação inicial de uma helicase.
Outro grupo de proteínas presentes no replissomo são as proteínas que se ligam à fita simples do DNA, as proteínas SSB. Essas proteínas tem alta afinidade pelo DNA na forma de fita simples, ocorrendo a ligação sempre de forma cooperativa. A presença das proteínas SSB durante a replicação é muito importante porque elas se ligam as regiões de fita simples do DNA, evitando que aquela região sofra torções, induzindo uma conformação do DNA ideal para a replicação e o pareamento de bases, além de protegerem as fitas simples da degradação por nucleases.
A DNA-polimerase não tem capacidade para iniciar uma cadeia de nucleotídeos, necessitando de uma região pareada (fita dupla) com uma extremidade 3’-OH livre. Portanto, para cada início de síntese de uma das fitas de DNA, se faz necessária a presença de um iniciador. Os iniciadores utilizados na replicação dos genomas celulares são pequenas sequências de RNA sintetizados por primase.
As TOPOISOMERASES são enzimas que catalisam a interconversão de topoisômeros de DNA e, portanto, permitem alterações no grau de superenrolamento. Essas enzimas promovem a quebra transitória de ligações fosfodiéster da fita de DNA, gerando uma forma intermediária, em que a proteína permanece ligada covalentemente ao DNA e permite que as fitas do DNA passem umas sobre as outras ou sofram torção, alterando, assim, o superenrolamento da molécula.
SÍNTESE DA FITA CONTÍNUA E DESCONTÍNUA DO DNA
Durante o processo de replicação do DNA, dois fatores devem ser considerados:
As fitas de DNA tem polaridades opostar (5’3’ e 3’5’);
As DNA-polimerase sintetizam apenas no sentido 5’3’.
Por isso uma ads fitas é sintetizada de forma contínua e a outra de forma descontínua, portanto o processo é semidescontínuo. Sendo assim a DNA-replicase necessitaria somente um iniciador inicial para síntese da fita contínua, mas, caso ela seja interrompida, é necessária a síntese de iniciadores adicionais pela primase.
Já a síntese da fita descontínua é realizada a partir de vários iniciadores, sendo polimerizada em diversos fragmentos (FRAGMENTOS DE OKAZAKI). A síntese de cada fragmento de Okazaki prossegue até encontrar a região 5’-P do fragmento anterior, quando então a DNA-polimerase se dissocia da fita descontínua do DNA. Durante este processo, a fita-molde da fita descontínua parece formar uma alça, resultando na coorientação da síntese da fita descontínua com o movimento do replissomo.
Um outro aspecto fundamental da replicação do DNA é a coordenação da síntese das duas fitas novas, a contínua e a descontínua. Essa coordenação, que demanda uma série de reações enzimáticas sequenciais, sincroniza a síntese dos iniciadores das duas fitas, a reciclagem da ligação da DNA-polimerase na fita descontínua e a produção dos fragmentos de Okazaki.
Após a abertura do Dna na origem, o movimento da forquilha de replicação ocorre no mesmo sentido em que a enzima gelicase realiza a separação das fitas. Antes da formação da alça a primase pode atuar como um “freio” e causar uma parada temporária no movimento do replissomo. Este mecanismo de ação seria responsável por impedir que o crescimento da fita contínua ultrapassasse excessivamente a síntese da fita contínua.
REPLICAÇÃO DO CONTEXTO DA CROMATINA EUCARIÓTICA
A replicação está inter-relacionada com a organização local da cromatina, que permite o acesso de fatores reguladores específicos capazes de interagir com o DNA.
Em eucariotos, durante a fase S, o DNA e a cromatina devem ser duplicados, e a cromatina deve sofrer alterações para permitir a passagem de replissomos. Para a síntese das novas fitas, os nucleossomos do DNA parental deve sofrer alterações para permitir a passagem do replissomo. Para a síntese das novas fitas, os nucleossomos do DNA parental devem ser transitoriamente alterados, sendo novamente estruturados nas duas novas moléculas de DNA sintetizadas.
As HISTONAS podem estar presentes na célula na forma de dímeors associados a CHAPERONAS (responsáveis pelo correto enovelamento de outra proteínas). Durante o processo de replicação ocorre a síntese de novas histonas.
ORIGEM DA REPLICAÇÃO
A replicação ao longo da molécula de DNA ocorre a partir deum ponto inicial denominado ORIGEM DA REPLICAÇÃO. Origens da replicação tem a característica comum de serem formadas por sequências ricas em nucleotídeos AT. O DNA de bactérias, vírus e plastídeos tem somente uma origem de replicação, ao passo que múltiplas origens são encontradas em genomas eucarióticos.
Em todos os organismos o início da replicação é caracterizada pelo reconhecimento da origem por proteínas específicas, que posteriormente recrutam proteínas adicionais formando então o replissomo.
CARACTERÍSTICAS DAS ORIGENS DE REPLICAÇÃO
Em E. coli a origem de replicação (oriC) é a seguinte sequência 5’TTAT (C/A)CA(C/A)A3’.
CICLO CELULAR E ORIGEM DA REPLICAÇÃO
A replicação e o ciclo celular devem estar conectados de forma que a frequência dos cilos de replicação se ajuste à velocidade do crescimento da célula, e o término da replicação seja relacionado ao final da divisão celular.
DINÂMICA DA REPLICAÇÃO
O processo de replicação inicia com o reconhecimento da origem por uma proteína específica. A seguir, ocorre o recrutamento de outras proteínas, que terão a função de dar continuidade na abertura das fitas formando a bolha de replicação em que serão montados os replissomos responsáveis pela síntese das duas fitas de DNA (contínua e descontínua), um em cada forquilha de replicação.
As forquilhas de replicação irão se movimentar em direções opostas, convergindo para a região de término da replicação. Um único replissomo estaria localizado em cada forquilha, sendo responsável pelo desenrolamento das fitas de DNA, pela formação dos iniciadores e pela síntese simultânea das fitas contínua e descontínua.
A DNA-polimerase III termina a síntese de um fragmento de Okazaki ao enconrtar a extremidade 5’-P do fragmento de Okazaki anteriormente sintetizado. Neste momento, o núcleo catalítico da DNA-polimerase III, responsável pela síntese da fita descontínua, se dissocia da subunidade ß e se reassocia a uma nova subunidade ß, que está localizada em um novo iniciadore, recém-sintetizado.
A helicase que se encontra na frente da forquilha de replicação, realizando a abertura das fitas de DNA, recruta a primase. Para a síntese dos iniciadores na fita descontínua, a primase deve movimentar-se em sentido oposto ao do movimento da forquilha. Portanto, a primasedeve se movimentar ao longo da fita simples até o início do iniciador, no mesmo sentido do avanço da forquilha. A formação da alça no DNA poderia ser utilizada pela fita descontínua para coordenar o movimento da primase, que realiza a síntese no sentido oposto, com a replicação simultânea das duas fitas pela holoenzima.
TELÔMEROS E TELOMERASE
Os TELÔMEROS (extremidade dos cromossomos de eucariotos) estão relacionados a estabilidade genômica. Telômeros são compostos de sequências repetidas ricas em “G”, formando uma estrutura tridimensional, o que evita que as extremidades sejam reconhecidas como quebras de DNA de fita dupla. Em células com uma alta atividade replicativa os telômeros são alongados pela atividade de uma enzima específica, a TELOMERASE.
TRANSCRIÇÃO/SÍNTESE DE RNA
A transcrição é o processo pelo qual são sintetizados todos os RNAs celulares. Esse processo conecta a informação presente na sequência de bases do genoma (genótipo) com as características funcionais da célula (fenótipo). Os RNAs sintetizados na transcrição produzem os RNAs funcionais e as proteínas e, portanto, a transcrição tem uma posição central na expressão gênica, sendo o seu primeiro passo.
A transcrição é mediada por RNA-polimerases dependentes de DNA.
CICLO DA TRANSCRIÇÃO
A transcrição é um processo cíclico de síntese de RNA dividido em 3 fases:
Início: sequências específicas de DNA (promotores) sinalizam o local de formação do complexo de transcrição para iniciar a cópia das sequências do DNA em RNA;
Alongamento da cadeia: a molécula de RNA é sintetizada;
Terminação da transcrição: processo em que a síntese de RNA é terminada em resposta a sinais específicos de terminação da transcrição (TERMINADORES).
Cada ciclo de transcrição ocorre várias vezes na mesma região do DNA e antes que um complexo atinja a região de terminação, outros complexos de transcrição estão iniciando a síntese de RNA.
A reação depende de um molde cuja sequência de bases é copiada por complementaridade. A molécula molde é uma das fitas de DNA hélice dupla. A síntese ocorre na direção 5’3’. Para a transcrição a hélice dupla do DNA deve ser desnaturada (separada) por ruptura das ligações de hidrogênio para que as sequências de nucleotídeos da fita-molde possa ser exposta e copiada.
Apenas uma das fitas de DNA é utilizada como molde. Apenas uma das fitas de DNA é representada e escrita da orientação 5’3’. Esta fita é denominada fita similar ao RNA e para obter a sequência da molécula de RNA que será sintetizada basta substituir as Ts por Us. Por isso podemos chamar essa fita de FITA CODIFICADORA. A fita de RNA sintetizada é, portanto, copiada da outra fita de DNA, denominada fita-molde, pois a síntese ocorre por complementaridade.
A fita dupla é desnaturada na região do DNA onde ocorre a transcrição, e o complexo RNAP mantém esta estrutura estável, enquanto o RNA sintetizado permanece parcialmente pareado com a fita-molde do DNA e a parte já sintetizada deixa o complexo de transcrição. Essa estrutura chama-se BOLHA DE TRANSCRIÇÃO.
A fase produtiva da transcrição é a fase de alongamento da cadeia de RNA. As RNAPs adicionam processivamente na extremidade 3’ um a um os ribonucleotídeos complementares ao molde de DNA. O complexo de alongamento é dissociado do final da síntese em resposta a sinais específicos de terminação. 
PROTEÍNAS ENVOLVIDAS
As RNAPs tem múltiplas atividades:
Reconhecem e se ligam a sequências específicas de DNA
Separam a hélice dupla do DNA, expondo a sequência de nucleotídeos a ser copiada
Mantêm as fitas de DNA separas na região de síntese de RNA
Mantêm estável o híbrido DNA-RNA na região de síntese
Sozinhas ou com auxílio de proteínas específicas, terminam a síntese do RNA
A reação catalisada pelas RNAPs é mecanisticamente idêntica a reação catalisada pelas DNA-polimerases. As RNAPs não precisam de um iniciador para começar a síntese do RNA.
RNAPs DE PROCARIOTOS
As RNAPs bacteranas são as mais simples, sendo compostas por 5 proteínas.
Duas subunidades que formam o sítio ativo do complexo
Um homodímero alfa
Uma subunidade omega (estabiliza o complexo)
Essas cinco proteínas formam o complexo que é suficiente para sintetizar RNA a partir de um molde de DNA na presença de ribonucleotídeos (ATP, UTP, CTP e GTP) e em condições apropriadas de íons e pH.
Este complexo não apresenta uma característica fundamental que é a capacidade de reconhecer o promotor e inicar a transcrição. Para o início da síntese de RNA é necessário que outra proteína (FATOR SÍGMA) seja adicionada ao complexo, formando um novo complexo. Esse complexo plenamente funcional é denominado HOLOENZIMA.
Nos complexos de iniciação da transcrição, aminoácidos específicos do fato sigma estão ligados ao DNA, conferindo ao complexo RNAP a capacidade de reconhecer e ligar-se ao promotor.
RNAPs DE EUCARIOTOS
Em eucariotos existem 3 classes de RNAPs nucleares que sintetizam diferentes classes de RNAs.
TOPOISOMERASES
Tanto nos sistema procarióticos como nos eucarióticos a transcrição é iniciada com mais facilidade e eficiência quando o molde está superenrolado. O superenrolamento altera a geometria do pareamento entre as fitas do DNA e pode expor as bases nitrogenadas. Portanto as topoisomerases estão também diretamente relacionadas a transcrição.
As diferentes topoisomerases participam da transcrição estabilizando as estruturas e refazendo o superenrolamento original após a transcrição. 
PROMOTORES
PROCARIOTOS
Os PROMOTORES são as sequências específicas na molécula de DNA que determiina o local de formação dos complexos e iniciam a transcrição. O primeiro nucleotídeo da sequência do DNA, copiado no RNA, é denominado sítio de início da transcrioção e demarcados como +1 na molécula de DNA. Os desoxirribonucleotídeos localizados antes do sítio de início da transcrição recebem sinal negativo e números crescentes. Os desoxirribonucleotídeos, após o sítio +1 em direção ao terminador, recebem números crescentes positivos.
Nos procariotos o promotor é o conjunto de sequências do DNA onde o coplexo RNAP se liga para iniciar a trancrição.
A transcrição em E. coli segue as seguintes regras:
O primeiro nucleotídeo a ser transcrito é uma purina (A ou G)
Duas sequências são conservadas na maioria dos genes comparados: uma localizada na região -10 e outra na região -35
As regiões –10 e -35 são separadas por 15 a 17 nucleotídeos, o que corresponde a uma volta da hélice do DNA
A região -10 recebe a denominação de TATA box. As regiões -10 e -35 definem os promotores de E. coli.
A atividade dos promotores pode ser alterada por proteínas ativadoras e repressoras, que se ligam a sequências específicas na região dos promotores. Assim, a eficiência dos promotores pode variar em diversas ordens de magnitudes. Algumas das diferenças na utilização e na eficiência dos promotores estão relacionadas às RNAP holoenzimas associadas a diferentes fatores sigma em decorrência do estado fisiológico da célula.
Outra variável é que o número de complexos principais de RNAP na célula é limitado, o que resulta em uma competição entre os milhares de promotores no genoma para a ligação com a RNAP holoenzima. O balanço entre os fatores sigma, a disponibilidade de RNAP principal para a formação da RNAP holoenzima e a disponibilidade de promotores são peças importantes no controle da expressão de genes.
EUCARIOTOS
A definição de sequências comuns aos diferentes promotores é mais complexa decido a maior diversidade de genes. A definição dos promotores depende de um acúmulo de informações nos diferentes sistemas.
Em eucariotos as euRNAPs não se ligam diretamente à sequência do promotor, que primeiro é reconhecida pelos fatores de transcrição (TFs) que dirigem a ligação das euRNAPs para o início da transcrição. Em geral, os promotores de eucariotor tem uma sequência principal capaz de produzir a transcrição em nível basal, que é denominada PROMOTOR PRINCIPAL. Os promotores principais dirigem o início da trancrição.
TERMINAÇÃODA TRANSCRIÇÃO
Após o início e alongamento, o complexo RNAP deve reconhecer o terminador, cessar a incorporação de ribonucleotídeos, dissociar o complexo de transcrição liberando os fatores, a RNAP e o DNA renaturado em sua conformação original e liberar o RNA sintetizado.
A terminação é normalmente determinada por uma pausa, que é seguida pela dissociação do complexo de transcrição. 
TERMINAÇÃO EM PROCARIOTOS
Nas bactérias os sinais de terminação não dependem diretamente do reconhecimento de sequências no DNA, mas sim das sequências já transcritas no RNA. Em bactérias existem dois mecanismos gerais de terminação dependendo do complexo Rho:
Sequências no DNA determinam o fim da transcrição, provocando a desestabilização do complexo de transcrição, e o RNA sintetizado participa ativamente da terminação de sua síntese, formando estruturas secundárias ou ligando a outros fatores.
A terminação intrínseca, também denominada independente da proteína Rho ou da terminação por formação de grampo no RNA. Neste tipo de terminação uma sequência definida, localizada na região 3’ do gene, sinaliza o final da síntese do RNA. Um terminador intrínseco é reconhecido na sequência do DNA na porção 3’ terminal dos genes por conter dois componentes essenciais, uma sequência invertida repetida rica em GC e uma sequência de adeninas no DNA-molde. A terminação invertida repetida permite que o RNA nascente forme um pareamento interno a partir das bases complementares na sequência, denomado GRAMPO DE TERMINAÇÃO. O grampo é estabilizado pela região da alça e pelo pareamento GC. Quando o RNAP transcreve essa sequência ocorre a formação do grampo na molécula de RNA nascente. Essa estrutura impede espacialmente o mocimento da RNAP sobre o molde de DNA e provoca uma longa pausa no alongamento da cadeia, pois a reação de incorporação de ribonucleotídeos cessa. Essa pausa, associada a uma região de pareamento AU, entre a fita-molde de DNA e o RNA, que se segue imediatamente após a sequência do grampo, desestabiliza o híbrido DNA-RNA no centro ativo da RNAP. O pareamento AU é um dos pareamentos mais fracos formados entre DNA e RNA e somando a pausa da síntese do RNA ocasiona a desestabilização do complexo de transcrição RNAP-DNA-RNA. As “pinças” da RNAP, que a mantinham firmemente associadas ao DNA, são abertas e a RNAP perde seus contatos com o DNA, desestabilizando o complexo e liberando o RNA, o DNA ea RNAP. Logo após as fitas do DNA são renaturadas.
Um outro tipo de terminação, dependente de Rho, ocorre pela ação de um complexo hexamérico da proteína Rho. Nesses terminadores, estruturas evidentes, como as encontradas nos terminadores intrínsecos, não estão presentes na sequência de DNA. As sequências que participam desta terminação estão espalhadas ao longo de cerca de 100pb antes do último nucleotídeo a ser incorporado no RNA. Essas sequências sinalizam a pausa na transcrição e, portanto, nas regiões 3’ desses genes, a transcrição está pausada ou ocorrendo em baixa velocidade. Na ausência da proteína Rho essas sequências são inativas para a terminação e, em geral, é letal para a célula.
A proteína Rho se liga formando um anel em torno do RNA.O complexo Rho apresenta uma atividade de translocase (e de helicase) que permite ao complexo se deslocar na molécula de RNA na direção 5’3’. 
TERMINAÇÃO EM EUCARIOTOS
Sabe-se pouco sobre a terminação em eucariotos porque os RNAs sintetizados sofrem modificações significativas, denominadas pós-transcricionais, também na sua extremidade 3’.
Geralmente, antes da terminação da transcrição, o RNA nascente é clivado em sua porção 3’, portanto, as sequências que demarcam a terminação da transcrição não estão presentes no RNA sintetizado. Na maioria dos casos, regiões de simetria invertida, como em procariotos, não são encontradas. Também não encontraram proteínas relacionadas a Rho em eucariotos.
PROCESSAMENTO DE RNA
Os diferentes RNAs recém-sintetizados no processo de transcrição são chamados de TRANSCRITOS PRIMÁRIOS, PRÉ-RNAs ou PRECURSORES DE RNA. Em geral, os transcritos primários não se apresentam na forma de um RNA funcional. Assim, a forma funcional do RNA deve ser gerada após uma série de modificações pós-transcricionais, chamada de PROCESSAMENTO DE RNA. As alterações que ocorrem são do tipo adição, deleção ou modificação de nucleotídeos, ou de regiões maiores do transcrito primário. Essas alterações ocorrem tanto em procariotos como em eucariotos.
Em eucariotos, a maioria dos genes que codificam proteínas estão organizados na forma de uma série de regiões codificadoras (éxons) interrompidas por regiões não codificadoras (íntrons). Os íntrons são, portanto, sequências presentes no DNA, transcritas em RNA, mas retiradas em uma das etapas de processamento do transcrito primário, não fazendo parte do RNA final.
 tRNA
SPLICING DE ÍNTRONS DE tRNAs
Alguns genes de tRNAs podem conter íntrons.
O splicing inicia com a clivagem endonucleolítica nas extremidades 5’ e 3’, liberando-o e dividindo o tRNA em duas partes (éxons). Na etapa seguinte, os éxons são substratos para uma série de reações catalisadas por uma RNA-ligase dependente de ATP. Essa ligase é uma proteína multifuncional. Os dois éxons são mantidos juntos pela estrutura terciária (devido ao pareamento de bases) do tRNA, apesar de não estarem ainda ligados covalentemente. As sequências do éxon e a consequente estrutura tridimensional do pré-RNA são os elementos necessários para o reconhecimento e para a correta clivagem pelas endonucleases. 
PROCESSAMENTO DOS PRECURSORES DE mRNAs
As modificações do pré-mRNA envolvem a adição de CAP na extremidade 5’, a adição da cauda de poli(A) na extremidade 3’ e a remoção dos íntrons.
ADIÇÃO DE CAP NA EXTREMIDADE 5’ DE mRNAs NUCLEARES
Os mRNAs eucarióticos são modificados em sua extremidade 5’ pela adição de uma 7-metil-guanosina (a 5’-CAP) no primeiro ribonucleotídeo transcrito. É a primeira modificação a ocorrer. 
O 5’-CAP protege o RNA da ação de exonucleases que provocam a sua degradação e tem, também, ampla importância, pois promove a transcrição, a excisão dos íntros, a poliadenilação e o transporte dos mRNAs através da membrana nuclear. Só não ocorre em mitocôndrias e cloroplastos.
CLIVAGEM DA EXTREMIDADE 3’ E POLIADENILAÇÃO DE mRNAs NUCLEARES
A maioria dos eucariotos possui uma sequência de umas 200 adenina na sua extremidade 3’, chamada de CAUDA DE POLI (A). Ela não está codificada no DNA e não existe nos rRNAs e tRNAs. Ela é adicionada pela enzima poli(A)-polimerase.
Na terminação da transcrição sequências no RNA sinalizam para a clivagem e para a síntese de uma cauda de poli(A). Esse processo é mediado por um complexo de proteínas.
EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Para analisar os ácidos nucleicos é necessário isolá-los e separá-los dos outros componentes celulares. É necessário ter um bom grau de pureza, integridade e quantidade. Etapas:
Ruptura da célula para liberar o seu conteúdo (lise celular). Esta pode ser química ou física.
QUÍMICA: com detergentes ou através de osmose (colocados em solução hipotônica).
FÍSICA: através de choques mecânicos (congelamento e descongelamento, sonicação, homogeneização).
2. A lise celular precisa ser feita na presença de AGENTE QUELANTE. Uma vez que capturam íons utilizados como cofatores por proteínas que degradam ácidos nucleicos como é o caso da DNAse que precisa de íons de magnésio.
3. Precisa-se de um AGENTE TAMPONANTE, que mantém o pH, assim não havendo variações drásticas que poderiam desnaturar as moléculas em questão.
4. Purificação das moléculas. O emprego de SAIS pode ser feito para diminuir a solubilidade e, consequentemente, precipitar proteínas. Outra forma de separar as proteínas dos ácidos nucleicos é o uso da PROTEINASE K, uma enzima que degrada proteínas.
5. Faz-se a separação destas dos demais componentes celulares. Ainda usa-se SOLVENTESORGÂNICOS como o fenol para desproteinizar o DNA.
6. Etapa final: precipitação dos ácidos nucleicos! Usa-se ÁLCOOL para precipitar o DNA e ISOPROPANOL para RNA.
	
ELETROFORESE EM GEL
AGAROSE: é um polissacarídeo que dissolve em água fervente e então gelifica quando esfria. Para a preparação mistura-se o pó de agarose com a SOLUÇÃO TAMPÃO TBE. Após fundir coloca-se BROMETO DE ETÍDIO, que fará o DNA/RNA brilhar quando exposta a UV. Coloca-se o pente para criar os poços.
Etapas:
Cada molécula de proteína se liga a um grande número de moléculas detergentes (SDS) carregadas negativamente.
As moléculas migram em direção ao polo positivo (sua estrutura foi desdobrada pelo SDS). As moleculas de tamanho similares tendem a migrar na mesma velocidade.
1) Preparar uma solução de agarose (a concentração dependerá do tamanho da molécula de DNA a ser visualizada) em tampão TBE (diluído). Aquecer no microondas até a total dissolução da agarose. Esperar a solução esfriar; 
2) Esperar esfriar e adicionar Brometo de etídeo (10 mg/mL); 
3) Colocar a solução, no suporte (“cama”) de eletroforese; 
4) Colocar o pente de modo que não forme bolhas. Aguardar o gel endurecer e retirar o pente; 
5) Colocar o conjunto na cuba de eletroforese, cobrindo com o tampão; 
6) Colocar nos poços o DNA (diluído) e misturado com solução azul de bromofenol. 
7) Encaixar a tampa da cuba e os eletrodos de modo que o DNA migre do pólo negativo para o positivo; 
PCR
 
	A amostra de DNA, a enzima que faz a replicação (DNA polimerase), os nucleotídeos de DNA e os primers complementares a sequência de DNA são colocados em um tubo de ensaio.
Coloca-se o tubo de ensaio em uma máquina de PCR (máquina que aumenta e diminui a temperatura de acordo com um programa). Os passos seguintes, de aquecimento e resfriamento, acontecem dentro da máquina controlados pelo programa.
Aquece-se o tubo a 94ºC para desnaturar (separar a dupla fita) o DNA.
                
          4. Cada fita simples do DNA que foi desnaturado serve de molde para a síntese de novas cadeias               complementares. Para isso resfria-se a 54ºC onde os primers se anelam ao início das duas               fitas simples, servindo de iniciadores para a enzima polimerase.
          5. Aquece-se novamente o tubo a 72ºC (temperatura ideal de funcionamento da DNA polimerase)              para a duplicação da fita. A DNA polimerase inicia, após o final do primer, a colocar os              nucleotídeos livres na fita de DNA ligando-os por complementaridade, formando assim uma              nova fita dupla.