Bases Cromossômicas da Hereditariedade: Citogenética Clínica

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As Bases Cromossômicas
da Hereditariedade: 
citogenética clínica
Universidade Federal do Piauí
Campus Ministro Reis Velloso – Parnaíba
Curso Biomedicina
Disciplina Genética Humana e Médica
Profa Renata Canalle
Doenças Genéticas
• Distúrbios monogênicos
• Distúrbios cromossômicos 
(perdas reprodutivas, malformações 
congênitas, retardo mental)
• Distúrbios multifatoriais
Doenças Genéticas
• Distúrbios cromossômicos 
(perdas reprodutivas, malformações 
congênitas, retardo mental)
Citogenética: é o estudo dos cromossomos e das anomalias 
cromossômicas e seus efeitos sobre os fenótipos
Citogenética clínica: é o estudo dos cromossomos, sua 
estrutura e sua herança, aplicado à prática da genética médica
Anormalidades cromossômicas – fração significativa das 
doenças genéticas (1 em cada 150 nascimentos vivos)
•Problemas precoces de crescimento e desenvolvimento (pacientes 
com malformações congênitas (cardiopatias congênitas), dismorfismos 
faciais, baixa estatura, retardo mental, genitália ambígua)
•Natimortos (0,7%) e morte neonatal (10%)
•Distúrbios da determinação e diferenciação sexual 
• Infertilidade ou abortos recorrentes (abortos recorrentes – 3% a 6%)
• Instabilidade cromossômica, História familiar, risco de tumores 
•Auxílio diagnóstico e monitorização em leucemias 
•Diagnóstico pré-implantação, pré-natal (idade avançada) e pós-natal
•Síndromes cromossômicas
Indicações Clínicas para a Análise 
dos Cromossomos
Análise citogenética
Síndrome de Down 
Síndromes Cromossômicas
Síndrome de Turner
Síndromes Cromossômicas
Um caso familial de inversão de cromossomo inv(7)(p11q21.1) foi
analisado pelos métodos de citogenética convencional e molecular. A
inversão foi transmitida do pai fenotipicamente normal, para sua filha e
seu filho. O menino tem graves anormalidades fenotípicas, incluindo
pescoço curto, deformação das orelhas, enquanto sua irmã é
saudável. O cariótipo foi analisado. Os pontos de quebra foram
detectados pela técnica de FISH, usando uma sonda centromérica e
sondas para os braços longo e curto do cromossomo 7.
Caso Clínico
Caso Clínico
Análise de Cariótipo
Cromossomos X Doença
Análise Convencional e Molecular
 1923 – 48 cromossomos (diferenciou X e Y)
 1956 – Tijo e Levan (46 cromossomos – fibroblastos)
 1956 – Ford e Hamerton (23 cromossomos – testículos)
 1959 – Lejeune ( síndrome de Down)
 1959 – Jacobs e Strong (Klinefelter e Turner)
Histórico
1960 – Moorhead (cultura de curta duração – linfócitos)
1970 – Banda Q (quinacrina mostarda)
Banda G
Banda R
Banda C
Coloração NOR
1980 – Bandas de alta resolução
1990 – Hibridização in situ (citogenética molecular)
Histórico
Ciclo Celular
Intérfase e mitose
Classificação segundo a 
Compactação da cromatina
Eucromatina
• Configuração aberta
• Transcricionalmente ativa
• Coloração uniforme
• Maior parte do 
cromossomo
Heterocromatina
• Condensada
• Transcricionalmente inativa
• Corada mais intensamente
• Heterocromatina constitutiva
DNA altamente repetitivo
• Heterocromatina facultativa
inativação de cromossomos 
inteiros (X inativo fêmea)
Cromossomos na intérfase
Identificação dos Cromossomos
• 1960 – Moorhead (cultura de curta duração – linfócitos T)
Preparações Metafásicas
Preparação Metafásica
Classificação
dos 
Cromossomos
Classificação
dos 
Cromossomos
Nomenclatura do Cariótipo Humano
Séries de normas apresentadas em vários Congressos Científicos
(1966-1971) e relatos do Comitê Internacional de Nomenclatura em
Citogenética Humana.
Os cromossomos são identificados:
• Tamanho
• Posição do centrômero
• Padrão de bandas
•1960 – Conferência de Denver (tamanho) - 46,XX 46,XY
telômero
Braço curto p
Braço longo q
cromátides
Nomenclatura do Cariótipo Humano
Grande/longo (A e B), médio (C e D), pequeno/curto (E) 
e muito pequeno (F e G)
Estrutura dos Cromossomos Humanos
Braço
curto (p)
Braço
longo (q)
satélite
(constrição primária)
(constrição secundária
ou pedículo)
•1963 – Conferência de Londres (grupos A, B, C, D, E, F, G)
46,XY 46,XX
Nomenclatura do Cariótipo Humano
Montagem do Cariótipo
Análise do Cariótipo
Cariótipo: conjunto de 
cromossomos de uma 
célula diplóide, 
característico da espécie.
Usado como sinônimo de 
cariograma: conjunto de 
cromossomos de um 
indivíduo, ordenados 
segundo a classificação 
padrão (imagem impressa).
Métodos de
Análise
Cromossomos
Métodos de
Análise
Cromossomos
Métodos de Análise dos Cromossomos
Linfócitos do Sangue Periférico Humano
Líquido Amniótico
Medula Óssea
Pele ou Tecidos de Órgãos Internos
Vilosidade Coriônica
Células e Tecidos
Cultura de Linfócitos Humanos
Coleta do sangue periférico (anticoagulante)
Preparo das culturas
Meio de cultura:
-Soro
- meio RPMI
- antibióticos
- fitoemoaglutinina
Cultura de Linfócitos Humanos
Incubadas a 37º C por 72 horas
Cultura de Linfócitos Humanos
Colchicina, centrifugação
Colheita dos linfócitos, tratamento com hipotônica e 
fixação (3 metanol:1 ácido acético)
Cultura de Linfócitos Humanos
Preparo das lâminas, coloração adequada e análise microscópica
Cultura de Linfócitos Humanos
Convencional
Bandamento
Hibridação in situ
Métodos de Análise dos Cromossomos
Coloração Convencional
Aberrações cromossômicas em linfócitos do sangue periférico humano
giemsa
Classificação pelo Bandamento
•1971 – Conferência de Paris (bandas)
G
C
Q
R
NOR
G
C
Q
R
NOR
T. Casperson et al. (técnica 
de bandamento; foi possível 
a identificação de cada par 
cromossômico pelo padrão 
característico das bandas)
região densamente 
enrolada de cromatina 
em um cromossomo
Bandamento Giemsa
•Cromossomos submetidos a digestão com tripsina – desnaturação proteínas
•Corados com Giemsa
•Padrão de bandas claras e escuras – único para cada cromossomo
•Bandas G escuras = DNA rico em bases AT (poucos genes ativos)
•Bandas G claras = DNA rico em bases GC (muitos genes ativos)
350 a 550 bandas
genoma haplóide
banda = 5-10 x 106 pb
Bandas claras: 
maioria dos pontos 
de quebra e 
rearranjo
Análise de 20 
células
Localização Cromossômica
Cromossomo 7
Centrômero
Braço longo q
Região 3
Banda 1
Sub-banda 2
Exemplo
Fibrose Cística
Localização
7 q 3 1 . 2
p
q
Centrômero: 10
Nomenclatura das bandas citogenéticas
Esta banda do cromossomo é 
chamada 3p22
Esta banda do cromossomo é 
chamada 3p22.1
Esta banda do cromossomo é 
chamada 3p21
Braço p
“petit”
Braço q
Cromossomo 3
Centrômero: 10
p10
q10
G-positiva
G-negativa
5p15.2
8q24.2
Classificação pelo Bandamento
(ISCN 2005)
Centrômero: 10
Bandamento Centrômero
Heterocromatina constitutiva
•Tratamento com hidróxio de sódio – DNA altamente repetitivo
•Coloração com giemsa
•variações na morfologia cromossômica ou coloração
heteromorfismos (diferenças de seq. de DNA satélite)
(cromossomos 1q, 9q e 16q, Yq)
Bandamento Quinacrina 
• bandas Q claras = bandas G escuras
• microscopia de fluorescência
• variações na morfologia cromossômica ou coloração
heteromorfismos (diferenças de seq. de DNA satélite)
Bandamento Reverso
•aquecimento antes da coloração
•bandas claras e escuras  reverso das G ou Q
•Ideal para regiões que se coram pouco pelo G ou Q, especialmente 
extremidades distais; fornece padrão mais fácil para analisar
Idiograma
Padrão de 
bandamento G
Idiograma: 
representação 
diagramática 
da morfologia 
cromossômica
Idiograma
•400 bandas por 
cariótipohaplóide
Classificação pelo Bandamento
• 1980 – Bandas de alta resolução – aumento na 
precisão diagnóstica
p
q
alta resolução
Pró-metáfase: bandamento G ou R
relativamente descondensado
Suspeita de pequena anomalia estrutural
•1980 – Bandas de alta resolução
metáfase
pró-metáfase
prófase
Cromossomo X
Classificação pelo Bandamento
Bandamento de Alta Resolução
Padrão de Bandas
Bandas
Bandas de Alta Resolução
400 - 550
700 - 850
Técnica bandas de alta resolução
Como conseguir bandas de alta resolução?
. Redução da concentração de colcemid / colchicina
. Redução do tempo de exposição ao colcemid / colchicina
. Usar sincronizadores do ciclo celular
Sincronizadores do ciclo celular:
. MTX (metotrexato)- bloqueia o ciclo celular, mais precisamente atua 
na fase S
Estes compostos bloqueiam o ciclo celular na mesma fase, fazendo 
com que todas as células partam para a divisão ao mesmo tempo
Citogenética Molecular
Hibridação In Situ Fluorescente – FISH
Cariótipo Espectral – SKY
Hibridação Genômica Comparativa - CGH
FISH – Fluorescence In Situ Hybridization
SKY – Spectral Karyotyping
CGH – Comparative Genomic Hybridization
Citogenética Molecular
Hibridação In Situ Fluorescente - FISH
A técnica de hibridação in situ fluorescente permite a localização física precisa de genes ou 
sequências de DNA diretamente nos cromossomos presentes nas preparações citológicas.
FISH
1. sonda de DNA marcada
2. DNA desnaturado
3. Hibridação da sonda com
o DNA do cromossomo
-Necessita de sequências conhecidas – sondas
-Hibridação de sequências complementares
Rearranjos cromossômicos; número cromossômico anormal; presença, 
ausência ou localização de um gene; duplicação; deleção específica
Menores rearranjos (resolução): na faixa de 1 milhão de pb (1 Mb)
Diagnóstico rápido 
de trissomias
Síndromes de 
microdeleções; 
duplicação
Rearranjos 
cromossômicos
Hibridação In Situ Fluorescente
• FISH – células interfásicas
líquido amniótico
• Crom. 18=azul; crom. X = 
verde; Y=vermelho
47,XX, + 18 47,XX, + 21
•FISH – cromossomos metafásicos
•Detecção de telômeros
•Sonda repetida TTAGGG
•Duas cromátides irmãs evidentes
•Fluorescência bicolor
•Síndrome de Prader-Willi
•Deleção de 15q11-q13 (SNRPN)
•Verde: centrômero 15
•Vermelho 15q distal: sonda controle
Hibridação In Situ Fluorescente
Deleções e duplicações muito 
pequenas - Síndromes de 
genes contíguos
Categorizadas por padrões 
reconhecíveis de múltiplas 
malformações e anomalias devidas à 
duplicações e deleções de vários 
genes situados próximos em um 
determinado locus.
Hibridação In Situ Fluorescente
•Translocação balanceada entre 
os cromossomos 11 e 16
•Sonda de pintura cromossomo 11
•46,XY,t(11;16)(q24;q23)
Pintura cromossômica -
Chromosome painting
Rearranjos 
cromossômicos;
Origem de cromossomos 
marcadores
•FISH de interfase em amniócitos: sondas 
centroméricas dos cromossomos 18, X e Y
•Diagnóstico de aneuploidias: 13, 18 e 21
•Diagnóstico pré-natal
Hibridação In Situ Fluorescente
Hibridação In Situ Fluorescente
•FISH em células de medula óssea: sondas de sequência única
•Específicas para um determinado local
•Detectar deleções e duplicações gênicas
•Sonda para o gene BCR/ABL ( indicação de LMC)
•A: sinais separados BCR/ABL negativos; B: sinais fundidos BCR/ABL positivo
Cariótipo Espectral (SKY)
•24 diferentes sondas multicoloridas de cromossomos
•Combinação diferente de corantes fluorescentes
•Duplicações, deleções e rearranjos (anomalias estruturais); 
anomalias numéricas 
Análise SKY de caso de LMC
Análise SKY de carcinoma de ovário
web.cc.yamaguchi-u.ac.jp/. ../E.CGH1.page.htl
Hibridação Genômica Comparativa(CGH)
As duas amostras de DNA marcadas são combinadas e hibridizadas, juntamente com
uma amostra não-marcada de DNA altamente repetitivo (Cot-1), em metáfases
humanas masculinas normais de células não cancerosas
Sondas de biotina
Fluoresceína (FITC)
digoxigenina
rodamina (TRITC)
• Usada para medir as diferenças no número de cópias ou dosagem de
um segmento cromossômico; amplificação gênica ou deleção, de todo
o genoma; não avalia rearranjos ou translocações
• Não depende do conhecimento prévio das regiões genômicas
frequentemente afetadas e de células em metáfase do tecido em estudo
• Mede a proporção de fluorescência de vermelho para verde
• O DNA adicional em células tumorais (amplificação) mostra-se em verde
• A redução na quantidade de DNA (deleção) mostra-se em vermelho
• Muito usado para síndromes de microdeleção (array CGH) e câncer 
(tumores sólidos), diagnóstico de retardo mental sem causa definida.
• Resolução: 5 a 10 Mb
Kallioniemi et al., 1992 (Science, v. 258, p. 818)
DNA de monossomia distal 18p marcado com 
verde e DNA normal marcado com vermelho
Proporção verde:vermelho = 0,5:1 (deleção 
gênica) na área da monossomia; 1:1 nas outras 
áreas (normal, coloração azul)
+ Vermelho + Verde + Vermelho + Verde
Proporção verde:vermelho: 0,5 1 2
Carcinomas pancreáticos por CGH: ganhos de DNA cromossômico em 3q, 
5p, 7q, 8q, 12p e 20q; e perdas em 8p, 9p, 17p, 18q, 19p e 21.
DNA de trissomia distal 18p marcado com 
verde e DNA normal marcado com vermelho
Proporção verde:vermelho = 1,5:1 
(amplificação gênica) na área da trissomia; 
1:1 nas outras áreas (normal, coloração azul)
Perfil de CGH - <http://amba.charite.de>
array CGH
B. lâmina apresenta um microarranjo de segmentos de DNA imobilizados (oligonucleotídeos
sintetizados, 500 bp), representando milhares de genes, ou seja, regiões específicas de todo
o genoma ( parte expressa, funcional)
array CGH
 Microarranjos contendo centenas de milhares de pequenas sondas 
de oligonucleotídeos
 Detecta deleções ou duplicações com resolução de 50 a 100 Kb, ou 
até menos, capazes de afetar um único gene
 Importantes para diagnóstico de microdeleções
 Processo altamente automatizado
 Não detecta rearranjos equilibrados
 Plataforma com painéis de 180.000 sondas