Coliformes fecais 01

Prévia do material em texto

Determinação de coliformes totais e fecais em águas pelo método de Tubos Múltiplos Fluorocult
Barbara da Silva das Chagas1 (IC), Daniela Borges Gonçalves2 (IC), Karina Suldovski Pilarski3 (IC), Kelly Cristina Caetano4 (IC), Stefany Espindola Hilesheim5 (IC), Daiana Cardoso de Oliveira (PS)
(1) baarbarela.bah@gmail.com, (2) daniela_borges.2010@hotmail.com, (3) kps325190@hotmail.com, (4) kellycaetano43@gmail.com, (5) stefanyhilesheim16@gmail.com.
Palavras Chave: Coliformes fecais, coliformes totais, água.
Universidade do Sul de Santa Catarina Data: 24/06/2019
	
3
Introdução
 A água é um recurso natural indispensável ao ser humano e aos demais seres vivos. É de total necessidade para a vida e essencial ao ecossistema. A qualidade necessária da água distribuída ao consumo humano é de suma importância, pois a mesma deve ser tratada, limpa e estar livre de qualquer contaminação, seja de origem microbiológica, química, física ou radioativa, não devendo, em hipótese alguma, apresentar riscos à saúde humana (SOUZA, 2000).
A qualidade da água pode ser comprometida por influente de origem inorgânica, complexos inorgânicos ou por influente orgânico como coliformes e diversos complexos derivados de esgotos domésticos e industriais. O acumulo dessas alterações pelos agentes orgânicos pode causar modificações enormes na concentração do oxigênio e nos valores referentes ao pH, com resultados irremediáveis para a vida humana (MULLER, 2001).
A qualidade da água indicada para consumo é a aquela que, cujas características físicas, químicas, microbiológicas e radioativas estão com o padrão de potabilidade não causando danos à saúde. As regras que determinam a potabilidade da água no Brasil foram estabelecidas pela Portaria de N º518, do Ministério da Saúde de 25 de março de 2004 com algumas modificações e ressalvas na Portaria de Nº 2.914 de 12 de dezembro de 2011 (BRASIL, 2000).
Segundo a Portaria nº 2914/2011, para que a água seja adequada e liberada para o consumo é necessário que os órgãos competentes pelo abastecimento de água de uma determinada localidade realizem testes pré-estabelecidos que comprovem sua viabilidade de consumo. Dentre os testes, estão inclusos aqueles que envolvem coliformes totais, coliformes termotolerantes e o Escherichia coli quantitativo e outras variáveis que envolvam aspectos físico/químicos, e em especial pH e turbidez (BRASIL, 2013). 
A mesma portaria considera a água potável, sob o ponto de vista microbiológico, quando está de acordo com a seguinte conformidade: ausência de coliformes totais e termotolerantes em 100mL de amostra de água para consumo (BRASIL, 2013).
Indicadores microbiológicos têm sido utilizados para verificar a contaminação de corpos d’água por resíduos humanos. Tipicamente são utilizados microrganismos que são encontrados em elevadas concentrações em fezes humanas. Os indicadores geralmente utilizados incluem coliformes totais e coliformes termotolerantes (SHIBATA et al., 2004). 
De acordo com Pelczar (1996), a razão da escolha do grupo de bactérias coliformes como indicador de contaminação da água deve-se aos seguintes fatores: estão presentes nas fezes de animais de sangue quente, inclusive os seres humanos; sua presença na água possui uma relação direta com o grau de contaminação fecal; são facilmente detectáveis e quantificáveis por técnicas simples e economicamente viáveis, em qualquer tipo de água; possuem maior tempo de vida na água que as bactérias patogênicas intestinais, por serem menos exigentes em termos nutricionais, além de ser incapazes de se multiplicarem no ambiente aquático; são mais resistentes à ação dos agentes desinfetantes do que as bactérias patogênicas (BRASIL, 2011). 
Os coliformes totais e coliformes termotolerantes, são bactérias que sobrevivem tanto na presença como na ausência de oxigênio (aeróbicas e anaeróbicas facultativas), que apresentam morfologia em forma de bastão, com parede celular do tipo gram-negativa, não apresentam esporos e são encontradas frequentemente na microbiota intestinal do ser humano e em animais de sangue quente, sendo que Escherichia coli é a principal indicadora de contaminação fecal humana (BARROS et al., 2015).
A técnica dos tubos múltiplos, também chamada do número mais provável, é uma maneira utilizada para as análises de águas, onde é feita uma estimativa da quantidade de colônias presente na amostra, sendo utilizada na contagem de alguns tipos de microrganismos, como coliformes fecais, coliformes totais, E. coli e Staphylococcus aureus (SILVA, 2002).
O NMP é uma estimativa feita através dos resultados relatados como positivos e negativos em uma ou mais diluições decimais da amostra, ou seja, apresentaram ou não formação de gás. Por esta técnica pode-se obter informações sobre a população presuntiva de coliformes (teste presuntivo), sobre a população real de coliformes (teste confirmativo) e sobre a população de coliformes de origem fecal (coliformes fecais) (SILVA, 2002).
Este trabalho tem como objetivo avaliar a qualidade da água de um efluente industrial pela determinação de coliformes totais e fecais utilizando o método de tubos múltiplos com Caldo Fluororocult. 
Materiais e Métodos 
Os materiais utilizados podem ser observados abaixo na Tabela 1:
Tabela 1. Materiais utilizados.
	MATERIAIS
	QUANTIDADE
	Tubos de ensaio com tampa de Polietileno
	20
	Grade para tubo
	1
	Pipeta graduada de 10 mL
	2
	Pipeta graduada de 5 mL
	1
	Proveta de 100 mL
	1
	Estufa bacteriológica
	-
	Bico de Bunsen
	-
	Lâmpada UV para microbiologia
	-
	Autoclave
	-
	Frasco para coleta de amostra
	1
Fonte: Elaboração dos autores, 2019.
Os reagentes utilizados podem ser observados na Tabela 2:
Tabela 2. Reagentes utilizados.
	REAGENTES
	QUANTIDADE
	Caldo Fluorocult LMX
	1 L
Fonte: Elaboração dos autores, 2019.
COLETA DA ÁGUA
A amostra de água foi coletada em um efluente residêncial na cidade de Águas Mornas, em uma garrafa plástica de 2 litros, no mês de junho de 2019.
Segurou-se a garrafa abaixo da superfície da água de boca para baixo, a seguir inverteu-se a posição, mantendo-a contra a correnteza, quando se processou então a coleta. 
TÉCNICA DE DETERMINAÇÃO DE COLIFORMES TOTAIS E FECAIS EM ÁGUAS
Preparou-se o caldo Fluorocult dissolvendo 17g em 1 litro de água deionizada. Pipetou-se 10 mL do caldo em cada um dos 19 tubos de ensaio. Em seguida, esterilizou-se com a tampa em autoclave por 15 minutos a 121°C. Foi esterilizado também 1 litro de água deionizada, bem como os materiais que foram utilizados. 
Agitou-se o frasco que continha a amostra e adicionou-se, por meio de uma pipeta esterilizada, 1 mL, da água em exame, em cada um dos 5 tubos da 1ª fileira. Flambou-se o frasco e cada tubo antes e depois da inoculação. Repetiu-se esse procedimento sempre que se fez esta operação. 
Diluiu-se a água em exame, pipetando-se 10 mL e diluindo para 100 mL em uma proveta. Foi descartado o restante da água em exame, e retornou-se ao frasco os 100 mL diluídos, agitando-se bem.
Com o auxílio de uma pipeta esterilizada de 5 mL, adicionou-se 1 mL da amostra diluída, em cada um dos próximos 5 tubos de ensaio da 2ª fileira. Estes tubos foram semeados com 0,1 mL da água em exame. Pipetou-se 10 mL da água diluída anteriormente e completou-se para 100 mL em uma novamente. Descartou-se a água em exame, e retornou-se ao frasco os 100 mL diluídos e agitou-se bem. Foi pipetado 5 mL dessa diluição e foi adicionado 1 mL em cada um da nova série dos 5 tubos da 3º fileira. Estes foram semeados com 0,01 mL da água em exame. Fez-se uma nova diluição, e foi pipetado 10 mL da diluição anterior e completou-se a 100 mL em uma proveta. Descartou-se a água em exame, e retornou-se ao frasco os 100 mL diluídos e agitou-se bem. Por último, pipetou-se 5 mL da nova diluição e adicionou-se 1 mL em cada um dos próximos 4 tubos da 4ª fileira. Estes foram semeados com 0,001 mL da água em exame.
Em seguida, incubou-se os tubos na estufa bacteriológicadurante 24 horas à 35 – 37°C. Anotou-se os resultados, para cada um dos tubos, em cada série. 
Resultados e Discussão
No teste de coliformes totais e fecais, foi usada água de córrego, encaixando-se na classe 3, conforme diz o CONOMA. Foi usado o método dos tubos múltiplos, com as amostras diluídas em 1; 0,1; 0,01; e 0,001mL, sendo analisados após 48 horas em cultura.
Na tabela 3 estão demostrados quais tubos acusaram presença de coliformes totais e fecais com sinal positivo e os que não acusaram com sinal negativo, sendo os coliformes totais identificados a partir da turbidez da água.
Tabela 3. Presença de coliformes nos tubos múltiplos Florocult.
	Diluição da amostra
	Coliformes totais em 48 horas
	Coliformes fecais em 48 horas
	1 mL
	+
	-
	
	+
	-
	
	+
	-
	
	+
	-
	
	+
	-
	0,1 mL
	+
	-
	
	+
	-
	
	+
	-
	
	-
	-
	
	-
	-
	0,01 mL
	+
	-
	
	-
	-
	
	-
	-
	
	-
	-
	
	-
	-
	0,001 mL
	-
	-
	
	-
	-
	
	-
	-
	
	-
	-
	
	-
	-
Fonte: Elaboração dos autores, 2019.
O NMP (Número Mais Provável) de Coliformes Totais e Fecais pode ser calculado a partir da Tabela 4.
Tabela 4. NMP para as combinações usadas
	Nº de tubos dando reação positiva
	NMP índice por 100mL
	Limite de NMP
	5 de 1mL
	5 de 0.1mL
	5 de 0,01mL
	
	Inferior
	Superior
	0
	0
	0
	-
	-
	-
	5
	3
	1
	110
	31
	250
	Como foram usados diluições de 0,1; 0,01 e 0,001mL, lê-se na tabela e multiplica-se o valor lido do NMP índice por 100mL por 100.
	Ou seja, para Coliformes Totais: 
Os valores de NMP calculados a partir do quadro em anexo, de acordo com a Tabela 3, resultou em 1100 de coliformes totais para cada 100 mL de amostra – No quadro o resultado indicado é 110, sendo este multiplicado por 10 devido à diluição – e 0 para coliformes fecais.
A água do córrego não apresentou coliformes termotolerantes, sendo o máximo permitido de 1000 coliformes fecais por 100 mL de amostra (BRASIL, 2005). Portanto, o contato com a água não é prejudicial à saúde humana, porém não pode ser consumida pois 45% das amostras apresentaram turbidez que pode indicar a presença de outros tipos de bactérias, não podendo ser destinada ao consumo humano (BRASIL, 2013).
A confirmação da ausência de coliformes fecais se deu sob a submissão das amostras à lâmpada UV para microbiologia. Quando há presença de bactérias provenientes de um organismo de sangue quente, ela apresenta cor fluorescente decorrente do uso do reagente Fluorocult (BILOTTA; DANIEL, 2012). As amostras não apresentaram fluorescência.
Conclusão
Á amostra de água colhida de córrego do município de Águas Mornas apresentou 0 NMP para coliformes fecais, e 1100 NMP/100 mL de coliformes totais, estando dentro da faixa de limite de totais de NMP, não sendo prejudicial à saúde dos moradores da região que tem contato próximo ao córrego. Porém, devido à sua turbidez, ela pode apresentar outros tipos de bactéria, que mesmo não sendo originárias de sague quente, não é adequada para o consumo humano de acordo com a legislação.
Referências
BARROS, D. J.; MARQUES, A. K.; MORAIS, P. B. Avaliação ambiental com base em indicador microbiológico de balneabilidade no município de Palmas-TO. Rev. J. Bioen. Food Sci, v. 2, n. 4, p. 172-177, 2015.
BILOTTA, P.; DANIEL, L.A. Utilização de lâmpadas germicidas na desinfecção de esgoto sanitário. Departamento de Hidráulica e Saneamento (EESC/SHS), Universidade de São Paulo (USP), São Carlos, SP , São Paulo, 2012.
BRASIL, 2005. Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA). Resolução n.º 357 de 17 de março de 2005.
BRASIL, Ministério da Saúde: Fundação Nacional de Saúde. Manual prático de análise de água. 4ª ed., 150 p, Funasa, 2013.
BRASIL. Ministério da Saúde. Agencia Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução n. 54, de 15 de junho de 2000. 
BRASIL. Portaria 2.914, de 12 de dezembro de 2011. Dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade. Brasília, DF: Governo Federal, 2011.
MULLER, S. Gestão Ambiental de Recursos Hidrícos. Belo Horizonte: Ecolatina. 2001.
PELCZAR, M. J. Microbiologia Conceitos e Aplicações. pág. 352. 2ª Ed – São Paulo: Makron Books, 1996.
SHIBATA, T.; SOLO-GABRIELE, H. M.; FLEMING, L. E. et al.; Monitoring marine recreational water quality using multiple microbial indicators in an urban tropical environment. Water Research. Vol. 38, 2004. p. 3119-3131.
SILVA, M. C. Avaliação da qualidade microbiológica de alimentos com a utilização de metodologias convencionais e do sistema simplate. 2002. Tese (Mestre em Ciências) – Escola Superior de Agricultura, Universidade de São Paulo, 2002, Piracicaba. Disponível em http://www.teses.usp.br/. Acesso em: 23 de junho de 2019.
SOUZA, D. A. Desenvolvimento de metodologia analitica para determinação de multiresíduos de pesticidas em águas de abastecimento de São Carlos – SP. 2000. 109 f. Dissertação (doutorado em ciências da engemharia ambiental). Escola de engenharia de são Carlos, Universidade de são Paulo, São Carlos, 2000).
ANEXOS
Quadro 1. NMP para várias combinações
Fonte: Aulas práticas de análises físico-químicas, Profª Daiana Cardoso de Oliveira, 2017.