Microorganismos de Interesse Industrial

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MICROORGANISMOS INTERESSE INDUSTRIAL
Principais etapas de um processo fermentativo
O sucesso de um dado processo fermentativo depende muito de uma correta
definição de quatro pontos básicos:
I. Microrganismo;
II. Meio de cultura;
III. Forma de condução do processo fermentativo;
IV. Etapas de recuperação do produto.
Pode-se mencionar que sempre se pretende empregar meios de cultura baratos,
mas o microrganismo deve
encontrar neste meio condições
adequadas para realizar a
conversão pretendida.
As operações finais para a
recuperação do produto (operações
de "downstream"), são igualmente
da mais alta importância. No
entanto, a importância de uma
adequada definição das operações
de recuperação do produto fica
mais clara quando se aborda a
produção de produtos de alto valor
agregado, como a produção de
antibióticos, enzimas, ou outras
proteínas (insulina, hormônios de crescimento, vacinas etc). Para esses casos, as
operações de recuperação do produto podem ser responsáveis por 50% a 70% do
custo do produto final.
Fontes de Microrganismos de Interesse
Recursos Naturais:
➢ O isolamento de microrganismos a partir de
recursos naturais, como solo, água, plantas etc.,
sempre foi uma atividade de grande importância para
a obtenção de novas linhagens de interesse industrial.
➢ Muito trabalho experimental, com custo
elevado, porém pode conduzir ao isolamento de
linhagens melhor produtoras de um dado produto e
pode conduzir à descoberta de novos produtos.
Compra em Coleções de Culturas:
➢ As grandes empresas produtoras de antibióticos, ou enzimas, mantêm
programas de isolamento de linhagens de recursos naturais.
➢ O isolamento de linhagens deve ter início com certas premissas, definindo-se o
que se pretende obter, pois o simples isolamento poderá levar à
disponibilidade de um número inimaginável de culturas.
➢ A compra em coleções de culturas é presentemente bastante viável, tendo em
vista a existência de muitas coleções de culturas em vários países.
➢ Agricultural Research Service Culture Collection (EUA), também conhecido
como NRRL Culture Collection
➢ Coleção de Culturas Tropical (Campinas - SP).
Obtenção de mutantes naturais:
➢ Quando uma célula prolifera, há sempre a chance do surgimento de mutantes
naturais;
➢ As alterações naturais não são interessantes do ponto de vista fermentativo;
➢ Eventualmente podem gerar linhas de interesse prático
➢ Aguardar o surgimento de mutantes naturais de interesse prático, poderá
significar o dispêndio de muito tempo
Obtenção de mutantes induzidos por técnicas convencionais:
➢ Métodos que favoreçam o surgimento de células mutadas;
➢ Ex. submeter suspensões de células ou esporos a radiação UV ou substâncias
mutagênicas;
➢ Técnica aleatória: recuperar as células sobreviventes em condições adequadas
e dirigir o isolamento
➢ Um caso bem relatado foi a significativa melhora de linhagens de Penicillium
chrysogenum para a produção de penicilina.
Obtenção de microrganismos recombinantes:
➢ Engenharia genética – Tecnologia do DNA recombinante;
➢ Obtenção de células mais produtivas ou produtores de substâncias que não
produzem naturalmente;
➢ Ex. hormônio do crescimento, insulina, vacinas.
➢ A introdução de fragmentos de DNA de certas
células em outras, via vetores como os
plasmídeos, permite a obtenção de células
alteradas geneticamente, porém de forma
muito mais dirigida do que as metodologias
convencionais anteriormente mencionadas
➢ Possível de ser executada não apenas com
microrganismos, mas com células animais e
vegetais.
CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS EM UM
MICRORGANISMO DE INTERESSE INDUSTRIAL
Elevada taxa de conversão do substrato em produto;
➔ Matéria prima = 38 -73% do custo total;
Elevada concentração do produto no substrato;
➔ Sem sofrer inibição pelo acúmulo;
Não produzir substâncias incompatíveis com o produto;
➔ Dificuldade na recuperação do produto;
Estabilidade quanto ao comportamento fisiológico;
➔ Conhecimento de suas técnicas de conservação;
➔ Manutenção da sua produção durante todas as etapas do processo
fermentativo;
➔ Tendência em otimizar o crescimento em detrimento da síntese do produto
Ex. A produção de uma enzima ou proteína utilizando uma linhagem produtora de
proteases extracelulares
Ideal: Produzir o mínimo de outras substâncias, enquanto sintetiza o composto de
interesse.
Mais nutrientes para síntese do produto; Facilidade de recuperação do produto.
Não ser patogênico;
➔ Manipulações sem riscos ambientais;
Não exigir condições de processo muito complexas;
➔ Economicidade de produção;
Não exigir meios de cultura complexos;
➔ Economia de processo produtivo;
➔ Necessidades nutricionais de um determinado microrganismo;
Permitir a rápida liberação do produto para o meio;
➔ Sem inibição por acúmulo;
➔ Separação do microrganismo;
Crescimento Microbiano:
Após a inoculação de ummeio de cultura, favorável ao desenvolvimento do
microrganismo em estudo, sob temperatura controlada e agitação adequada,
observa-se um comportamento nos valores da concentração celular.
FASE LAG OU LATÊNCIA
➢ Não há aumento significativo da
população;
➢ Células da fase estacionária encontram
-se depletadas de várias coenzimas
essenciais. Intensa atividade
metabólica
➢ Também é observada quando as
células sofrem traumas físicos ou
químicos ou quando são transferidas
de ummeio rico para outro de composição mais pobre
➢ A duração dessa fase varia principalmente com a concentração do in óculo (e .
portanto com o valor de X0 ), com a idade do microrganismo (tempo de
pré-cultivo) e com o seu estado fisiológico.
FASE LOG OU EXPONENCIAL
➢ Crescimento exponencial ;
➢ Procariotos mais rápido do que eucariotos ;
➢ É caracterizada frequentemente pelo tempo de geração tg, que é o intervalo de
tempo necessário para dobrar o valor da concentração celular
➢ Quorum sensing:
➔ Nas bactérias existemmecanismos de detecção de quórum ou seja
“densidade microbiana”, permitindo que grupos de bactérias alterem o
comportamento de maneira síncrona em resposta a mudanças na densidade
populacional e na composição de espécies da comunidade.
➔ O sistema QS regula principalmente a luminescência bacteriana, fatores de
virulência, tolerância de desinfetantes, formação de esporos, produção de
toxinas, motilidade…
➔ Em geral, as bactérias QS produzem e liberammoléculas de sinais químicos
denominadas autoindutores (AIs). Quando a bactéria detecta que as AIs
atingiram uma concentração limite, elas respondem alterando a expressão e o
comportamento de seus genes
➔ As moléculas de sinais desempenham um papel vital no QS, elas são
indicadores pelas quais as bactérias QS se comunicam e sincronizam
comportamentos particulares em uma escala populacional, ganhando assim a
capacidade de funcionar como um organismomulticelular
FASE ESTACIONÁRIA
➢ Há um balanço entre a velocidade de crescimento e a velocidade de morte do
microrganismo, ocorrendo tambémmodificações na estrutura bioquímica da
célula
➢ Escassez de nutrientes;
➢ Produtos tóxicos;
➢ Número de células que se divide é equivalente ao número de células que
morrem;
➢ Esporulação
FASE LOG - DE DECLÍNIO
➢ Processo de morte;
➢ Cai número de células viáveis
➢ O valor da concentração celular diminui a uma velocidade que excede a
velocidade de produção de células novas.
Fatores Ambientais
Temperatura
➢ Aumento da temperatura: aumento das reações químicas e
enzimáticas; aumento da taxa de crescimento ;
➢ Início do processo de desnaturação de proteínas e ácidos
nucléicos, inviabilizando a sobrevivência celular
➢ Psicrófilos: crescem em baixas temperaturas.
➢ Mesófilos: crescem em temperatura ambiente.
➢ Termófilos: crescem em altas temperaturas.
➢ Hipertermófilos: crescem em temperaturas extremamente
altas, acima de 60°C.
pH
➢ Ambientes naturais: pH de 5 a 9;
➢ Bactérias: faixa entre 7;
➢ Fungos: pH<5
➢ Acidófilas: até 5,4
➢ Alcalinófilas: a partir de 8,5
➢ Neutrófilas: entre 5,5 e 8,7 (ex: streptococcus sp)
Tensão de O2 (aeração)
➢ A variação da quantidade de oxigênio disponível
influencia os microrganismosaeróbios, aos quais é
indispensável e os facultativos, que também podem
crescer na sua ausência.
★ Aeróbio: capaz de utilizar o oxigênio em seu
metabolismo
★ Anaeróbio estrito: não é capaz. Dependendo da
concentração de oxigênio, pode danificar
moléculas importantes como o DNA, levando à morte.
★ Anaeróbio facultativo: produz ATP por respiração aeróbica se o oxigênio estiver
presente, mas é capaz de mudar para a fermentação se o oxigênio estiver
ausente.
★ Microaerófilos: organismos aeróbicos que crescem emmeios com
quantidades de oxigênio muito pequenas, inferiores àquelas encontradas no
ar. Não toleram o oxigênio ambiente.
★ Anaeróbios aerotolerantes: respiram anaerobicamente, mas que podem
sobreviver na presença de oxigênio.
OBS: Bactérias aerotolerantes não usam oxigênio para viver, mas podem existir em
sua presença. Os anaeróbios facultativos usam a fermentação para crescer em locais
sem oxigênio, mas usam respiração aeróbica em locais com oxigênio.
Crescimento
Crescimento populacional: aumento do número ou da massa microbiana;
Taxa de crescimento: variação no número ou massa por unidade de tempo;
Tempo de geração: intervalo de tempo necessário para que cada célula se
multiplique.
Medidas de Crescimento Microbiano:
Variação no número:
➔ Contagem total de células;
➔ Contagem de células viáveis
Peso de células:
➔ Massa de células
➔ Turbidimetria
Contagem total de células
➢ Câmaras de contagem ;
➢ Rápida ;
➢ Impossibilidade de distinção entre células vivas e células mortas ;
➢ Contagens errôneas – pequenas dimensões e formação de agregados celulares
Contagem de células viáveis
➢ Contagem em placa;
➢ Cada colônia normalmente é originada a partir de um organismo.
Massa de células
➢ Pode ser determinada a partir da estimativa do peso seco ou do peso úmido de
uma cultura.
➢ Este tipo de procedimento é realizado quando não é necessário determinar o
número preciso de micro-organismos presentes;
➢ Peso seco: Muito utilizado na quantificação de fungos, onde o micélio é retirado
da cultura, lavado e transferido para um frasco e submetido à secagem.
Realizam-se então sucessivas pesagens, até o momento onde não observa-se
mais variações.
➢ Este procedimento pode também ser realizado centrifugando-se a cultura e
pesando o sedimento, ou então secando-o e depois pesando.
Turbidimetria
➢ Quantificação em espectrofotômetro a 660nm uma vez que nesse comprimento
de onda, a cor geralmente parda dos meios de cultura não interfere com os
resultados ;
➢ Não permite a determinação de células viáveis
Análises Químicas:
➢ A partir da quantificação de proteínas ou de nitrogênio, ou por meio da análise
de diferentes atividades metabólicas.
➢ Ex.: A quantidade de O2 dissolvido reflete a atividade metabólica do
microrganismo durante a fermentação.
CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS DOS MEIOS DE
CULTIVO
➢ Ser o mais barato possível;
➢ Atender as necessidades nutricionais do microrganismo;
➢ Auxiliar no controle do processo pH;
➢ Não provocar problemas na recuperação do produto;
➢ Os componentes devem permitir algum tempo de armazenagem;
➢ Ter uma composição razoavelmente fixa;
➢ Não causar dificuldades no tratamento final do efluente;