Determinação das constantes cinéticas da enzima invertase

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Laboratório Integrado II 
 
Trabalho Prático Nº 4 
 
Determinação das constantes cinéticas da enzima 
invertase 
 
Trabalho realizado por: 
 
Turma P1 Grupo 2 
 Catarina Oliveira 
 Raquel Queirós 
 Susana Domingues 
 
 
 
Sumário 
 
Pretende-se, com esta atividade experimental, analisar a cinética enzimática da invertase da levedura 
Saccharomyces cerevisiae, proveniente de uma amostra comercial de fermento de padeiro. (1) 
 
Antes de iniciar com o protocolo, a docente preparou o extrato enzimático através de um fermento de 
padeiro onde contém a enzima a ser estudada, a invertase. 
 
Na primeira parte, procedeu-se à preparação de 25 mL de uma solução equimolar (mesmo nº de moles) 
de glucose e frutose 2,5 mmol.dm-3, 25 mL de uma solução de sacarose 0,25 mol.dm-3 e 50 mL de uma 
solução tampão acetato 50 mmol. dm-3 a pH 4,5. Preparadas as soluções, foram usados 5 tubos de ensaio 
onde se colocou solução de glucose e frutose com a solução tampão acetato e uma solução DNS e foi 
medida a absorvância de cada tubo, com o objetivo de realizar uma curva de calibração. 
 
Seguiu-se para a preparação das soluções dos tubos 6 ao 12 e, após essa preparação, obteve-se a 
absorvância para cada tubo, o que permitiu calcular a quantidade de produto formado (µmol glucose + 
frutose), a velocidade inicial da reação (v0) e ainda a atividade especifica da enzima (µmol glucose e 
frutose/min/mg proteína) em cada tubo. 
 
Através da variação da atividade enzimática com a concentração de substrato apresentados nos 
gráficos baseados nas teorias Michaelis–Menten e Lineweaver e Burk foi possível a determinação dos 
valores de KM e Vmáx, sendo 21,19 mmol.dm-3 e 0,8545 mg/min, respetivamente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
i 
 
 
 
Índice 
 
 
1. Observações e resultados experimentais ........................................................................................ 1 
 
2. Tratamento de resultados e Discussão............................................................................................ 3 
 
3. Conclusões ..................................................................................................................................... 6 
 
4. Nomenclatura ................................................................................................................................. 7 
 
5. Bibliografia .................................................................................................................................... 8 
 
Anexos……………………………………………………………………………...…..................9 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ii 
 
 
 
 
1. Observações e Resultados Experimentais 
 
 
➢ Parte B – Preparação de soluções 
 
De acordo com o protocolo, prepararam-se as soluções mencionadas. Primeiramente uma solução de 
25 mL de solução equimolar de glucose e frutose 2,5 mmol/L. Posteriormente, uma solução de 25 mL de 
solução de sacarose 50 mmol/L, e, por último, uma solução-tampão acetato de 50 mmol/L a um pH=4,5. 
Para estas soluções mediu-se 0,00563 gramas de glucose, 0,000563 gramas de frutose, 2,1394 gramas de 
sacarose e 0,1495 gramas de acetado de sódio tri-hidratado. Os cálculos realizados para obter as massas 
necessárias a pesar, encontram-se em anexo. 
 
 
 
 
 
 
➢ Parte C – Determinação do “açúcar invertido” 
Nesta parte, preparou-se 5 tubos em duplicado com as soluções padrões apresentadas na tabela 1. O tubo 
de ensaio nº1 equivale ao ensaio em branco. 
 
 
 
 
 
Após os tubos terem sido aquecidos num banho de água a ferver durante 5 minutos e seguidamente 
arrefecidos, foram registados os valores de absorvência que se encontram apresentados na tabela 2. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabela 1- Composição das soluções padrão (1) 
 
ii
.. 
Tabela 2- Absorvância média em cada tubo a 540nm 
 
1 
 
 
 
 
➢ Parte D - Estudo da atividade da enzima em função da concentração de substrato 
Nesta fase, foram necessarios 6 tubos de ensaio para preparar as soluçoes apresentadas na tabela 3 no qual 
se adicionou em cada um uma solução de enzima de modo a estudar a atividade enzimática da invertase. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Seguidamente, adicionou- se DNS (ácido 3 5-dinitrosalicílico) para parar a reação que durou 7 
minutos. Depois de arrefecidos, juntou-se 5 mL de água destilada e registou-se os valores de absorvância 
a um comprimento de onda de 540 nm em cada tubo. Na seguinte tabela estão apresentados os valores 
registados, tendo sido o tubo 6 usado como ensaio em branco. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabela 3- Composição das soluções para o estudo da atividade enzimática. (1) 
Tabela 4- Absorvência média em cada tubo a 540nm 
2 
 
 
 
 
2. Tratamento de Resultados e Discussão 
 
As enzimas são proteínas especializadas na catalise de reações biológicas. A sua atuação permite a 
diminuição da energia de ativação de uma reação espontânea, fazendo com que um maior número de 
reagentes possua a energia necessária para serem convertidos, aumentando assim a velocidade da reação 
 
A enzima em estudo neste trabalho (invertase ou 3-frutofuranosidase) localiza-se na parede celular de 
sacaromyces ceravisae e é uma hidrólase, pois catalisa a hidrolise da sacarose, quebrando a ligação 
glicosídica entre a glicose e a frutose. (2) 
 
 
 
➢ Parte C 
 
Foram usados 5 tubos de ensaio onde se colocou solução de glucose e frutose com a solução tampão 
acetato e uma solução de DNS (3-amino-5-nitrosalicílico) com o objetivo de realizar uma curva de 
calibração (absorvância versus moles de frutose/glucose). Através da tabela 2 obtida, foi retirado o valor 
da absorvância do tubo de ensaio branco a cada das restantes soluções. Registando os valores obtidos e 
calculando o número de moles das soluções (cálculos em anexo), realizou-se o seguinte gráfico: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
y = 0,1667x + 0,0453
R² = 0,9998
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00
A
b
so
rv
â
n
c
ia
 (
5
4
0
 n
m
)
nº moles Glucose/Frutose (µmol)
Figura 2- Curva de calibração 
 
3 
Figura 1- Hidrolise da sacarose, com a obtencao dos monossacarideos glucose e frutose 
 
 
 
 
➢ Parte D 
 
A partir da curva da calibração apresentada anteriormente foi possível obter a reta do tipo, 𝑦 = 𝑚𝑥 +
𝑏 no qual y apresenta a absorvância registada na tabela 4, deste modo, substituindo pra cada tubo as 
respetivas absorvâncias, obtém-se a quantidade molar da substância frutose/glucose em cada tubo. 
Seguidamente, determinou-se a concentração de sacarose presente em cada tubo, no qual se verifica 
que aumenta com o aumento da quantidade molar (cálculos em anexo). 
Através das moles e o tempo em que ocorreu a reação entre a sacarose e a enzima obteve-se a 
velocidade inicial das reações. 
A figura 3 mostra a variação da concentração da sacarose quando a invertase é constante. Como se 
pode observar, para concentrações relativamente baixas de sacarose, a velocidade inicial aumenta quase 
linearmente com o aumento da concentração de Sacarose, devido à grande quantidade de enzima livre que 
se pode ligar ao substrato. Para concentrações elevadas deste mesmo substrato, a velocidade inicial 
aumenta cada vez menos em resposta ao aumento da concentração de sacarose, atingindo um patamar que 
representa o valor da velocidade máxima. Esta tendência para o infinito representa o momento em que os 
centros ativos da invertase se encontram todos ligados à sacarose (saturação da enzima). 
 
 
 
 
 
 
 
Posteriormente, a equação de Michaelis-Menten, 𝑣0 =
𝑉𝑚á𝑥 ×[𝑆]
𝐾𝑚+[𝑆] 
, apresenta os dois parâmetros 
cinéticos importantes, Km e Vmáx. O valor de KM corresponde à concentração de substrato em que a 
velocidade inicial da reação é metadeda velocidade máxima e indica a estabilidade do complexo enzima-
substrato. O valor de Vmax é diretamente proporcional à concentração de enzima e representa a velocidade 
de conversão do complexo em enzima-produtos. No entanto, torna-se difícil determiná-los diretamente. 
Existem vários outros métodos que torneiam este problema. Um dos métodos mais utilizados é o de 
Lineweaver-Burk (também designado por método dos duplos inversos), que consiste na inversão da 
equação de Michaelis-Menten, 
1
𝑣0
=
𝐾𝑚
𝑉𝑚á𝑥
 × 
1
[𝑆]
+ 
1
𝑉𝑚á𝑥
. (1) 
Foi representado o gráfico de Lineweaver-Burk com a velocidade e concentração invertida de modo a 
obter a reta do tipo 𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏. Com a equação obtida determinou-se facilmente Km e Vmáx calculados 
em anexo. 
 
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 20 40 60 80 100 120
V
e
lo
c
id
a
d
e
 i
n
ic
ia
l
concentração de sacarose (mmol.dm^-3)
Figura 3 - gráfico de Michaelis-Menten 
 
4 
 
 
 
 
A dedução da equação de Lineweaver-Burk a partir da equação de Michaelis-Menten é dada por: 
 
 
 Y = m x + b 
 
Assim, esta é a equação de uma recta onde 1/v representa a ordenada, 1/[S] a abcissa, o declive é 
dado por KM/vmax e a ordenada na origem 1/ vmax. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 A atividade enzimática é definida pelo consumo de uma certa quantidade de substrato, ou a produção 
de uma certa quantidade de produto, por unidade de tempo. Ao dividir o valor da atividade enzimática 
encontrada na solução pelo número de miligramas de proteína nela existente, define-se um novo conceito: 
a atividade específica. A medida da atividade específica é máxima quando a enzima se encontra pura. 
Após feitos os cálculos apresentados em anexo obtivemos os valores presentes na tabela 5. (3) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tubos 
Atividade específica (µmol 
Glucose-Frutose/min/mg 
proteína) 
6 0 
7 1,66 
8 2,97 
9 4,26 
10 6,99 
11 9,86 
12 11,4 
y = 24,801x + 1,1703
R² = 0,9959
0,0000
1,0000
2,0000
3,0000
4,0000
5,0000
6,0000
7,0000
8,0000
9,0000
10,0000
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35
1
/V
0
1/[S]
Figura 4- gráfico de Lineweaver-Burk 
 
Tabela 5 – Atividade específica em cada tubo 
5 
 
 
 
 
3. Conclusões 
 
Em suma, a propósito deste estudo à cerca da cinética enzimática da interfase de levedura Saccharomyces 
cerevisiae, presente numa amostra de fermento de padeiro, determinou-se os valores de KM e Vmax, de 
acordo com o ambiente proporcionado. 
 
Podemos então afirmar que os parâmetros cinéticos podem ser calculados tanto pela curva de Michaelis-
Menten como pela reta de Lineweaver-Burk. No entanto, pela curva de Michaelis-Menten o cálculo de Km 
não é rigoroso e exige um número elevado de determinações. Contudo, o segundo método é mais expedito, 
rigoroso e rápido e são necessárias menos leituras experimentais, pois o traçado da reta exige um menor 
número de pontos da curva. Para além disto, a reta de Lineweaver-Burk não implica aproximações, mas 
sim cálculos matemáticos. 
 
Deste modo, os resultados obtidos para KM e Vmáx foram 21,19 mmol.dm-3 e 0,8545 mg/min, 
respetivamente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6 
 
 
 
 
 
 
4. Nomenclatura 
 
• m – Massa (g); 
• C – Concentração (mol/dm3) 
• MM - Massa Molar (g/mol); 
 
• n – Número de moles (mol); 
• 
• V0 – velocidade inicial (µmol Glucose - Frutose/min); 
 
• KM – constante de Michaellis; 
 
• Vmáx – velocidade máxima (µmol Glucose - Frutose/min). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7 7 
 
 
 
5. Bibliografia 
 
(1) Determinação das constantes cinéticas da enzima invertase, Protocolos de Laboratório Integrado 
II, Licenciatura em Bioengenharia, 2019/2020; 
 
(2) Diapositivos: Lab. integrado II_T4_2020_1 
 
(3) https://repositorio-aberto.up.pt/bitstream/10216/102530/2/179641.pdf 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
8 
https://repositorio-aberto.up.pt/bitstream/10216/102530/2/179641.pdf
 
 
 
ANEXOS 
 
 
 
➢ Parte B 
 
 
> Cálculo para a preparação das soluções: 
 
 
• Preparar 25 mL de solução equimolar de glucose e frutose 2,5 mmol.dm-3: 
 
Sabendo que uma solução equimolar consiste numa solução que tem a mesma quantidade 
de moles dos seus compostos, para preparar 25 mL de uma solução equimolar de glucose e frutose 
2,5 mmol.dm-3, sabemos que a concentração de glucose e frutose irá ser 1,25 mmol.dm-3 cada uma. 
Assim vem, 
 
 
𝑐 =
𝑛
𝑣 
 ⇔ 1,25 =
𝑛
0,025
 ⇔ n = 0,03125 mmol = 0,00003125 𝑚𝑜𝑙 
 
 
Tendo a massa molar da glucose (180,156 g/mol) e da frutose (180,16 g/mol) 
conseguimos calcular a massa a pesar de cada uma através da seguinte equação: 
 
𝑛 =
𝑚
𝑀𝑀
 
 
Assim, é necessário pesar 0,00563g de glucose e também 0,00563g de frutose. 
 
• Preparar 25 mL de solução de sacarose 0,25 mol.dm-3: 
 
𝑐 =
𝑛
𝑣 
 ⇔ 0,25 =
𝑛
0,025
 ⇔ n = 0,00625 mol 
 
Com o número de moles calculado e sabendo que a massa molar da sacarose é de 342,3 
g/mol, é possível calcular a massa a pesar. 
 
𝑛 =
𝑚
𝑀𝑀
⇔ m = 0,00625 × 342,3 ⇔ m = 2,1394 g 
 
• Preparar 50 mL de tampão acetato 50 mmol.dm-3 pH 4,5: 
 
Sabendo que para preparar 1 litro da solução é necessário transferir 2,99g de acetato de sódio tri-
hidratado e 1,66 mL de ácido acético glacial para um balão volumétrico, através de uma regra de 
três simples conseguimos calcular os valores necessários para a preparação de 50 mL. 
 
 
 
 
 
 
 
Assim, é necessário transferir 0,1495g de acetato de sódio tri-hidratado e 0,083 mL de ácido 
acético glacial para um balão e perfazer com água até aos 50 mL. 
1 L 2,99 g 1 L 1,66 mL 
 
 
0,05 L x 0,05 L x 
 
 
x = 0,1495 g x = 0,083 mL 
9 
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➢ Parte D 
 
 
 
 
Após a preparação das soluções dos tubos 6 ao 12 e medida a sua absorvância como podemos observar 
na tabela 5, foi possível calcular a quantidade de produto formado (µmol glucose e frutose), a velocidade 
inicial da reação (V0) e ainda a atividade especifica da enzima (µmol glucose e frutose/min/mg proteína). 
Estes resultados estão apresentados na tabela seguinte. 
 
 
 
Para o cálculo da quantidade de glucose e frutose (µmol) presente em cada tudo recorremos à equação 
y = 0,1667x + 0,0453 obtida através da curva de calibração para os açucares invertidos (figura 1). O y vai 
ser substituído pela absorvância obtida em cada tudo, e dai tira-se o x que corresponde à quantidade de 
glucose e frutose desse mesmo tubo. 
 
Para a sacarose, sabendo que a sua concentração inicial é de 0,25 mol/L, que o volume final da solução 
presente em cada tubo é 4 mL (sacarose + solução tampão + enzima) e sabendo ainda o volume de sacarose 
utilizado nestes, através da equação Ci × Vi= Cf × Vf é possível calcular a concentração de sacarose 
presente em cada tudo. Substituindo os valores na equação, obtemos Cf. No fim, para obter o resultado em 
mmol/L basta multiplicar Cf por 1000. 
 
Na determinação da velocidade inicial da reação (V0) foi necessário saber a quantidade de produto 
formado em cada tubo e dividi-la pelo tempo de reação, 7 minutos, ou seja, 
 
 
𝑉0 =
𝑄𝑢𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑡𝑜 𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑑𝑜7
 
 
Por fim, sabendo que a concentração de proteína no extrato inicial é 6,655 mg/mL, ou seja, após a 
diluição 1:100 é de 0,06655 mg/mL e tendo a velocidade inicial da reação já calculada, consegue-se calcular 
a atividade especifica da enzima para cada tudo. Para isso é apenas necessário dividir a V0 (de cada tudo) 
pela concentração da proteína (0,06655 mg/mL). 
Tubos Sacarose (mL) Solução tampão (mL) Enzima (mL) DNS(mL) Absorvância (540 nm)
6 0 3 1 2 0
7 0,05 2,95 1 2 0,174
8 0,1 2,9 1 2 0,276
9 0,2 2,8 1 2 0,376
10 0,4 2,6 1 2 0,588
11 0,8 2,2 1 2 0,811
12 1,6 1,4 1 2 0,93
Tabela 6 – Composição das soluções para o estudo da atividade enzimática e respetivas absorvâncias 
Tubo Glucose/Frutose (µmol) Sacarose (mmol/L)
V0 
(µmol Glucose-Frutose/min)
1/[S] 1/V0
Atividade específica 
(µmol Glucose-Frutose/min/mg proteína)
6 0 0 0 0 0 0
7 0,772 3,13 0,11 0,32 9,067 1,657
8 1,384 6,25 0,198 0,16 5,058 2,971
9 1,984 12,50 0,283 0,08 3,529 4,258
10 3,256 25,00 0,465 0,04 2,15 6,988
11 4,593 50 0,656 0,02 1,524 9,86
12 5,307 100 0,758 0,01 1,319 11,392
Tabela 7 – quantidade de produto formado, velocidade inicial da reação e atividade especifica da enzima 
10 
 
 
 
 
> Cálculo da Vmáx da KM : 
 
 
Para o calculo da velocidade máxima da reação e da constante de Michaelis recorreu-se à seguinte 
equação: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Em que o valor de KM corresponde à concentração de substrato em que a velocidade inicial da 
reação é metade da máxima. 
 
Para conseguir calcular os dois parâmetros cinéticos (KM e Vmáx) recorreu-se ao método dos duplos inversos 
(figura 3) obtendo-se a reta de equação y = 24,801x + 1,1703. 
 
Assim, 
 
𝑏 =
1
𝑉𝑚á𝑥
 ⇔ 𝑉𝑚á𝑥 =
1
1,1703
 ⇔ 𝑉𝑚á𝑥 = 0,8545 
 
 
 
𝑚 = 
𝐾𝑀
𝑉𝑚á𝑥
⇔ 𝐾𝑀 = 24,801 × 0,8545 ⇔ 𝐾𝑀 = 21,19 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
y = m × x + b 
10 11 
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