Prática Medicina - roteiro de estudo - bioquimica

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Prática – Cinética enzimática
INTRODUÇÃO
Quantificação de açúcares redutores.
 Açúcares redutores são carboidratos capazes de reduzir os agentes oxidantes. Os açúcares redutores são aqueles que contém grupos aldeidicos ou cetônicos livres que se oxidam facilmente em meio alcalino ao doar elétrons para agentes oxidantes. Esta propriedade pode ser utilizada na análise e quantificação dos carboidratos. 
Reação do Ácido Dinitrosalicílico (DNS) com Açúcares Redutores
	A química da reação do DNS com açúcares redutores está elucidada em parte. Sabe-se que 1 mol de açúcar redutor vai reduzir um mol de DNS. Na presença de um açúcar redutor o DNS é reduzido para ácido 3-amino-5-nitrossalicílico enquanto que o grupamento aldeído é oxidado a ácido aldônico (Figura 1). A redução do DNS promove uma intensa mudança de cor deste reagente e esta mudança de cor pode ser acompanhada e quantificada espectrofotometricamente. Entretanto a equivalência entre o ácido aminonitrossalicílico produzido e a quantidade do açúcar não é sempre exata e diferentes açúcares produzem diferentes intensidade na cor desenvolvida. 
 
Figura 1: Reação de DNS
Figura 2: Esquema de um Espectrofotômetro 
Figura 3: Variação da intensidade de cor do reagente DNS em diferentes tubos contendo diferentes concentrações de um açúcar redutor 
 OBSERVAÇÕES: 
Presença de fenóis acima de 2g/L, aumenta a coloração, dando resultados errados.
Na metodologia de Miller não é utilizado o tampão acetato. No artigo de Gusakov et al, 2011, existe a incorporação de 0,3mL do tampão acetato no substrato + 0,9mL de DNS isto para pequenas concentrações de açúcares pois a coloração se intensifica. (GUSAKOV, A.V.; KONDRATYEVA, E.G.; SINITSYN, A.P. Comparison of two methods for assaying reducing sugars in the determination of carbohydrase activities. International Journal of Analytical Chemistry 2011: 1-4 ( doi: 10.1155/2011/283658)). 
Cinética Enzimática
A Cinética Enzimática é uma ferramenta da enzimologia que estuda os mecanismos e a velocidade de reações químicas catalisadas por enzimas. 
Em 1913, L. Michaelis e M.L. Mentem, desenvolveram estudos considerando as principais propriedades das enzimas e aplicando as teorias conhecidas de Cinética Química para um modelo simplificado, o qual envolvia a enzima livre (E), o substrato (S), o complexo enzima-substrato (ES) e o produto (P). Esse modelo pode ser expresso como:
Michaelis e Mentem, com essas considerações, desenvolveram a expressão de velocidade para uma reação catalisada enzimaticamente e desta forma puderam descrever o comportamento de diversas enzimas. Essa expressão está apresentada abaixo.
Na figura abaixo está apresentada a curva de velocidade inicial de reação em função da concentração de substrato para uma enzima que siga o modelo proposto por Michaelis e Mentem. Essa enzima é dita Michaeliana e obedece à expressão de velocidade apresentada.
Fig. 4 - Curva de velocidade da reação em função da concentração de substrato 
para uma enzima Michaeliana
Nesta curva pode-se facilmente identificar o efeito de saturação do substrato. Nestas circunstâncias, o sistema tende a adquirir velocidade de reação máxima (Vmáx), grandeza a qual é função da concentração inicial da enzima livre (E). Podemos também definir uma concentração de substrato na qual obtém-se metade de Vmáx. Esse valor corresponde ao Km (mesma unidade que a concentração do substrato), parâmetro relacionado com a afinidade da enzima pelo substrato.
O modo mais preciso de determinar essas grandezas num experimento de Cinética Enzimática é através do gráfico de Duplo-recíproco ou de Lineweaver-Burk. Para tanto deve-se plotar 1/vel em função de 1/[S].
A enzima escolhida para este estudo é a invertase de levedura que catalisa a hidrólise da sacarose para produzir glicose e frutose:
Figura 5. Reação de hidrólise da sacarose catalisada pela invertase
A determinação da velocidade da reação (ou da atividade enzimática) pode ser feita através da dosagem dos açúcares redutores formados (frutose e glicose). A dosagem baseia-se na reação entre ácido 3,5–dinitrosalicílico (DNS) e os açúcares redutores. Estes monossacarídeos reduzem o DNS fornecendo um produto de cor característica, cuja formação pode ser acompanhada a 540 nm.
Conhecendo-se por espectrofotometria, a quantidade (µmols) de açúcares redutores formados e, através de um cálculo estequiométrico simples, podemos determinar a quantidade correspondente (µmols) de sacarose hidrolisada. Nestas experiências, as velocidades da reação serão expressas em µmols de sacarose hidrolisada por minuto.
Para estudos de velocidade, o tempo de reação deve ser medido com a maior exatidão possível. Para isso, o grupo deverá organizar-se de maneira a não permitir que a reação se inicie em tempos diferentes nos vários tubos. Para tal, é importante manter os tubos em gelo durante a adição dos reagentes. Esses devem ser adicionados na ordem em que aparecerem nos protocolos, com a enzima sendo adicionada por último. Leva-se então os tubos, todos juntos, ao banho maria a 37 °C para reagir.
OBJETIVO
Estudar as influências das concentrações de enzima e substrato nas velocidades de uma reação enzimática, examinar as curvas obtidas, calcular alguns parâmetros cinéticos (KM e VMÁX) e discutir seus valores e importância.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Curva Padrão de sacarose hidrolisada. 
A um tubo de ensaio adicionar 2,0mL de frutose 1% e 2,0mL de glicose 1%. Esta solução é a Solução Redutora Padrão e será utilizada nos tubos de 0 a 5.
Adicionar a seis tubos volumes crescentes de Solução Padrão Redutora (preparada na etapa a), conforme indicado na tabela abaixo, completando o volume em cada tubo para 1 ml com tampão acetato 0,05M pH 4,7.
	Tubo
	Sol. Redutora Padrão
	Tampão Acetato
	DNS
	[Glicose/Frutose]
Inicial = 10mg/mL
	0
	---------
	1,0 mL
	1,0 mL
	
	1
	0,1 mL
	0,9 mL
	1,0 mL
	
	2
	0,2 mL
	0,8 mL
	1,0 mL
	
	3
	0,3 mL
	0,7 mL
	1,0 mL
	
	4
	0,4 mL
	0,6 mL
	1,0 mL
	
	5
	0,5 mL
	0,5 mL
	1,0 mL
	
Após a adição do DNS, colocar os tubos em banhos-maria fervente por 10 minutos, findo este tempo, esfriar em água corrente e adicionar 4 ml de água destilada. Caso esteja a coloração muito forte poderá ser diluído adicionando-se até 8mL com água.
Agitar os tubos e ler as absorbâncias a 540 nm contra o tubo 1 (branco).
	Tubos
	[Glicose/Frutose] (mg/mL)
	Leitura A540
	1
	Branco
	
	2
	1
	
	3
	2
	
	4
	3
	
	5
	4
	
	6
	5
	
A partir dos resultados do experimento I (curva padrão) construir um gráfico de concentração de solução padrão redutora (que é a sacarose hidrolisada) no eixo X e Absorbância 540nm no eixo Y. Usar computador com Excel e encontrar a equação da reta.
Efeito da Concentração de Substrato
Numerar os tubos de ensaio e adicionar a sacarose e a solução tampão segundo o protocolo abaixo:
	Tubos
	Solução de Sacarose (mL)
	Solução Tampão (mL)
	Enzima que deve estar no gelo (mL)
	Absorbância
540 nm
	7 (branco)
	-------
	0,75
	0.25
	
	8
	0.05
	0,70
	0.25
	
	9
	0.1
	0,65
	0.25
	
	10
	0.3
	0,45
	0.25
	
	11
	0.5
	0,25
	0.25
	
	12
	0.7
	0,05
	0.25
	
Adicionar rapidamente os volumes da enzima (que está no gelo) nos tubos, e agitar suavemente. Colocar todos os tubos simultaneamente em banho-maria a 37ºC por 5 min. 
Transcorrido este tempo, os tubos devem retornar imediatamente para o gelo. Assume-se que nesse instante a reação para. Ainda no gelo, adicionar a cada tubo 1 ml de DNS. Na presença de DNS, devido a alcalinidade do reagente, a enzima (neste valor elevado de pH) para de funcionar.
Transferir os tubos para banho-maria fervente e esperar 10min. 
Findo este tempo, esfriar em água corrente e adicionar 4 ml de água destilada em cada tubo (ou até 8mL caso a coloração esteja muito forte). 
Agitar os tubos por inversão da posição na vertical (3 vezes). Ler as absorbânciasa 540nm.
RESULTADOS 
Cálculo de KM e VMÁX. 
Usando o gráfico da Curva Padrão de sacarose hidrolisada, da aula anterior, calcular a quantidade de sacarose hidrolisada nos tubos 8 a 12
Faça um gráfico de Lineweaver-Burk com os resultados obtidos e, a partir da equação da reta, determine o valor de KM e VMÁX. Utilize a tabela abaixo para auxiliar na construção deste gráfico.
	Tubo
	[Sacarose] = [S]
	1/[S]
	Velocidade = V
(produto formado / tempo)
	1/V
	8
	
	
	
	
	9
	
	
	
	
	10
	
	
	
	
	11
	
	
	
	
	12
	
	
	
	
Lembrando que no gráfico de Lineweaver-Burk, no eixo (y) temos 1/V, enquanto que no eixo (x) temos 1/[S]