Técnicas de Purificação

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Técnicas de Purificação
Maria Alice Zarur Coelho
Priscilla Filomena Fonseca Amaral
Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos 
Químicos e Bioquímicos
Introdução
• Meios de fermentação:
- produtos extracelulares (solúveis e insolúveis),
- produtos intracelulares,
- fragmentos de células,
- microrganismos intactos
- substratos ou demais componentes não convertidos em produto.
• Diversidade: métodos de separação passíveis de utilização é muito vasto. 
• Quatro etapas similares, que ocorrem seqüencialmente:
- remoção de material insolúvel
- separação dos produtos
- purificação
- polimento (geralmente associado a cristalização)
Técnicas de Purificação
suspensão diluída
processo de separação e/ou purificação composto altamente 
purificado
Separação
Purificação
Etapas de Recuperação
• Operações Unitárias:
- centrifugação
- filtração
- adsorção,
- extração com solvente
• Duas etapas vêm sendo combinadas em um único estágio;
• Nota-se um grande aumento da concentração do produto nesta fase 
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Separação 
Remoção de material insolúvel 
Separação de produtos 
Etapas de Recuperação
• Enzimas extracelulares:
- Resfria-se o meio fermentado a 5°C (estabilidade e evitar contaminação)
- pH ajustado
• Fungos filamentosos: - centrifugação
- ou filtração (filtro-prensa/ filtro rotativo a vácuo)
• Leveduras e Bactérias: - prévia floculação (sulfato de alumínio, CaCl2)
- centrifugação 
- ou filtração (filtro-prensa/ filtro rotativo a vácuo)
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Separação 
Etapas de Recuperação
• Enzimas hidrolíticas: centrifugação
- bactérias gram-positivas tais como Bacillus subtilis (produtora da 
protease subtisilina)
- bactérias gram-negativas como Klebsiella pneumoniae (produtora da 
pululanase): presença de membrana externa – complicações: liberação 
apenas parcial da enzima no meio. 
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Separação 
Etapas de Recuperação
• Obtenção de enzimas intracelulares:
Técnicas de lise celular: - métodos físicos,
- métodos químicos,
- métodos enzimáticos 
Técnicas de Purificação
Extração 
Enzima localizada na parte 
externa da membrana celular
(mas não é extracelular)
liberação da enzima: destruição 
parcial ou total da célula 
(exemplo: autólise das células a 
50oC durante 14 horas).
Etapas de Recuperação
• Métodos enzimáticos:
- Utilização de enzimas que catalisam a digestão de parede celular: 
Lisozima – bactérias
Glucanase, tripsina e protease – leveduras
- Pouco usado industrialmente: alto custo
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Extração 
Etapas de Recuperação
• Métodos enzimáticos:
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Extração 
Ação da lisozima: hidrólise das ligações glicosídicas
beta 1,4 entre resíduos do ácido N-acetilmurâmico
(Mur2Ac) e N-Acetil-D-glucosamina (GlcNAc) num 
pepitídeoglicano
Tratamento prévio com EDTA
Etapas de Recuperação
• Métodos enzimáticos:
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Extração 
Glucanase, tripsina e protease – leveduras
Etapas de Recuperação
• Métodos químicos:
- tratamentos com bases (NaOH) – enzima tolerante a alto pH
- choque osmótico (variação da concentração de soluto presente no 
tampão):
Extrato resultante com pouca contaminação
Bactérias Gram-positivas: alta pressão osmótica interna
- tratamento com detergentes (Tween, laurilsulfato de sódio, triton)
Agem sob condições de baixa força iônica, combinando as
lipoproteínas da membrana para formar micélios
- tratamento com solventes orgânicos (álcool isopropílico, etanol).
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Extração 
Etapas de Recuperação
• Métodos físicos:
- Congelamento / descongelamento: formação de cristais de
gelo intracelulares
Demorado
Pode inativar enzima
- Moagem com abrasivos: moinhos vibratórios 
com esferas de vidro
largamente empregada
Opera em batelada ou contínuo
Necessita de sistema de resfriamento
- Mixers ou liquidificadores: tecidos animais e vegetais 
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Extração 
Etapas de Recuperação
• Métodos físicos:
- Cisalhamento líquido: passagem por pequenos orifícios sob alta pressão
- Sonicação: aparelhos de ultrassom
altíssimas frequências
ruptura das células por cavitação
Não muito aplicada em escala industrial
O extrato enzimático contém muitos componentes celulares. Em particular, as 
células bacterianas lisadas liberam elevadas quantidades de ácidos nucleicos. 
Técnicas de Purificação
Extração 
Etapas de Recuperação
• Extração a partir de Tecidos Animais e Vegetais
- Tecidos animais: similares às técnicas empregadas em leveduras
Homogeneização do tecido selecionado em uma solução tampão 
adequada é a técnica mais amplamente empregada.
Segundo passo: se utiliza a centrifugação diferencial para selecionar a 
subfração celular apropriada. 
- Tecidos vegetais: 
Forças necessárias são elevadas
Presença de compostos fenólicos facilmente oxidados
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Extração 
Etapas de Purificação
• As características das etapas de um processo de purificação são, em grande 
parte, determinadas pela natureza do produto final e pela sua aplicação
• Existe necessidade para a purificação completa de uma enzima?
• Maioria das aplicações: suficiente um menor grau de purificação ainda que 
existam algumas atividades contaminantes desde que não afetem substrato(s), 
produto(s) ou enzima(s) envolvido(s) em um processo específico.
• Existem algumas aplicações (na medicina clínica, área farmacêutica, análises 
específicas, projeto de biosensores, engenharia genética) onde é essencial que 
a proteínas contaminantes sejam reduzidas ou completamente eliminadas. 
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Etapas de Purificação
• Cuidados devem ser tomados para que ao passar de uma etapa a outra 
mínimas alterações nas condições de estabilidade, pH, temperatura, etc. 
sejam promovidas.
• As enzimas são moléculas de elevado peso molecular, cujas funções 
dependem de uma estrutura altamente ordenada.
Técnicas de Purificação
• Tamanho, carga, hidrofobicidade, 
solubilidade e atividade biológica 
são as principais características 
proteicas utilizadas na etapa de 
purificação das proteínas
Etapas de Purificação
Precipitação
- A solubilidade de uma proteína é o resultado de:
interações polares com o solvente aquoso,
interações iônicas com os sais presentes,
forças eletrostáticas de atração e repulsão.
- O desempenho do processo de precipitação depende também da composição 
da solução, incluindo as propriedades das demais proteínas presentes (co-
precipitação).
- Outros fatores determinantes na solubilidade das proteínas: pH, temperatura 
e força iônica.
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Concentração 
Etapas de Purificação
• Precipitação Isoelétrica: 
- Ponto isoelétrico: 
pH no qual as proteínas apresentam a carga líquida igual a zero.
não ocorre migração das molécula se submetidas a um campo elétrico. 
Abaixo do PI: forma catiônica
Acima do PI: forma aniônica.
- Quanto maior o caráter iônico:
maior a tendência à solvatação. 
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Concentração 
Etapas de Purificação
• Precipitação com sais inorgânicos:
- Sais inorgânicos neutros (NaCl, (NH4)2SO4) que promovam a precipitação 
seletiva das proteínas. 
- Efeito salting-out: dependente da hidrofobicidade das proteínas. 
- Distribuição de grupos hidrofóbicos e hidrofílicos na superfície da molécula de 
proteína: afeta enormemente sua solubilidade frente a vários solventes.
Grupos hidrofóbicos: papel importante no comportamento das moléculas 
proteicas, devido à carga e aos grupos polares que apresentam;
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Concentração 
Etapas de Purificação
• Precipitação com sais inorgânicos:
- A força iônicamede a concentração das cargas em solução. 
Variação da força iônica (concentração do sal) no meio.
Solubilidade aumenta exponencialmente com a concentração do sal, 
passa por um máximo e depois decresce.
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Concentração 
Etapas de Purificação
• Precipitação com sais inorgânicos:
- Salting-in: 
forças de atração entre os íons da proteína e os íons do sal;
íons do sal: muito hidratados - contribuem para o aumento da camada de
hidratação da molécula, favorecendo o aumento da solubilidade.
- Salting-out:
O fenômeno da salting out é bastante apreciável no ponto isoelétrico, onde a 
repulsividade eletrostática passa por um mínimo. 
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Concentração 
Ptn´s mais 
susceptíveis à
aglomeração
redução das interações 
entre a água e os 
grupos polares das 
proteínas
decréscimo 
na atividade 
da água
Aumento da 
concentração 
iônica
• Precipitação com sais inorgânicos:
Sulfato de amônio:
- barato e de fácil obtenção;
- não é tóxico;
- alta solubilidade mesmo em baixas 
temperaturas;
- efeito estabilizante em algumas proteínas, 
sendo normalmente utilizado no processo de 
armazenagem de enzimas comerciais;
- alta concentração deste sal previne ação 
proteolítica e bateriana, o que reduz as perdas de 
atividade enzimática.
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Concentração 
OBS: a adição do sal deve ser lenta e sob 
agitação para favorecer a homogeneização
Etapas de Purificação
• Precipitação com solventes orgânicos:
- A adição de solventes orgânicos (acetona e álcool): diminui a sua solubilidade. 
abaixamento da constante dielétrica da solução, ou seja, diminuição da 
atividade da água.
- Constante dielétrica: medida da polaridade do solvente, ou seja, da capacidade 
que ele apresenta de se colocar entre dois íons de cargas opostas e separá-los, 
solvatando-os.
Constante dielétrica da água: muito elevada
A água separa os íons de carga oposta, solvatando-os, e mantendo a
proteína em solução.
O solvente já o faz com mais dificuldade, permitindo maior atração
entre as moléculas proteicas.
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Concentração 
Etapas de Purificação
• Precipitação com solventes orgânicos:
- Os solventes devem ser usados somente a baixas temperaturas (< 0 oC);
- O uso de solventes tem diminuído nos últimos anos;
- Mais usados: metanol, etanol e acetona – inflamáveis;
- Vantagem: recuperação do solvente para reutilização.
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Concentração 
Etapas de Purificação
• Precipitação com polímeros:
- Polietilenimidas e polietilenoglicóis de diferentes pesos moleculares.
- Mecanismo de precipitação: é similar ao existente com solventes orgânicos e 
resulta da mudança na solvatação das moléculas proteicas pela água.
- Acredita-se que as moléculas de polímero ocupem o lugar das moléculas 
proteicas na solvatação.
- Muitas enzimas precipitam com concentrações de polímero variando entre 15 e 
20%. 
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Concentração 
Etapas de Purificação
• Ultrafiltração:
- Princípio: Uma membrana semi-
permeável permite a separação das 
moléculas de solvente das moléculas 
enzimáticas grandes porque apenas as 
moléculas pequenas podem penetrar na 
membrana quando a pressão osmótica é
excedida. 
- O processo de ultrafiltração é
empregado para concentração, 
dessalinização e fracionamento.
- A força motriz é a diferença de pressão 
entre os lados da membrana. 
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Concentração 
Etapas de Purificação
• Ultrafiltração:
Vantagens do processo:
- utiliza baixas pressões hidrostáticas;
- não ocorre mudança de fase;
- não utiliza reagentes químicos;
- mantém força iônica e pH da solução concentrada;
- evita desnaturação e inativação das enzimas.
Desvantagens:
- Concentração por polarização (acúmulo de moléculas grandes perto da 
superfície da membrana),
- Formação de camadas de géis na membrana (reduz-se através da 
manutenção de escoamento turbulento ou laminar com alta vazão)
- fouling (deposição) na membrana (especialmente agentes anti-espumantes 
usados nas fermentações ocasionam depósitos). 
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Concentração 
Etapas de Purificação
• Ultrafiltração:
- Materiais: Acetato de celulose e polímeros orgânicos (polisulfonas e 
polipropileno)
- Fluxo inversamente proporcional a resistência. Como minimizar a resistência?
- Aumentando o tamanho dos poros (até o máximo)
- Aumentando a quantidade de poros;
- mínima expessura da membrana;
- Máxima hidratação da membrana;
- Mínima viscosidade da solução;
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Concentração 
Etapas de Purificação
• Liofilização:
- Concentração dos sais presentes na solução inicial
- Pode provocar perda na atividade enzimática
- Uma vez ativa em forma de pó: mais estável do que em solução aquosa
- Cuidado: não descongelar durante o processo
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Concentração 
Etapas de Purificação
• A cromatografia pode ser considerada como uma separação diferencial dos 
componentes de uma amostra entre uma fase móvel e uma fase estacionária.
• Fase estacionária: partículas esféricas de um material insolúvel empacotado 
em uma coluna;
• A mistura de enzimas é introduzida na coluna pela fase móvel e forçada a 
migrar através da coluna;
• As enzimas que possuem maior atração pela fase estacionaria irão migrar de 
forma diferenciada das que tem maior afinidade pela fase estacionária.
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Cromatografia 
Etapas de Purificação
Etapas de Purificação
• Cromatografia de gel-filtração (permeação em gel, exclusão por tamanho ou 
peneira molecular)
- Para o fracionamento e purificação de proteínas e aplicável à determinação 
de seus pesos moleculares. 
- Moléculas são separadas de acordo com seu tamanho efetivo quando em 
solução, utilizando matrizes (ou géis) com porosidade definida.
Estabilidade, rigidez, tamanho de partícula, distribuição de poros e inércia 
química são fatores que podem afetar o tamanho da coluna, a vazão a ser 
adotada e a eficiência de separação. 
- Definição: partição difusional das moléculas de soluto entre a fase 
móvel, constituída pelo solvente, e a fase estacionária formada pelos poros 
do gel.
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Cromatografia 
Etapas de Purificação
• Cromatografia de gel-filtração
- Gel: matriz tridimensional, aberta, formada por ligações cruzadas, 
contendo poros de diferentes tamanhos que permitem o acesso de apenas 
algumas moléculas.
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Cromatografia 
Ex.: matrizes formadas por 
ligações cruzadas de dextranas
(Sephadex):
Moléculas maiores: eluídas mais 
rapidamente;
Moléculas menores: movem-se 
mais lentamente por terem um 
maior caminho a percorrer.
Etapas de Purificação
• Cromatografia de gel-filtração
-Escolha do gel: depende da finalidade
- Separação de moléculas maiores (enzima) de menores (sais): geis com
poros pequenos 
- Separação de moléculas de tamanho próximo: géis que fracionam várias
faixas de peso molecular
- Parâmetros críticos para a otimização do processo de gel-filtração:
- volume da amostra;
- concentração da amostra;
- vazão adotada;
- altura do leito da coluna.
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Cromatografia 
Etapas de Purificação
• Cromatografia de gel-filtração
- Vantagens:
- não utilização de energia,
- forças cisalhantes desprezíveis,
- sistemas simples de automação
- altas recuperação aliadas a máxima resolução. 
- Desvantagens: 
- quantidade de amostra aplicada: máx 1-2% do volume total da coluna; 
- géis, Sephadex e Sepharose (agarose), tendem a empacotar;
- problemas de diluição no processo de eluição da coluna. 
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Cromatografia 
Etapas de Purificação
• Cromatografia de gel-filtração
- Equipamento: coluna,detector de UV
coletor de frações
Controle de fluxo (bomba peristáltica)
- Utilizada para etapas finais de purificação, mas pode ser usada na 
dessalinização e na determinação de pesos moleculares.
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Cromatografia 
Etapas de Purificação
• Cromatografia de Troca-iônica
- Fracionamento de substâncias biológicas que apresentem semelhanças em 
suas propriedades químicas e fisico-químicas,
- Método de fracionamento baseado na fixação de substâncias carregadas a 
um suporte que contém uma carga oposta.
A separação ocorre porque as interações eletrostáticas entre os grupos são 
reversíveis e dependentes da afinidade de cada substância pelo trocador.
Esta afinidade é função do pH do meio, da temperatura, da força iônica, do 
tampão, etc.
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Cromatografia 
Etapas de Purificação
• Cromatografia de Troca-iônica
- Suportes: trocadores iônicos ou resinas, sendo normalmente empregados em 
colunas.
As resinas são obtidas pela introdução de grupamentos polares em matrizes 
insolúveis em água. 
Ex.: Celulose, poliacrilamida, géis de dextrana e copolímeros de estireno e 
divinilbenzeno. 
- Classificação:
Permutadores de cátions: 
grupamentos ácidos (ativos em pH > pK)
Permutadores de ânions:
grupamentos básicos (ativos em pH < pK)
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Cromatografia 
Etapas de Purificação
• Cromatografia de Troca-iônica
- Ativação do trocador catiônico:
Os trocadores catiônicos assim tratados são considerados ativos na sua forma 
sódica, ou seja: 
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Cromatografia 
tratamento com 
tampão cujo pH 
deve ser superior 
ao pK do grupa-
mento trocador
trata-se 
com uma 
base forte 
(NaOH)
lava-se 
com água 
deionizada
Trata-se a 
resina com 
um ácido 
forte (HCl)
lava-se 
com água 
deionizada
R-COOH NaOH R-COO- Na+
Forma Inativa Forma Ativa
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• Cromatografia de Troca-iônica
- Ativação do trocador aniônico:
Os trocadores catiônicos assim tratados são considerados ativos na sua forma 
cloreto, ou seja: 
Técnicas de Purificação
Cromatografia 
tratamento com 
tampão cujo pH 
deve ser inferior ao 
pK do grupamento 
trocador
trata-se 
com uma 
base forte 
(NaOH)
lava-se 
com água 
deionizada
Trata-se a 
resina com 
um ácido 
forte (HCl)
lava-se 
com água 
deionizada
R-COOH HCl R-CO+ Cl-
Forma Inativa Forma Ativa
Etapas de Purificação
• Cromatografia de Troca-iônica
- Caso uma solução contendo um cátion X+ for colocada em contato com um 
trocador catiônico ativo, este deslocará o cátion presente no trocador e será
fixado:
- Capacidade total de troca: função do tipo de trocador. 
Importância deste parâmetro: se excedido, os íons não serão totalmente retidos. 
“capacidade disponível ou real de troca”: capacidade de cada trocador em 
uma determinada condição experimental (pH, natureza do tampão, força 
iônica, etc.).
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Cromatografia 
R-COO-Na+ + X+ R-COO- X+ + Na+
Etapas de Purificação
• Cromatografia de Troca-iônica
- Escolha do tipo de resina
Proteínas com cargas positivas e negativas:
Carga é função do pH do meio,
Fator principal: estabilidade da 
molécula nos diferentes pH’s. 
Proteínas labéis: trocadores fracos
- Trocador catiônico (p.ex. CM-celulose), 
uma força iônica baixa e um pH = 5 são 
condições ideais para fixar as proteínas. 
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Cromatografia 
(pK típico dos grupos carboximetílicos = 4) e a maioria das proteínas se 
encontrariam positivamente carregadas (abaixo do seu ponto isoelétrico). 
• Cromatoenfoque:
- As proteínas são eluídas de uma coluna de troca iônica utilizando-se um 
enfraquecedor
- Efeito de enfoque: concentra a enzima de interesse
- A coluna é equilibrada com um tampão e, depois da aplicação da amostra, se 
utiliza um segundo tampão, enfraquecedor de pH (para a eluição).
- Geração de um gradiente linear de pH “in situ” como conseqüência da 
capacidade enfraquecedora da resina.
- Este gradiente de pH tem efeito de enfoque e as moléculas com o ponto 
isoelétrico específico se concentram conjuntamente. 
Etapas de Purificação
Técnicas de Purificação
Cromatografia 
• Cromatografia de adsorção:
- Os componentes da amostra serão retidos ou não sobre a superfície da fase 
estacionária por forças do tipo van der Waals, ligações hidrogênio ou 
interações eletrostáticas. 
- O deslocamento das partículas adsorvidas será função da maior ou menor 
interação destas com a fase estacionária. 
Etapas de Purificação
Técnicas de Purificação
Cromatografia 
• Cromatografia de afinidade:
- Cromatografia de adsorção onde o suporte apresenta afinidade específica com 
a substância a ser isolada.
- É capaz de fornecer um alto grau de purificação. 
- Acopla-se covalentemente uma molécula ligante apropriada a uma matriz 
insolúvel.
- A molécula ligante adsorve da solução a substância a ser isolada, sendo 
eliminadas as que não apresentam nenhuma afinidade com o suporte.
- Dessorção: mudanças nas condições experimentais ([substrato] , coenzimas). 
- Isolamento de substâncias de acordo com sua função biológica
Etapas de Purificação
Técnicas de Purificação
Cromatografia 
• Interação hidrofóbica:
- Observou-se: proteínas são retidas nos géis de afinidade contendo “braços” de 
hidrocarbonetos (C2 a C10).
- As interações hidrofóbicas são mais fortes em alta força iônica sendo, 
portanto, convenientemente utilizadas após a precipitação com sais ou 
cromatografia de troca iônica.
- A eluição pode ser efetuada alterando o pH do solvente, a força iônica ou 
usando um modificador orgânico (como etilenoglicol). 
Etapas de Purificação
Técnicas de Purificação
Cromatografia 
• Eletroforese:
- Existência de grupos ionizáveis nas moléculas biológicas 
- Quando em solução podem existir como espécies eletricamente carregadas.
- A taxa de migração destas partículas, quando submetidas a um campo 
elétrico, é proporcional a força do campo e a carga efetiva das partículas e 
inversamente proporcional ao atrito, dependo da sua forma e tamanho.
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Cromatografia 
• Eletroforese:
- Papel: simples e mais usado 
Em alguns casos, não se obtém uma 
boa separação. 
- Em gel:
amido, agarose e poliacrilamida
Utilização de outros fatores como a 
difusão e a separação por peneiramento 
molecular, além do campo elétrico.
Mais conhecida: SDS-poliacrilamida usada 
na determinação de peso molecular e da
pureza da amostra.
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Cromatografia 
• Eletroforese:
- Sódio dodecilsulfato (SDS): detergente aniônico que se liga fortemente as 
proteínas causando sua desnaturação e fornecendo uma carga negativa constante 
por unidade de massa. 
- Os complexos SDS-proteína: movem-se para o anodo durante a eletroforese.
- Propriedades de peneira molecular do gel: mobilidades são inversamente 
proporcionais ao logaritmo de seus pesos moleculares.
- Proteínas padrão de peso molecular conhecido são aplicadas: o peso molecular 
das amostras proteicas pode ser determinado. 
- Relevação do gel: Comassie Brilliant Blue, Bromofenol – ZnSO4 – ácido acético 
ou Nitrato de prata. 
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Cromatografia 
• Géis bidimensionais:
- Amostras são parcialmente separadas por diferenças entre pontos isoelétricos, 
usando uma coluna cilíndrica.
- O anodo possui um pH menor que o catodo e um gradiente estável de pH é
mantido. 
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Cromatografia 
- Proteínas abaixo do seu pI: carregadas 
negativamente e migrarão para o catodo, 
até uma região onde o pH corresponda a 
seu pI, cessando o movimentode 
migração. Oposto: proteínas acima do 
seu pI.
- Esta técnica é conhecida como 
enfoque isoelétrico. 
• Géis bidimensionais:
- Após separação parcial: eletroforese em SDS no sentido perpendicular à
primeira separação - separação baseada nas diferenças de peso molecular. 
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