Aula 8 - Métodos de Coloração (aula_8_metodos_de_coloracao.pdf)

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Métodos de Coloração 
Prof.: Daniela Pontes 
Introdução 
• Como é difícil observar as bactérias ao 
microscópio, pela sua transparência, a utilização 
de corantes é extensamente empregada em 
Microbiologia. 
• Os processos de coloração são usados para 
evidenciar a estrutura geral, ou alguma 
particularidade da estrutura dos 
microrganismos, auxiliando sua identificação. 
Introdução 
• Coloração: corar os microrganismos com um 
corante que enfatiza certas estruturas. 
* Antes que os microrganismos possam ser corados, 
devem ser fixados. 
• Fixação: aderência dos microrganismos à lâmina 
do microscópio. 
- Mata os microrganismos, 
- Fixa os microrganismos na lâmina, 
- Preserva várias partes dos micróbios em seu 
estado natural com apenas uma distorção mínima. 
- Um filme delgado de 
material contendo os 
microrganismos é espalhado 
na superfície da lâmina 
(esfregaço). 
- O esfregaço é deixado secar 
ao ar, ou passa-se várias 
vezes sobre a chama do bico 
de Bunsen  fixação. 
Introdução 
• A secagem ao ar e a chama fixam os os 
microrganismos na lâmina. 
• A coloração é aplicada e lavada com água. 
• Seca-se a lâmina com papel absorvente. 
• Sem a fixação, a coloração poderia lavar os 
micróbios da lâmina. 
Introdução 
Corantes: 
• São sais compostos de um íon positivo e um íon 
negativo, um dos quais é colorido e é conhecido 
como cromóforo. 
• A cor dos corantes básicos está no íon positivo. 
Ex.: violeta de genciana, azul de metileno, verde malaquita e 
safranina. 
• A cor dos corantes ácidos está no íon negativo. 
Ex.: eosina, fucsina ácida e nigrosina. 
Introdução 
Corantes: 
• As bactérias são levemente carregadas negativamente 
em pH 7; por isso, o íon positivo colorido de um corante 
básico é atraído à célula bacteriana carregada 
negativamente. 
• Os corantes básicos são mais usados que os ácidos. 
• Os corantes ácidos não são atraídos pela maioria das 
bactérias, pois os íons negativos do corante são 
repelidos pela superfície bacteriana. 
A coloração cora o fundo. 
COLORAÇÃO 
NEGATIVA 
Introdução 
Coloração Negativa: 
• Importante na observação da forma geral da célula, 
tamanho e cápsula, pois a célula torna-se bem visível 
contra um fundo escuro contrastante. 
• As distorções no tamanho e da forma da célula são 
minimizadas, pois a fixação pelo calor não é necessária 
e as células não captam a coloração. 
Coloração Negativa: 
Introdução 
Coloração de cápsula. (A) Esquema 
ilustrando o resultado da técnica de coloração 
de cápsula. (B) Fotomicrografia de bactéria 
encapsulada que foi corada a partir da 
técnica de coloração de cápsula. A coloração 
da cápsula é um exemplo de técnica de 
coloração negativa. Observe que as células 
bacterianas e o plano de fundo se coram, 
mas as cápsulas não. As cápsulas são 
observadas como “halos” não corados ao 
redor das células bacterianas. 
Introdução 
• As colorações podem ser: 
- Simples: uma única solução é empregada com o intuito de 
contrastar o corpo bacteriano com o fundo de observação. 
Ex.: azul de metileno e safranina que permitem distinguir a morfologia geral 
da célula. 
- Diferencial: utilizam mais de uma solução corante e 
permitem distinguir partes de uma célula, discriminar uma dada 
espécie ou grupos determinados. 
- Especial: usadas para corar e isolar partes específicas dos 
microrganismos (ex.: endosporos, flagelos, cápsulas). 
COLORAÇÕES SIMPLES 
Colorações Simples 
• É uma solução aquosa ou alcoólica de um único corante 
básico. 
• Objetivo: destacar todo o microrganismo, para que a 
forma celular e as estruturas básicas fiquem visíveis. 
• Etapas: 
1. Fixação 
2. Coloração 
3. Lavagem 
4. Secagem 
5. Exame ao microscópio 
Colorações Simples 
• Exemplos: azul de metileno, carbolfucsina, violeta de 
genciana, safranina. 
 
* Mordente: substância química adicionada à solução do 
corante para intensificar a coloração. 
Funções: 
- Aumentar a afinidade de uma coloração a uma 
amostra biológica; 
- Revestir uma estrutura (ex. flagelo) para torná-la 
mais espessa e mais fácil de ver após ser corada. 
COLORAÇÕES DIFERENCIAIS 
Colorações Diferenciais 
• Utilizam mais de uma solução corante e permitem 
distinguir partes de uma célula, discriminar uma dada 
espécie ou grupos determinados. 
• Os corantes diferenciais reagem de modo distinto com 
tipos diferentes de bactérias. 
 
 
• Os mais utilizados são: 
- Coloração de Gram 
- Coloração álcool-ácido resistente. 
Podem ser utilizados para diferenciá-las. 
Método de Gram 
• Coloração mais importante e mais amplamente 
utilizada. 
• Foi descrita por Hans Christian Gram (bacteriologista) 
em 1884, na Dinamarca. 
• O autor procurava uma forma de caracterizar 
pneumococos do tecido pulmonar de pacientes mortos 
de pneumonia. 
• Um dos procedimentos mais úteis, pois classifica as 
bactérias em dois grandes grupos: 
 Gram-positivas Gram-negativas 
Método de Gram 
• Nesta técnica, o esfregaço fixado recebe o 
seguinte tratamento: 
1. Solução de cristal violeta. 
2. Solução de lugol: atua como mordente (fixador do 
corante). 
3. Solução de etanol: é o passo crítico da diferenciação, 
já que um grupo de bactérias sofre descoloração pelo 
álcool e outro, não. 
4. Solução de safranina (ou fucsina). 
Método de Gram 
No final da coloração, as bactérias apresentam-se 
roxas ou vermelhas. 
 
Retêm o complexo violeta-
lugol e não se descolorem 
pelo etanol. 
Bactérias Gram-positivas 
Não conservam a 
coloração do complexo 
violeta-lugol. 
* A cor vermelha é devido ao 
corante de fundo (safranina). 
Bactérias Gram-
negativas 
Método de Gram 
As etapas da 
coloração de 
Gram. 
(coloração primária: 
impregna todas as 
células) 
Lavagem Lavagem 
Lavagem  secagem 
com papel  M.O. 
(agente descolorante) 
GRAM-POSITIVAS 
GRAM-NEGATIVAS 
Micrografia de bactérias coradas pelo Gram. Os bastonetes e os cocos (violeta) são gram-
positivos e os vibriões (rosa) são gram-negativos. 
Método de Gram 
 
A coloração de Gram é, geralmente, o 
primeiro passo dado no sentido da 
identificação de bactérias, possibilitando sua 
inclusão em um desses dois grandes grupos e 
permitindo ainda a visualização das células e 
dos possíveis agrupamentos formados. 
COLORAÇÕES ESPECIAIS 
Colorações Especiais 
• Usadas para corar e isolar partes específicas dos 
microrganismos (ex.: endosporos, flagelos, cápsulas). 
 
• Tipos: 
- Coloração Negativa para Cápsulas 
 
- Coloração para Endosporos (esporos) 
 
- Coloração dos Flagelos 
5μm 
A seta evidencia endosporos 
centralmente localizados. 
A coloração da cápsula fornece um fundo 
contrastante; assim, as cápsulas 
apresentam-se como áreas claras 
circundando as células coradas. 
Os flagelos são mostrados como 
extensões ondulantes das extremidades. 
Em relação aos corpos das células, os 
flagelos são muito mais espessos que o 
normal, pois camadas da coloração se 
acumularam devido ao tratamento da 
amostra com um mordente. 
Bibliografia 
• TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 8. ed. 
Porto Alegre: Artmed, 2005. 
• BARBOSA, H. R.; TORRES, B. B. Microbiologia Básica. São Paulo: 
Editora Atheneu, 2005.