Relatório Micro Sanitária Tubos Múltiplos e Substrato Cromogênico

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Campus – Juazeiro do Norte 
Engenharia ambiental 
 
 
 
 
 
Relatório de Microbiologia Sanitária: 
Tubos Múltiplos e Substrato Cromogênico 
 
 
Alef Jakson Santos, Bacharelando em Eng. Ambiental 
Tiago Rodrigues Rocha, Bacharelando em Eng. Ambiental 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Juazeiro do Norte – CE, Março de 2018. 
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Alef Jakson Santos 
Tiago R. Rocha 
 
 
 
 
Relatório de Microbiologia Sanitária: 
Tubos Múltiplos e Substrato Cromogênico 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Relatório apresentado à disciplina de Microbiologia 
Sanitária do Curso de Bacharelado em engenharia 
ambiental 4º semestre, ministrado pela professora 
Lucilene Queiroz como critério de avaliação. 
 
 
 
 
Juazeiro do Norte 
2018. 
 
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Sumário 
1. REFERENCIAL TEÓRICO ........................................................................................... 4 
2. OBJETIVOS ................................................................................................................... 5 
 2.1 Objetivos gerais ........................................................................................................... 5 
 2.2 Objetivos específicos ................................................................................................... 5 
3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 6 
 3.1 Método dos tubos múltiplos ..................................................................................... 6 
 3.1.1 Coliformes Totais .......................................................................................... 6 
 3.1.2 Coliformes Termotolerantes ......................................................................... 7 
3.2 Método Cromogênico ............................................................................................... 7 
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................................. 7 
4.1 Resultados Tubos múltiplos ..................................................................................... 7 
4.2 Resultados Cromogênico ......................................................................................... 9 
5. CONCLUSÃO ............................................................................................................... 9 
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 9 
APÊNDICES ................................................................................................................ 10 
 
 
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1. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 
Considerando que a saúde e o bem-estar humano podem ser afetados pelas 
condições de balneabilidade; Considerando ser a classificação das águas doces, salobras 
e salinas essencial à defesa dos níveis de qualidade, avaliados por parâmetros e 
indicadores específicos, de modo a assegurar as condições de balneabilidade; 
considerando a necessidade de serem criados instrumentos para avaliar a evolução da 
qualidade das águas, em relação aos níveis estabelecidos para a balneabilidade, de 
forma a assegurar as condições necessárias à recreação de contato primário; 
(CONAMA, 2000). 
A água, tão necessária à vida humana, pode ser responsável por muitas doenças, 
quando serve de veículo para a transmissão de uma variedade de microrganismos 
resultantes da ingestão de água contaminada pelo ser humano, do emprego de água 
poluída para irrigação, pesca e recreação, ou seja, as chamadas doenças de veiculação 
hídrica (MACÊDO, 2000). Atualmente, cerca de 1,4 bilhão de pessoas não tem acesso à 
água limpa. Conforme RAINHO (1999), a cada oito segundos morre uma criança 
devido a doenças relacionadas com o uso de água contaminada, e 80% das enfermidades 
no mundo são originárias desse tipo de contaminação. A doença diarreica é a quarta 
maior causa de mortes no mundo, resultando em tomo de 3 milhões de óbitos/ano e está 
diretamente relacionada com a Êilta de saneamento (MURRAY & LOPEZ, 1997). A 
maioria delas ocorre em crianças menores de 5 anos de idade, em países em 
desenvolvimento (BERN et al., 1992). 
Relatos de contaminação de água por bactérias do grupo coliformes são muito 
frequentes. Coliformes totais incluem espécies do gênero Klebsiella, Enterobacter e 
Citrobacter, sendo Escherichia coli a principal representante do subgrupo termotolerante 
(Mattos & Silva, 2002). Zulpo et al. (2006) afirmam que os coliformes totais são 
encontrados no solo e nos vegetais, possuindo a capacidade de se multiplicarem na água 
com relativa facilidade. No entanto, os termotolerantes não se multiplicam facilmente 
no ambiente externo e ocorrem constantemente na flora intestinal do homem e de 
animais de sangue quente, sendo capazes de sobreviver de modo semelhante às 
bactérias patogênicas, atuando, portanto, como potenciais indicadores de contaminação 
fecal e de patógenos entéricos em água fresca. 
A densidades muito elevadas de microrganismos podem determinar a deterioração 
da qualidade da água, com o desenvolvimento de odores e sabores desagradáveis e a 
produção de limo ou películas, podendo também representar um risco à saúde dos 
consumidores, pois embora a maioria das bactérias da flora normal da água não seja 
considerada patogênica, algumas delas podem agir como patógenos oportunistas. 
(Precision Labs, 2011). 
Atualmente, as piscinas são locais de fácil acesso à prática de atividades físicas 
consideradas importantes para a saúde e a convivência social. A OMS (Organização 
Mundial da Saúde) considera á saúde como um estado completo de bem-estar físico, 
mental e social e não apenas um estado de ausência de doenças. Assim, a utilização de 
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piscinas combina atividades físicas e sociais, mas dependendo do tratamento da água e 
dos critérios utilizados para seleção dos usuários, propicia riscos à saúde dos banhistas, 
com a transmissão de doenças como micoses, criptosporidiose e a giardíase, entre 
outras. (Greinert, 2002). 
Vários fatores intervêm na ocorrência de doenças adquiridas nas piscinas, tais como: 
presença de microrganismos colonizados no corpo dos banhistas; poluição da água, do 
piso e dos objetos de uso dos frequentadores; diminuição da resistência orgânica do 
indivíduo pela fadiga provocada por exercícios, em intensidade, às vezes 
inconvenientes. (Mendonça & Ruff, 1977). 
No Brasil, a norma referente a qualidade microbiológica das águas para 
balneabilidade é definida pela Resolução CONAMA nº 274/2000. Esta define que: 
 Art. 2º. As águas doces, salobras e salinas destinadas à balneabilidade 
(recreação de contato primário) terão sua condição avaliada nas 
categorias própria e imprópria. 
§ 1º. As águas consideradas próprias poderão ser subdivididas nas seguintes 
categorias: 
a) Excelente: quando em 80% ou mais de um conjunto de amostras obtidas 
em cada uma das cinco semanas anteriores, colhidas no mesmo local, 
houver, no máximo, 250 coliformes fecais (termotolerantes) ou 200 
Escherichia coli ou 25 enterococos por l00 mililitros; 
b) Muito Boa: quando em 80% ou mais de um conjunto de amostras obtidas 
em cada uma das cinco semanas anteriores, colhidas no mesmo local, 
houver, no máximo, 500 coliformes fecais (termotolerantes) ou 400 
Escherichia coli ou 50 enterococos por 100 mililitros; 
c) Satisfatória: quando em 80% ou mais de um conjunto de amostras obtidas 
em cada uma das cinco semanas anteriores, colhidas no mesmo local, 
houver, no máximo 1.000 coliformes fecais (termotolerantes) ou 800 
Escherichia coli ou 100 enterococospor 100 mililitros. (BRASIL 
CONAMA, Resolução nº 274, 2000). 
 
2. OBJETIVOS 
2.1 Objetivo Geral: Identificar a presença de Coliformes Totais, Coliformes 
Termotolerantes (C. Fecais) & Escherichia Coli na água da piscina do IFCE – Campus 
Juazeiro do Norte. 
2.2 Objetivos específicos: 
➢ Coleta de água da piscina; 
➢ Acondicionamento das amostras; 
➢ Conhecer as normas para análises microbiológicas; 
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➢ Realização da análise da água. 
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
3.1 Método dos tubos múltiplos (TM) 
Material necessário 
✓ tubo de ensaio; 
✓ estante para tubo de ensaio; 
✓ tubo de Durhan; 
✓ pipeta graduada de 10 mL; 
✓ pipeta graduada de 1 mL; 
✓ bico de Bunsen; 
✓ caldo Lactosado; 
✓ caldo Lactosado Verde Brilhante Bile a 2%; 
✓ água de diluição; 
✓ estufa. 
Imagem 1. Metodologia para análise de água pela técnica de Tubos Múltiplos. 
 
 
As concentrações utilizadas foram: 100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5. A amostra 10-1 
foi pipetada 1 ml da amostra e inserida em 9 ml de água destilada, em seguida as 
concentrações 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, foi sucessivamente pipetando 1 ml da concentração 
mais alta e colocada em 9 ml de água destilada. Sempre mantendo as amostras durante a 
transferência perto do bico de Bulsen, para a não interferência de organismos externos 
aos presentes na água. Em segui foi seguida a metodologia descrita na imagem 1. 
3.1.1 Coliformes Totais: Para coliformes foi seguido o método descrito, e o meio 
utilizado foi Lactosado. 
FONTE: Yamaguchi et al, 2013. 
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3.1.2 Coliformes Termotolerantes: Para coliformes foi seguido o método descrito, e o 
meio utilizado foi A1. 
 
3.2 Método Cromogênico: Baseia-se na utilização de substrato análogo a Lactose. 
Matérias: 
✓ Substrato; 
✓ Cartela plástica estéril; 
✓ Maquina seladora; 
✓ Luz Ultravioleta (UV); 
✓ Caixa de papelão para observação. 
Imagem 2. Método cromogênio. 
 
 
 
Transferiu 120 ml da amostra bruta para um Erlemeyer, em seguida adicionou o 
substrato e transferiu para a cartela plástica estéril, onde foi selada numa maquina 
seladora. 
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES 
4.1 Resultados tubos múltiplos: Após serem inoculado as amostras (lactose para 
identificação de CT e A1 para identificação de CTT) nos tubos foram colocados na 
estufa a 35°C, em torno de 09:30h, 3h após foi verificado se havia sinais de crescimento 
microbiano para CT e CTT onde o resultado foi negativo para as duas amostras (lactose 
e A1), Após 24h de incubação a uma temperatura de 35°C na estufa, o resultado 
continuou negativo nas duas amostras, posteriormente a amostra de lactose permaneceu 
por mais 72h na estufa de 35°C e a amostra A1 foi transferida para estufa de 44,5°C 
FONTE: Google Imagens 
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onde também permaneceu por mais 72h, para as duas amostras os resultados não se 
alteraram permanecendo negativo esse método leva em torno de 48hrs para se obter o 
resultado final, porém levou 96h para obtenção dos resultados finais devido que iniciou 
a inoculação na quinta feira e no sábado e domingo não teria possibilidade de observar 
as amostras. Não houve necessidade do teste confirmativo, pois já havia negativado no 
presuntivo. 
Durante a manipulação houve erros cometidos pelos operadores, os quais foram: 
retirar a pipeta da zona de esterilidade, encostar a ponta da pipeta no jaleco; onde esses 
possíveis erros podem ter sido influenciados por microrganismos externos. Entretanto 
essa interferência não foi observada, pois para os microrganismos analisados as 
amostras não positivaram para presença dos mesmos. 
Imagem 3. Parte da tabela da FUNASA para identificação de NMT, com limite de 
confiança de 95%. 
 
 
Seguindo a tabela o número mais provável de microrganismos é menor que 2 
que ainda se encontra dentro do limite da legislação, sendo a vigente a resolução 
FONTE: FUNASA 
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CONAMA 274/2000, e também se encontram dentro da legislação pela ausência de E. 
coli. Esse resultado foi descrito, porém não passamos para o teste confirmativo por 
motivos já ditos. 
4.2 Resultado cromogênico: Após 24h observou o não desenvolvimento de cor 
concluindo que a amostra não continha CT, posteriormente submeteu a cartela a luz 
UV, onde nenhuma célula apresentou florescência evidenciando a ausência E. coli. 
 
5. CONCLUSÃO 
Pode se observar após os resultados a ausência de CT, CTT e E. coli nas amostras 
coletadas da piscina do IFCE - Juazeiro do Norte. E pôde-se concluir que a água da 
piscina se encontra dentro dos parâmetros da legislação e pode ser enquadrada em água 
excelente segundo a Resolução CONAMA n° 274/2000. Também foi possível a 
aprendizagem de técnicas de determinação microbiológicas aplicada a engenharia 
sanitária e ambiental. 
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