Apresentacao leite fermentado

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Produção de Leite Fermentado 
EQB476 – Tecnologia de Bioprocessos Experimentais – Manhã – 2017.1
INTRODUÇÃO
1925: o Japão apresentava alto índice de mortalidade infantil em virtude de um surto de infecções intestinais e desnutrição.
1930: Selecionada uma espécie de lactobacilos resistentes à acidez do estômago.
Primeira embalagem de Yakult, no Japão
1966: Yakult chega ao Brasil.
Formato do frasco plástico de Yakult seria inspirado em bonecas japonesas (Kokeshis).
Cada frasco de 80 ml do leite fermentado Yakult tradicional possui 16 bilhões de Lactobacillus casei Shirota. 
Dr. Minoru Shirota 
1935: foi desenvolvido o leite fermentado YAKULT. Primeiro alimento com microrganismos probióticos do mundo. 
CARACTERÍSTICAS DO MICRORGANISMO
Agente de fermentação: Lactobacillus casei
Bactéria probiótica;
Bactéria lática;
Microrganismo Gram-positivo;
Não possuem esporos;
Formato de bastonetes;
Não crescem a pH > 6,0;
Microaerófilicos. 
Lactobacillus casei
Fermentação Lática
Os lactobacilos executam fermentação lática, em que o produto final é o ácido lático. Para isso, eles utilizam como ponto de partida, a lactose, o açúcar do leite, que é desdobrado, em glicose e galactose. Essa glicose é transformada em piruvato na primeira etapa,chamada de glicólise. Na segunda etapa ,ocorre a trasformação do piruvato em ácido lático. Na fermentaçao lática e possível observar a diminuição do pH e também a coagulação do leite.
Reação Global da Fermentação
É importante notar que não há a formação de gás carbônico nesse tipo de fermentação.
+2 ADP+ 2 Ácido pirúvico
Glicose
2
+ 2 ATP + 2 H+ + 2 H2O
Ácido Lático
OBJETIVOS 
Escolher um bioproduto;
Utilizar de técnicas de isolamento de colônias;
Identificar e selecionar o microrganismo de interesse;
Realizar testes bioquímicos;
Quantificar a concentração microbiana e elaborar curva de calibração;
Avaliar a cinética de crescimento e produção do bioprocesso;
Produzir o leite fermentado.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Preparo de meios de cultivos;
Isolamento do microrganismo, repique e esgotamento;
Análise macroscópica e microscópica;
Testes bioquímicos (teste de assimilação de carbono e de fermentação);
Teste da catalase;
Coloração de esporos;
Peso Seco;
Curva padrão (Espectrofotometria);
Cinética de crescimento(YPL);
Quantificação de ART pelo método Somogyi.
Preparo
de
Meios
Preparo de Meios
Caldo simples;
Caldo Sabouraud;
MRS;
YPL;
Teste de assimilação de C;
Teste de fermentação.
Preparo de Meios
Caldo Simples
Composição:
(g/L)
Extrato de carne
3,0
Peptona
10,0
Na2HPO4
1,0
NaCl
5,0
H2O destilada0,5L
pH: 7,0– 7,4
CaldoSabouraud
Composição:
(g/L)
Glicose
40,0
Peptona
10,0
H2O destilada0,5L
pH: 5,5– 6,0
Bactérias
Leveduras
Preparo de Meios
Meio MRS
Composição:
(g/L)
Dextrose
20,0
Extratode levedura
5,0
Peptona bacteriológica
10,0
Extrato de carne
10,0
Acetato de sódio
5,0
Fosfato de sódio
3,75
Citratode amônia
2,0
Tween80
1,0
Sulfatode magnésio
0,2
Sulfatode manganês
0,05
H2O destilada1L
MeioYPL
Composição:
(g/L)
Extrato de levedura
5,0
Peptona
10,0
Lactose
22,5
H2O destilada0,5L
Preparo de Meios
Fermentação
Composição:
(g/L)
Extrato de levedura
3,0
Peptona
10,0
Fosfato de potássio
1,0
H2O destilada0,1L
Assimilação
Composição:
(g/L)
Sulfato de amônio
5,0
Fosfato de potássio
1,0
Sulfato de magnésio
0,5
Cloreto de cálcio
0,1
Cloreto de sódio
0,1
H2O destilada0,5L
Preparo de Meios
Autoclave
0,5 atm
20 min
Ágar
Diluições Sucessivas
Foram feitas diluições sucessivas a partir de 1mL da amostra de Chamyto para se obter as concentrações de:
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
Plaqueamento
Verteram-se em placas de Petri, de forma asséptica, os meios de cultura abaixo:
Caldo Simples;
Caldo Sabouraud;
MRS;
MRS modificado.
Todos em duplicata, exceto para MRS modificado e diluições 10-5.
Após solidificação dos meios, espalhou-se 0,1mL das amostras nas placas, com uma alça de Drigalski, que foram incubadas em estufa a 30 oC.
Análise 
Macroscópica
Análise Macroscópica	
Após o cultivo nos meios preparados, escolheram-se os microrganismos a partir da análise macroscópica de crescimento. 
Crescimento em MRS
Isolamento por Esgotamento
Em seguida, selecionaram-se as culturas que tivessem características diferentes para realizar o esgotamento e repique – Diluição de 10-4.
Teste de Esporulação
Teste colorimétrico utilizando verde de malaquita como corante primário e safranina como corante de contraste.
O teste confere cor verde aos esporos e cor vermelha as células vegetativas, podendo ser observadas ao microscópio.
Teste de Esporulação
Aspecto microscópico do Lula (esquerda) e Pezão (direita) após o teste de esporulação.
Analise Microscópica
Microscopia
Coloração de Gram
Método utilizado para diferenciar espécies bacterianas em dois grupos:
Gram-positivas (roxas) – Camada espessa de peptideoglicano e ácido teicóico
Gram-negativas (rosadas) – Camada fina de peptideoglicano e composta por proteínas, lipoproteínas, lipopolissacarídeos e fosfolipídeos
Metodologia
Procedimentos
Para tal, foram utilizados os materiais necessários: laminas de vidro, alça de platina, bico de bunsen e kit para coloração
Preparar esfregaços a partir de culturas plaqueadas;
Em uma lâmina, contendo esfregaço seco, cubra-o pingando gotas de violeta-de-metila e deixe agir por 15 segundos;
Adicione água ao esfregaço, em cima do violeta-de-metila, cobrindo toda a lâmina. Deixe agir por mais 45 segundos;
Após o tempo corrido, escorra o corante e lave o esfregaço em um filete de água corrente.  Cubra a lâmina com lugol ou Iodo de Gram e deixe por 60 segundos;
Metodologia
Escorra todo o lugol e lave em um filete de água corrente;
Aplique álcool etílico a 95%, ou acetona, para descorar a lâmina por 10 a 20 segundos;
Lave em um filete de água corrente;
Cubra toda a lâmina com safarina e deixe corar por aproximadamente 30 segundos;
Lave a lâmina em um filete de água;
Seque a lâmina com auxílio de um papel de filtro limpo ou deixe-a secar ao ar livre;
Aplique uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço e observe no microscópico com objetiva de imersão (100 X).
Microscopia - Resultados
Figura 1 – Microscopia, técnica de Gram – “Lula”
Figura 2 – Microscopia, técnica de Gram – “Pezão”
Microscopia - Resultados
Figura 3 – Microscopia, técnica de Gram – “Bolsonaro”
Figura 4 – Microscopia, técnica de Gram – “Dilma” 
Testes Bioquímicos
Teste de Assimilação de Carbono
Objetivo: avaliar o crescimento dos microrganismos tendo como substrato diferentes fontes de carbono
Resultado esperado: observar crescimento tanto em meios com pentoses como em meios com hexoses
Método:
Preparar 6 placas de meio isento de Carbono contendo extrato de levedura, peptona bacteriológica, fosfato de potássio e água destilada
Sobre o meio já sólido, espalhou-se as fontes de carbono (xilose, glicose e lactose, cada uma em duplicata)
Foram inoculados os microrganismos, que estavam em suspensão salina, cada um com os três diferentes substratos
Não houve, entretanto, crescimento em nenhuma placa!
Teste de Fermentação
Objetivo: Verificar se o microrganismo realiza fermentação, seja láctica (sem CO2) ou alcoólica (com CO2)
Resultado esperado: Verificar mudança de cor do meio sem formação de gás
Método:
Preparo do meio com água destilada, extrato de carne, peptona e indicador Púrpura de Bromocresol
Adicionar 4mL do meio em cada um de 18 tubos de ensaio contendo tubos de Durham
Adicionou-se solução de três açúcares (xilose, glicose e lactose), cada uma em 3 tubos
Introduziu-se os microrganismos de forma a obter triplicata para cada microrganismo
Resultados – teste de fermentação
Resultado do teste de fermentação – Aparição de coloração amarela
Resultado do teste de fermentação – Aparição de bolha
Construção da Curva de Peso Seco
Peso Seco
Suspensão de 
microrganismo
Adição
ao enlenmeyer
Contendo MRS líquido
Crescimento em estufa durante 7 dias 
T=37°C
Pesagem das membranas de filtração
Filtração de 30 mL de meio 
após crescimento
Exposição ao Infravermelho por 
1 minuto
Dessecador
Pesagem
Peso Seco
Membrana
Placa+Membrana (g)
Placa+Membrana+Células (g)
Células (g P.S.)
1
43,088
43,12
0,032
2
35,208
35,268
0,06
3
41,36
41,41
0,05
Média
0,04733
Desvio Padrão
0,01419
Tabela 1. Peso seco microrganismo “Lula”
Peso Seco
X (g P.S./L) = Média peso seco/Vs = 0,4733/0,03= 1,578 g P.S./L 
Através do conhecimento da concentração de células e fazendo a série de diluições demonstradas na tabela a seguir, foi possível obter uma curva padrão relacionado absorbância à concentração celular.
Peso Seco
Fator de diluição
Concentração (g P.S./L)
Absorbância (570nm)
50
0,031555556
0,145
25
0,063111111
0,282
20
0,078888889
0,3205
15
0,105185185
0,3825
Tabela 2. Diluições da solução-mãe do Lula e suas respectivas absorbâncias
Peso Seco
Peso Seco
Peso Seco
Fator de diluição
Concentração (g P.S./L)
Absorbância (570nm)
50
0,030888889
0,1555
25
0,061777778
0,298
20
0,077222222
0,3125
15
0,102962963
0,4095
Tabela 4. Diluições da solução-mãe do Pezão e suas respectivas absorbâncias
Cinética de Crescimento Microbiano
Preparo de Pré-inóculo e do Inóculo
Caldo YPL
Incubação a 37ºC
Bom crescimento do MO
Inoculação em 200 mL de YPL
40 mL do pré-inóculo 
Alçadas cheias do MO “Lula”
Incubação a 37ºC
Curva de Crescimento Microbiano
Medição de pH
Centrifugação (velocidade 4 por 10 min)
Análise de ART
Alíquota de 4,0 mL de A1 e A2
Sobrenadante
Ressuspensão em 4,0 mL de água destilada
Células centrifugadas
Diluição 
Análise espectrofotomética (570 nm) 
Construiu-se um gráfico de Concentração celular (g/L) x tempo (h) e um gráfico de pH x tempo (h). Calculou-se também a taxa específica de crescimento microbiano (µ) e o tempo de geração (Tg).
Curva de Cinética de Crescimento Microbiano A1 (Lula)
Tempo (h)
Absorvância(570nm)
Diluição
Concentração celular (g/L)
0
0,047
_
0,01190
24
0,032
2
0,01621
48
0,006
5
0,0077
72
0,122
5
0,1545
96
_
_
_
Curva de Cinética de Crescimento Microbiano A2 (Lula)
Tempo (h)
Absorvância (570 nm)
Diluição
Concentração celular (g/L)
0
0,038
2
0,01925
24
0,628
2
0,3181
48
0,359
5
0,4547
120
0,355
5
0,4496
144
0,300
5
0,3799
f = 0,2533 g/L
Curva de Crescimento Microbiano
Curva de Crescimento Microbiano
Fases de Crescimento:
 0h até 24h: fase exponencial;
 24h até 48h: fase de desaceleração;
 48h até 120h: fase estacionária;
 120h até144h: fase de morte.
Cálculo da Taxa Específica de Crescimento:
X = X0*exp(μt), como X0 = 0,01925 g/L, X = 0,3181 g/L, t = 24 horas, então:
μ = 0,1169 h-1. 
Cálculo do Tempo de Geração (Tg):
Tg = ln(2)/μ 
Tg = ln(2)/0,1169
Tg = 5,93h 
Curva de Crescimento Microbiano
Curva de pH x tempo
Tempo (h)
pH
0
6,30
24
5,23
48
4,39
120
4,44
144
4,50
Quantificação de ART pelo método Somogyi
Método Somogyi
Objetivo: Quantificação de açúcares redutores.
Soluções:
Meio a2: YPL
Solução A: Dissolver separadamente 16 g de NaHCO3 (Bicarbonato de sódio), 12 g de tartarato de sódio e potássio (sal de Rochelle), 144 g de Na2SO4 anidro, 24 g Na2CO3 anidro e completar o volume a 800 mL. 
Solução B: Dissolver 36 g de Na2SO4 anidro em 100ml de uma solução de CuSO45H2O a 4% P/V e completar o volume a 200ml com H2O destilada.
Solução C: Dissolver 25 g de (NH4)6Mo7O24H2O em 450ml de água destilada. Adicionar 21 mL de H2SO4 concentrado e misturar. Juntar uma solução contendo 3 g de Na2HASO47h2O (arseniato de sódio). Dissolvidos em 25 mL de água destilada. Homogeneizar e deixar em frasco escuro a 37°C por 1 ou 2 dias. 
Sobrenadantes do meio A2
Diluições
1:500 , 1:250 , 1:100
Tubo de follin Wu
1ml do amostra diluída + 1mL solução 4:1
Banho-maria
Resfriamento
2 mL solução C e agitação até desprender todo o gás 
Completar os tubos com água destilada a 25 mL
Absorvância 
540 nm
Procedimento
Centrifugação meio A2
* f= 0,3 g/L
f = 0,3 g/L
Curva de Consumo de Substrato
Tempo (h)
Diluição
Abs1
Abs2
Abs média (540 nm)
Concentração de ART (g/L)
0
500
0,079
0,093
0,0860
12,900
24
250
0,179
0,21
0,1945
14,588
48
100
0,400
0,451
0,4255
12,765
120
100
0,336
0,421
0,3785
11,355
144
100
0,347
0,36
0,3535
10,605
Cálculo do Fator de Conversão de Substrato em Células (Y x/s):
Y x/s = concentração de células formadas/ variação da concentração de substrato.
Y x/s = (Δx/- Δs) = (0,4547 g – 0,01925 g)/(12,765 g – 12,900 g) = 3,211 gx/gs.
Resultados - Somogyi
Conclusão
Ao analisarmos todos os dados obtidos durante o semestre, torna-se possível afirmar que o experimento foi bem conduzido, com algumas ressalvas. 
	Na parte dos testes bioquímicos, apesar de os teste de assimilação de carbono e de fermentação não terem fornecido resultados muito conclusivos, as análises macro e microscópicas puderam ser interpretadas corretamente. Tais resultados estavam condizentes com as características do microrganismo, visto que os testes de catalase e de esporos apresentaram resultados esperados. 
	Quanto as curvas, todas elas se mostraram conclusivas, com as curvas de absorbância bem lineares e as de crescimento celular/consumo de substrato mostrando o microrganismo crescendo e o substrato caindo. Além disso, a curva de pH também está de acordo com o esperado, visto que o Lactobacillus Casei libera ácido lático em sua fermentação.