RELATÓRIO CURVA PADRÃO QUANTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATOS PELO MÉTODO DO DNS (3,5 DINITRO SALICILATO)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS 
INSTITUTO DE QUÍMICA E BIOTECNOLOGIA 
LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA 
 
PRÁTICA 01 – CURVA PADRÃO / QUANTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATOS 
PELO MÉTODO DO DNS (3,5 DINITRO SALICILATO) 
 
 
 
 
 
 
 
JOSÉ JORGE ARAÚJO E SILVA 
 
DATA: 10/01/2019 
OBJETIVOS 
Construir a curva padrão de glicose, plotando absorbância x concentração 
e, através de regressão linear, determinar a equação da curva e o coeficiente de 
correlação e utilizar essa curva para determinar a concentração de açucares 
redutores numa amostra de concentração desconhecida. 
INTRODUÇÃO 
Atualmente, encontra-se cada vez mais em indústrias novos 
equipamentos que dão resultados mais eficazes abrangendo as mais diversas 
análises em várias áreas de atuação da indústria alimentícia, entre essas 
analises podemos citar a concentração de glicose. Segundo SILVA et al. (2003), 
os métodos mais comumente utilizados para medição de açúcares são a 
refratometria em escala Brix (método refratométrico), Somogyi-Nelson, fenol-
sulfúrico (métodos espectrofotométricos) e Lane-Eynon (método titulométrico 
também conhecido como reação de Fehling). Estes métodos são utilizados 
basicamente em indústrias alimentícias. A identificação e quantificação desses 
compostos apresenta grande importância na indústria alimentícia pois, por 
exemplo, para pessoas que são diabéticas, os valores de glicose normais em 
nosso sangue variam de 70 a 110 mg a cada 100 mL. Quando a glicose não é 
bem utilizada no organismo, a sua concentração no sangue aumenta para 
valores acima dos mencionados, com isso, a pessoa passa a ter hiperglicemia, 
que é a diabetes, que pode ser ocasionado pelos alimentos. 
Os açúcares redutores como a glicose são todos aqueles que possuem 
uma hidroxila no carbono anomérico livre, ou seja, sem estar comprometida em 
uma ligação química, podendo então reduzir outras moléculas com 
características oxidantes. Esta habilidade pode ser utilizada como instrumento 
para a quantificação de açúcares. 
O método DNS utiliza a característica redutora de açúcares para sua 
quantificação. O princípio vem através de uma molécula chamada Ácido 3,5 – 
dinitro salicílico (DNS) que quando puro apresenta uma coloração alaranjada, 
este ácido é facilmente reduzido por açúcares, embora possa apresentar menor 
eficiência se a solução utilizada possuir outras espécies redutoras fortes. 
Quando reduzido, o DNS se torna ácido 3-amino – 5 – nitro salicílico, e passa a 
apresentar-se com uma coloração acastanhada. 
Através dessa mudança de coloração é possível construir roteiros de 
ensaios colorimétricos e medir a quantidade de açúcares relacionando a 
quantidade de DNS reduzido (a estequiometria da reação é 1:1). 
O espectrofotômetro é um equipamento que permite comparar a 
intensidade da luz transmitida através de uma amostra com a intensidade da luz 
absorvida por esta amostra, que contém um soluto que se deseja quantificar. 
Todas as substâncias são capazes de absorver energia radiante (SKOOG, 
2006). Dentro do âmbito da análise de açúcares, as técnicas que fazem uso do 
espectrofotômetro variam basicamente no modo de obtenção da solução a ser 
analisada pelo equipamento, ou seja, no preparo da amostra que se deseja 
estudar a concentração de açúcares. (DORNEMANN, 2016) 
O método do DNS utilizado na prática é um método rápido e prático na 
determinação de açúcares redutores, e tem grande aplicabilidade industrial. No 
controle de qualidade envolve a caracterização das matérias primas para fins de 
processamento, e verificação se determinado produto está dentro dos 
parâmetros e padrões exigidos pela legislação. Na indústria açucareira, serve 
para controlar se o açúcar, a sacarose, quando hidrolisado sofreu processo de 
redução, que não é tão facilmente percebido no acompanhamento do processo. 
Também é utilizado no acompanhamento do processo de fermentação, que 
permite verificar as taxas de consumo de açúcar pelo microorganismo, 
necessário para a compreensão da cinética do processo. 
REVISÃO DE LITERATURA 
Os carboidratos, ou mais comumente, açúcares, abrangem um dos 
maiores grupos de compostos orgânicos conhecidos na natureza, e juntamente 
com as proteínas formam os principais constituintes dos organismos vivos, além 
de serem a mais abundante fonte de energia para o homem. São acetais ou 
cetais poliidroxilicos com a fórmula empírica (CH2O)n. Os carboidratos simples 
mais abundantes são as pentoses e hexoses. Os açúcares possuem um ou mais 
átomos assimétricos de carbono, portanto podem existir na forma de 
estereoisômeros. Já os açucares de ocorrência natural, por exemplo, glicose, 
frutose e manose, pertencem as séries D (forma de isomeria ótica). 
Os carboidratos têm diversas classificações, de acordo com seu tamanho, 
de acordo com o grupo funcional que é derivado, entre outras. As classificações 
podem ser: monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos. 
Os monossacarídios são carboidratos simples que não podem ser 
hidrolisados a açucares de menor peso molecular. Podem ser classificados em 
aldoses (poliidroxialdeídos) e cetoses (poliidroxicetonas), sendo subdivididos em 
trioses, tetroses, pentoses e hexoses, de acordo com o número de carbonos na 
cadeia. 
Os oligossacarídios são polímeros compostos de resíduos de 
monossacrídios unidos por ligações hemiacetálicas, neste caso denominadas 
ligações glicosídicas, em número que variam de duas, até, aproximadamente, 
dez unidades. São compostos importantes na determinação de estruturas de 
polissacarídios. 
Polissacarídios são macromoléculas facilmente encontradas na natureza 
e que ocorrem em quase todos organismos exercendo diversas funções. 
Formam-se a partir das ligações glicosídicas geralmente com mais de 10 
unidades de monossacarídios ou seus derivados. As unidades monossacarídias 
mais decorrentes são: D-glucose, D-manose, D-frutoses, D e L-galactose, D-
xilose e D-arabinose. O polissacarídios mais conhecido é o amido, que é um dos 
mais importantes constituintes dos alimentos. 
Na indústria, bem como na natureza, existem diversas reações tanto de 
degradação como de formação desses açucares que são determinantes no 
controle de qualidade dos produtos produzidos. 
Um açúcar redutor é um açúcar no qual o carbono carbonila (anomérico) 
não está envolvido em uma ligação glicosídica e, portanto, pode sofrer oxidação. 
Os monossacarídeos podem ser oxidados por agentes oxidantes 
relativamente suaves, tais como os íons férrico e cúprico. O carbono do grupo 
carbonila é oxidado a ácido carboxílico (LENINGHER, 1995). Todos os 
monossacarídeos são potencialmente redutores, devido a presença da 
carbonila. Outros carboidratos necessitam ser hidrolisados para se tornarem 
redutores. 
O método do DNS é um método onde ocorre a oxidação do grupo 
carbonila. O oxidante, chamado DNS utiliza o ácido dinitro-salicílico; sal de 
Rochelle, (solução de tártaro de sódio de potássio) que serve para prevenir o 
reagente da ação do oxigênio dissolvido; fenol, que é utilizado para aumentar a 
quantidade de cor produzida; bissulfito, que é um estabilizante da cor obtida na 
presença do fenol; hidróxido de sódio, que é o redutor da ação da glicose sobre 
o ácido dinitro-salicílico. Ocorre no método do DNS a seguinte reação de 
oxidação: 
 
Figura 1: Reação de oxidação da carbonila pelo reagente DNS. 
Ocorre neste caso a redução do 3,5-di-nitrosalicitato (de cor amarelo forte) 
ácido e a oxidação do monossacarídeo, a glicose, formando o 3-amino-5- nitro-
salicilato (de cor laranja-marrom forte), na proporção estequiométrica. 
Portanto, pela determinação da luz absorvida a 540nm pelo 3-amino-5- 
nitrosalicilato, pode-se determinar a concentração de açúcar redutor presente na 
solução. 
Também para cada tipo de amostra deve se levantar uma curva padrão 
do açúcar em estudo, por exemplo, se a amostra analisadacontém frutose, 
devemos fazer a curva padrão para a frutose, dentro de um determinado 
intervalo de concentração, e respeitando a Lei de Beer. 
LEI DE LAMBERT 
Lambert (1870) observou a relação entre a transmissão de luz e a espessura 
da camada do meio absorvente. Quando um feixe de luz monocromática, 
atravessava um meio transparente homogêneo, cada camada deste meio 
absorvia igual a fração de luz que atravessava, independentemente da 
intensidade da luz que incidia. A partir desta conclusão foi enunciada a seguinte 
lei: " A intensidade da luz emitida decresce exponencialmente à medida que a 
espessura do meio absorvente aumenta aritmeticamente ". 
LEI DE BEER 
Beer em 1852 observou a relação existente entre a transmissão e a 
concentração do meio onde passa o feixe de luz. Uma certa solução absorve a 
luz proporcionalmente à concentração molecular do soluto que nela encontra, 
isto é, " A intensidade de um feixe de luz monocromático decresce 
exponencialmente à medida que a concentração da substância absorvente 
aumenta aritmeticamente ". 
As leis de Lambert-Beer são o fundamento da espectrofotometria. Elas são 
tratadas simultaneamente, processo no qual a quantidade de luz absorvida ou 
transmitida por uma determinada solução depende da concentração do soluto e 
da espessura da solução. 
MATERIAIS UTILIZADOS 
✓ Tubos de ensaio com tampa rosqueável; 
✓ Bastão de vidro; 
✓ Pipetas automáticas; 
✓ Ponteiras; 
✓ Espectrofotômetro; 
✓ Cuvetas; 
✓ Termômetro; 
✓ Banho-maria. 
PROCEDIMENTO 
 
CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO 
✓ Para o preparo do branco transferiu-se 1 mL de água destilada para um 
tubo de ensaio, o qual foi identificado; 
✓ Em seguida, adicionou a outro tubo de ensaio identificado como “tubo 1” 
0,8 mL de água destilada e 0,2 mL de solução de glicose; 
✓ No tubo 2 foi adicionado 0,6 mL de água destilada e 0,4 mL de solução 
de glicose; 
✓ No tubo 3 foi adicionado 0,5 mL de água destilada e 0,5 mL de solução 
de glicose; 
✓ No tubo 4 foi adicionado 0,4 mL de água destilada e 0,6 mL de solução 
de glicose; 
✓ No tubo 5 foi adicionado 0,2 mL de água destilada e 0,8 mL de solução 
de glicose; 
✓ No tubo 6 foi adicionado 0,1 mL de água destilada e 0,9 mL de solução 
de glicose; 
✓ No tubo 7 foi adicionado 0,05 mL de água destilada e 0,95 mL de 
solução de glicose; 
✓ Em seguida foi adicionado em todos os tubos exceto no branco 1 mL de 
DNS, agitou e aqueceu á 100 °C em banho-maria durante 5 minutos; 
✓ Após resfriar a temperatura ambiente foram acrescentadas 13 mL de 
água destilada em cada tubo, foram fechados e homogeneizados. 
✓ Após isso, foi feita a leitura de absorbância em espectrofotômetro em 
540 nm. 
 
RESULTADOS 
 
Com os resultados obtidos foi construído o gráfico padrão com a 
absorbância em função da concentração. O gráfico foi construído no Microsoft 
Excel® juntamente com sua linearização. Os dados obtidos na leitura do 
equipamento estão contidos na tabela a seguir. 
 
 
 
 
 
 
 
TABELA CONCENTRAÇÃO X ABSORBÂNCIA 
 
 
 
 
GRÁFICO DA CURVA PADRÃO 
 
 
Observamos que o composto formado obedece a lei de Lambert-beer, ou 
seja, a absorbância é proporcional à concentração da substância dissolvida, 
neste caso, os açucares redutores. Isso explica perfeitamente o funcionamento 
do gráfico, onde quanto maior a concentração da solução, maior é a leitura de 
absorbância encontrada pela leitura do espectro, o que confirma 
quantitativamente o que já havíamos observado qualitativamente pela 
intensidade da cor do produto formado. 
O valor de R obtido pela linearização da curva pode ser obtido pelo R2 
calculado pelo Microsoft Excel. O valor que indica uma linearização perfeita é 1, 
mas geralmente, análises de precisão fornecem valores com erros de 0,001 para 
o R. Embora o valor obtido seja bom, ele não é analiticamente o melhor que se 
pode obter. Esse valor se torna aceitável quando se olham para as fontes de 
erros durante a realizaoncção do experimento e do próprio equipamento leitura. 
Provavelmente a maior fonte de erros está atribuída aos analistas. Isso pode ser 
percebido pelos valores de absorbância obtidos que não são muito lógicos. 
Como as amostras tem concentrações muito próximas os erros maiores podem 
ser atribuídos a imperícia dos analistas. 
CONCLUSÃO 
Podemos concluir que o método utilizado (DNS) para construção da curva 
padrão é um método confiável na quantificação dos açúcares redutores. Os 
resultados experimentais reproduziram o que já era esperado, segundo a 
literatura. Contudo, deve-se estar atento para as condições em que se realizam 
os procedimentos, pois isso constitui uma fonte de erros. Esses erros podem ser 
observados nos resultados obtidos das leituras que ficaram um pouco afastados 
da reta. 
REFERÊNCIAS 
Espectrofotometria. Disponível em: <http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/conceito 
.html>. Acesso em 10/01/2019. 
 
Dosagem de açúcares redutores com o reativo DNS em microplaca. Disponível 
em: <http://www.scielo.br/pdf/bjft/v20/1981-6723-bjft-1981-672311315.pdf> 
Acesso em: 10/01/2019. 
 
Dosagem de açucares redutores pelo método do 3,5-Dinitrossalicilato – DNS. 
Disponível em: <https://www.ebah.com.br/content/ABAAAgILcAG/dosagem-
acucares-redutores-pelo-metodo-3-5-dinitrossalicilato-dns>. Acesso em: 
10/01/2019. 
 
Caderno de Farmácia - Lei de Beer-Lambert-Bouguer. Disponível em: 
http://cadernodefarmacia.blogspot.com/2012/10/lei-de-beer-lambert.html>. 
Acesso em: 10/01/2019