Aula Radicais livres e antioxidantes

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Radicais livres e antioxidantes
Disciplina de Bioquímica II – 2018/1
Carla Camila Bazi
Programa de pós graduação em Ciência e Tecnologia Ambiental
O que são radicais livres?
De maneira simples, o termo radical livre refere-se a átomo ou molécula altamente reativo, que contêm número ímpar de elétrons em sua última camada eletrônica.
O que sãO Rl’s
São formados em um cenário de reações de óxido-redução, isto é, ou cedem o elétron solitário, oxidando-se, ou recebem outro, reduzindo-se.
 rl’s
Camadas e subníveis
Formação do superóxido a partir de O
O 
O2 
O2¯ 
 Fontes
Fontes endógenas de radicais livres:
Reação de oxidação na mitocôndria, fagocitose durante o processo de inflamação, ativação do metabolismo do ácido araquidônico;
Enzimas que podem indiretamente produzir espécies reativas. Ex.: enzima xantina oxidase e a enzima óxido nítrico sintase;
Processos isquêmicos e pós-isquêmicos
Os radicais livres podem ser gerados no citoplasma, nas mitocôndrias ou na membrana e o seu alvo celular (proteínas, lipídeos, carboidratos e DNA) está relacionado com o seu sítio de formação (Anderson, 1996; Yu & Anderson, 1997). 
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 fontes
Fontes exógenas de radicais livres:
Radiação ultravioleta –em especial o UVA que reage com fotossensibilizadores e com cromóforos da pele como a melanina);
Pesticidas;
Poluição;
Fumaça de cigarro;
Medicamentos antitumorais e;
Estilo de vida não saudável.
Espécies reativas
As espécies reativas são átomos, moléculas, ou íons derivados do oxigênio, que em sua grande maioria possuem alta reatividade e constituem três classes de compostos: espécies reativas de oxigênio (EROs), espécies reativas de enxofre (EREs) e espécies reativas de nitrogênio (ERNs).
Martelli e Nunes, 2014
A geração de espécies reativas dentro de certos limites é fundamental para manter a homeostase celular, tendo um papel como mensageiros em vias de sinalização de insulina, hormônio de crescimento, citocinas, entre outras vias, como as vias que regulam a atividade das enzimas antioxidantes e até mesmo controlar a expressão de alguns grupos de genes, como genes envolvidos no metabolismo mitocondrial
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Radical superóxido (O2¯ ˙) 
Radical hidroperoxila (HO2 ˙)
Radical hidroxila (OH˙)
Peróxido de hidrogênio (H2O2)
Oxigênio singlet (¹O2)
Radical alcoxil (RO ˙)
Radical peroxil (ROO ˙)
Hidroperóxido orgânico (ex.: lipoperóxido) (ROOH)
Carbonila excitada (RO ˙)
Radicais Nitro (NO)
Entre as principais formas reativas de oxigênio o O2- apresenta uma baixa capacidade de oxidação, o OH . mostra uma pequena capacidade de difusão e é o mais reativo na indução de lesões nas moléculas celulares. O H2O2 não é considerado um radical livre verdadeiro, mas é capaz de atravessar a membrana nuclear e induzir danos na molécula de DNA por meio de reações enzimáticas (Anderson, 1996).
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Radical superóxido (O2¯ ˙) 
Ocorre em quase todas as células aeróbicas e é produzido durante a ativação máxima de neutrófilos, monócitos, macrófagos e eosinófilos (FERREIRA e MATSUBARA, 1997).
Radical hidroxila (OH˙)
É considerada a mais reativa em sistemas biológicos. A combinação extremamente rápida do OH˙ com metais ou outros radicais no próprio sítio onde foi produzido confirma sua alta reatividade (FERREIRA e MATSUBARA, 1997).
Baixa permeabilidade
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Peróxido de hidrogênio (H2O2)
Apesar de não ser um radical livre, pela ausência de elétrons desemparelhados na última camada, o H2O2 é um metabólito do oxigênio extremamente deletério, porque participa da reação que produz o OH ˙ (FERREIRA e MATSUBARA, 1997).
Oxigênio singlet (¹O2)
É forma excitada de oxigênio molecular e não possui elétrons desemparelhados em sua última camada, mas spins desemparelhados. 
O ¹O2 tem importância em certos eventos biológicos, mas poucas doenças foram relacionadas à sua presença (FERREIRA e MATSUBARA, 1997).
Terapia foto dinâmica :Quando à administração tópica ou sistêmica de um agente fotossensibilizador (FS) não tóxico, seguido da irradiação num comprimento de onda adequado. O FS reage com as moléculas de oxigênio da célula, levando a produção de radicais livres, ou transferência de energia ou oxigênio, levando a produção de oxigênio singleto, causando desordem na parede celular e danos no DNA induzindo a morte celular e destruição do tecido doente
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ÍONs metálicos NA FORMAÇÃO DAS Ero’s e RL´S
Alguns metais, como o Ferro e Cobre, têm ação catalítica nas reações que levam a lesões oxidativas. Chamadas de reações de Fenton e de Haber-Weiss.
ÍON metálicos 
Reações de Fenton:
 Traumatismo craniencefálico:
A liberação do ferro intracelular;
 Baixa capacidade liquórica de ligação ferro-proteína;
Deficiência de enzimas antioxidantes no sistema nervoso central ampliam os riscos de lesão induzida pelo trauma.
ÍON metálicos 
Reações de Haber-Weiss.
Síndrome da reperfusão pós-isquemia
Excesso de Fe+++, catalisando a reação de Haber-Weiss, promove o acúmulo de ERO, dentre elas o OH ˙.
 O excesso de OH ˙ estimula a lipoperoxidação de membranas.
Nos tecidos pós-isquêmicos, existe um acúmulo de xantina-oxidase a qual, em vez da NADPH, utiliza o O2, fornecida pela reperfusão como aceptor final de elétrons. Na reação da hipoxantina-xantina, os elétrons são transferidos para o O2, gerando o radical superóxido (O2-), que espontaneamente ou por ação enzimática (reação com superóxido dismutase - SOD), sofre dismutação em peróxido de hidrogénio (H2O2). A reação entre o H2O2 e O2- origina "in vivo" o radical hidroxil (OH-), como foi descrito por Haber-Weiss. Na presença de certos metais de transição (Fe2+, Cu1+, Co2+), o OH- pode ser formado mais rapidamente.
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ÍON metálicos
Íons Cobre, Manganês e Zinco importantes para a superóxido desmutase (SOD)
A dismutação catalisada pela SOD do
 superóxido pode representar-se como
 as seguintes semirreacções:
Onde M pode ser substituído por:
Cu, Mn, Fe, Ni
SOD1 encontra-se no citoplasma, SOD2 nas mitocôndrias e SOD3 no líquido extracelular. SOD1 e SOD3 contêm cobre e zinco, enquanto que SOD2 tem manganês no seu centro reactivo.
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lipoperoxidação
O processo de peroxidação lipídica é iniciado pela reação de um radical livre com um ácido graxo insaturado e propagada por radicais peroxila. 
Resulta na formação de hidroperóxidos lipídicos e aldeídos:
Malonaldeído
 4-hidroxinonenal
Isoprostanos
que podem ser detectados em amostras biológicas e utilizados para se avaliar o estresse oxidativo (LIMA; ABDALLA, 2001).
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lipoperoxidação
Autoxidacão, que é o principal mecanismo de oxidação dos óleos e gorduras e está associada à reação do oxigênio;
Reação em cadeia, representada pelas etapas de iniciação, propagação e terminação. 
A reação acima inicia-se com o seqüestro do hidrogênio do ácido graxo polinsaturado (LH) da membrana celular. Tal seqüestro pode ser realizado pelo OH . ou pelo LO . (radical alcoxila), com conseqüente formação do L . (radical lipídico). Na primeira equação de propagação, o L . reage rapidamente com o O2, resultando em LOO . (radical peroxila), que, por sua vez, seqüestra novo hidrogênio do ácido graxo polinsaturado, formando novamente o L . na segunda equação de propagação. O término da lipoperoxidação ocorre quando os radicais (L . e LOO . ) produzidos nas etapas anteriores propagam-se até destruirem-se a si próprios. 
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LIPOPEROXIDAÇÃO
Peroxidação lipídica = alterações na estrutura e na permeabilidade das membranas celulares.
Há perda da seletividade na troca iônica e liberação do conteúdo de organelas, como as enzimas hidrolíticas dos lisossomas;
 E formação de produtos citotóxicos (como o malonaldeído), culminando com a morte celular.
PORÉM, subprodutos da lip. tem papel importante na formação das prostaglandinas
Todos os componentes celulares são suscetíveis à ação das ERMO, porém a membrana é um dos mais atingidos em decorrência da peroxidação lipídica,
As prostaglandinas são ácidos graxos modificados, frequentemente derivadosde lipídios da membrana plasmática. Hoje sabemos que são produzidas e liberadas pela maior parte das células do corpo (se não todas), tanto em homens quanto em mulheres, diretamente para o fluido intersticial (que banha todas as células), funcionando como reguladores locais e afetando as células circundantes de várias maneiras.
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lipoperoxidação
A lipoperoxidação pode ser catalisada por íons ferro, por conversão de hidroperóxidos lipídicos (LOOH) em radicais altamente reativos (alcoxila, LO˙e peroxila, LOO˙), que, por sua vez, iniciam nova cadeia de reações, denominada ramificação. 
Necessária relação equimolar Fe+++ : Fe++ no meio, para que ocorra a lipoperoxidação.
Rapidas ou lentas dependendo da cadeia de valencia do ferro
O radical hidroxila (OH. ) é freqüentemente reconhecido como a espécie iniciadora e a mais importante da lipoperoxidação10. Entretanto, estudos recentes indicam que o ferro também desempenha papel determinante na iniciação deste processo, sendo necessária uma relação equimolar Fe+++ : Fe++ no meio, para que ocorra a lipoperoxidação19,20.
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Doenças relacionadas
Envelhecimento;
Câncer;
Aterosclerose;
Inflamações crônicas;
Artrite ;
Disfunção cerebral; 
Cardiopatias ;
Diabetes;
Enfisema ;
Catarata ;
Esclerose múltipla ;
 Doenças do sistema imune;
O que são antioxidantes
Mecanismo criado para controlar os radicais livres.
Qualquer substância que, presente em baixas concentrações quando comparada a do substrato oxidável, atrasa ou inibe a oxidação deste substrato de maneira eficaz (Sies & Stahl, 1995).
De uma maneira geral, os antioxidantes solúveis em água reagem com oxidantes no citosol celular e no plasma sanguíneo, enquanto antioxidantes solúveis em lípidos protegem as membranas celulares da peroxidação dos lípidos
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O que são antioxidantes
Os antioxidantes solúveis em água reagem com oxidantes no citosol celular e no plasma sanguíneo, enquanto antioxidantes solúveis em lípideos protegem as membranas celulares da lipoperoxidação.
antioxidantes
Podem ser classificados como
Enzimáticos 
Não enzimáticos
antioxidantes
Três passos da barreira antioxidante
Wu et al. (2013a) definiram as três linhas de ação dos mecanismos endógenos:
1ª preventiva - defesa na prevenção de reações que levam à formação de espécies reativas;
2ª reparação - interrompem as reações de oxidação radical; 
3ª inativação - inativadores dos produtos das reações dos radicais livres, reparando ou eliminando os danos.
A primeira linha é composta de moléculas enzimáticas e não enzimáticas, como a superóxido dismutase, que desprotoniza o ânion superóxido, catalase, glutationa peroxidase, peroxiredozinas (enzimáticas), mas também ceruloplasmina, ferritina, transferrina e albumina (não enzimática). A segunda linha é estritamente não enzimática e inativa rapidamente as reações, incluindo vitaminas, cofatores enzimáticos, compostos organosulfurados e compostos não proteicos de nitrogênio. A terceira linha, que envolve mecanismos de reparo causados por ROS, RNS e RSS, possui antioxidantes enzimáticos que reparam DNA e proteínas danificados, além de combater lipídios oxidados e a propagação de cadeias radicais peroxil lipídicas em células e membranas.
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Antioxidantes
Todos os antioxidantes seguem um dos sete mecanismos de ação, que variam com o tipo de oxidantes:
 Sequestro de radicais livres do meio; 
Quelação de íons metálicos;
Inibição de enzimas produtoras de radicais livres;
Ativação de enzimas antioxidantes endógenas;
Prevenção da peroxidação lipídica; 
Prevenção de danos no DNA; 
Prevenção da modificação de proteínas e destruição de açúcar.
antioxidantes
Níveis de proteção
Antioxidantes preventivos: reprimir a formação de radicais livres
Decomposição não radical de hidroperóxido e peróxido de hidrogénio:
Catalase
Glutationa peroxidase (celular)
Glutationa peroxidase (plasma)
Peroxidase
Glutationa S-transferase
Fosfolipídeo hidroperóxido glutationa peroxidase (PHGSH-Px)
antioxidantes
Níveis de proteção
Antioxidantes preventivos: reprimir a formação de radicais livres
Quelação por sequestro de metais
Transferrina, lactoferrina
Haptoglobina
Hemopexina
Ceruloplasmina
A hemopexina é uma proteína que liga o grupo heme com elevada afinidade. A sua função é captar o heme liberado ou perdido pela reciclagem das hemoglobinas e proteger o corpo dos danos que a oxidação do heme poderiam provocar.
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antioxidantes
Níveis de proteção
Antioxidantes preventivos: reprimir a formação de radicais livres
extinção de espécies de oxigênio ativo
Superóxido dismutase (SOD)
Carotenoides, vitamina E
antioxidantes
Níveis de proteção
Antioxidantes de eliminação radical: eliminam os radicais inibindo a cadeia de iniciação e quebra da cadeia de propagação
Hidrofílicos: Vitamina C, ácido úrico, bilirrubina, albumina
Lipofílicos: Vitamina E, ubiquinol, carotenoides, flavonóides
antioxidantes
Níveis de proteção
Reparo e de novo enzimas: reparar o dano e reconstituir as membranas
Lipases
Proteases, 
Enzimas de reparo de DNA
Transferases
Enzimas de novo: produzidas em maior quantidade como respostas a maior demanda pelo organismo
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antioxidantes
 Lugar e concentração certa
 Stresse oxidativo
 E
 V
 I
 T
 A
 R
Bom desempenho 
A importância concernente ao desempenho dos antioxidantes in vivo depende dos fatores: tipos de radicais livres formados; onde e como são gerados esses radicais; análise e métodos para a identificação dos danos, e doses ideais para obter proteção. 
A vitamina C, por exemplo, atua na fase aquosa como um excelente antioxidante sobre os radicais livres, mas não é capaz de agir nos compartimentos lipofílicos para inibir a peroxidação dos lipídeos. Por outro lado, estudos in vitro mostraram que essa vitamina na presença de metais de transição, tais como o ferro, pode atuar como uma molécula pró- -oxidante e gerar os radicais H2 O2 e OH· . Geralmente, esses metais estão disponíveis em quantidades muito limitadas e as propriedades antioxidantes dessa vitamina predominam in vivo
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Estresse oxidativo
Excesso de RL’s no organismo e em relação a concentração de antioxidantes.
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ESTRESSE OXIDATIVO
Fontes de antioxidantes
Compostos antioxidantes encontrados na dieta ou mesmo sintéticos são um dos mecanismos de defesa contra os radicais livres que podem ser empregados:
Indústrias de alimentos,
Cosméticos,
Bebidas ;
E medicina.
alimentos
alimentos
DETECÇÃO LABORATORIAL DAS LESÕES OXIDATIVAS
Pode ser avaliado diretamente:
Glutationa;
Tocoferol;
Ácido ascórbico
Indiretamente
Subprodutos do estresse oxidativo
DETECÇÃO LABORATORIAL DAS LESÕES OXIDATIVAS
Teste in vivo
Não invasivos
Indicadores na respiração
Hidrocarbonetos voláteis
H2O2
Urina
TBARS
Malonaldeído
Eicosanoides
Sangue
TBARS
LDL oxidado
H2O2
Glutationa
Outros
DETECÇÃO LABORATORIAL DAS LESÕES OXIDATIVAS
Testes in vitro:
DPPH
Lipoperoxidação (TBARS)
ABTS
Quelação de metais (ferro e cobre)
Lipídeos hidroperóxidos:
DNA oxidado
TBARS
Malonaldeído
Dienos conjugados
LDL oxidado
H2O2
Dienos conjugados são hidrocarbonetos com duas ligações duplas entre carbonos e são de cadeias abertas
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Peptídeos antioxidantes
Biomoléculas formadas pela ligação de dois ou mais aminoácidos através de ligações peptídicas, estabelecidas entre um grupo amina de um aminoácido, e um grupo carboxila do outro aminoácido. 
Os peptídeos são resultantes do processamento de proteínas e podem possuir na sua constituição 2 ou mais aminoácidos.
(Santos, 2014)
Peptídeos antioxidantes
Muitos peptídeos de origem vegetal e animal com potencial bioativo relevante foram encontrados.
(Santos, 2014)
Porém, ovos, carnes, pescado, vegetais, são bons candidatos por conter essas proteínas com atividades biológicas latentes 
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Peptídeos antioxidantes
Liberados na hidrolise, tanto na digestão como no processamentodo alimento.
Normalmente têm de 2 a 20 aminoácidos, podendo ter mais de 20.
Tamanho dos peptídeos influencia na sua atividade antioxidante
(Santos, 2014)
Os peptídeos bioativos estão inativos dentro da proteína intacta, mas podem ser liberados por hidrólise tanto durante a digestão gastrointestinal como no processamento do alimento, como em queijos ou leites fermentados. Normalmente contém de 2 a 20 resíduos de aminoácidos, mas em alguns casos podem conter mais de 20 aminoácidos. Após a digestão, os peptídeos bioativos podem ser absorvidos através do intestino, entrar na corrente sanguínea e exercer efeitos sistêmicos, ou ainda, produzir efeito local no trato gastrointestinal 
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Peptideos antioxidantes
Muitos dos peptídeos bioativos conhecidos são multifuncionais.
Efeitos sobre a saúde:
Antimicrobianas,
Anticarcinogênica, 
Antiúlcera,
Ação anti-hipertensiva, 
Antioxidante, 
Outros
Diferentes efeitos sobre a saúde têm sido atribuídos a alimentos derivados de peptídeos, que dependem da sequência de aminoácidos, incluindo propriedades antimicrobianas, anticarcinogênica, antiúlcera, ação anti-hipertensiva, hipocolesterolêmica, antitrombótica, antioxidante, inibição do apetite, aumento da absorção de minerais e/ou biodisponibilidade, efeitos imunomoduladores, atividades opióides, estímulo da síntese de proteínas para o controle da mobilidade intestinal e da secreção de enzimas digestivas 
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PEPTÍDEOS ANTIOXIDANTES
O que influencia na atividade antioxidante de peptídeos
Presença de aminoácidos hidrofóbicos
Cadeias ramificadas
Aminoácido terminal
Sequência de aminoácidos
Tamanho dos peptídeos
(Santos, 2014)
PEPTÍDEOS ANTIOXIDANTES
Os peptídeos que contém aminoácidos hidrofóbicos, em sua sequência 
Contribuir para a inibição da peroxidação;
Aumentando a solubilidade do peptídeo em lipídios.
(Santos, 2014)
Facilitando assim uma melhor interação com radicais livres 
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Cadeias ramificadas
Alguns peptídeos que contém aminoácidos de cadeia ramificada (valina, leucina e isoleucina), mostraram significativa atividade antioxidante
(Santos, 2014)
Aminoácido terminal
Dipeptídeos contendo tirosina e triptofano no aminoácido N-terminal, e histidina e metionina no C-terminal, apresentaram maior atividade antioxidante em meio aquoso
(Santos, 2014)
Sequência de aminoácidos
Sequências Gln-Gly, Gly-Pro e Gly-Pro-Hyp que estavam presentes em diferentes peptídeos com propriedades antioxidantes, entretanto seu mecanismo de ação não foi elucidado.
(Santos, 2014)
Gln: glutamina
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Tamanho dos peptídeos
Quanto menor a massa molar maior a atividade antioxidante.
Entretanto, alguns estudos apresentaram peptídeos com esta bioatividade com tamanho abaixo de 1000 Da
(Santos, 2014)
Entre 1000 e 3000 Da. 
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Peptídeos antioxidantes
Entretanto, pouco é conhecido sobre a estrutura de peptídeos antioxidantes em várias proteínas (LI et al., 2007) 
Relações entre massa molar, sequência de aminoácidos, GH e atividade antioxidante dos peptídeos, assim como o seu mecanismo de atuação
(Santos, 2014)
demonstrando a necessidade de estudos que esclareçam efetivamente quais as relações entre massa molar, sequência de aminoácidos, GH e atividade antioxidante dos peptídeos, assim como o seu mecanismo de atuação
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OBRIGADa!