Cromatografia - Métodos biofísicos de análise

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1 Rafaela Thais Mendes Sonntag I Biofísica Veterinária 
 
 
 
 
 
 
 
 
• Fase móvel: mistura de substâncias a 
ser fracionada e dissolvida em um 
fluido líquido ou gasoso 
 
• Fase estacionária: solução restante 
em uma matriz fixa 
 
• Pequenas até macromoléculas 
 
• Separar, identificar e quantificar: 
metabólitos, vitaminas, cofatores, 
proteínas, toxinas, aminoácidos, 
nucleotídeos, etc. 
 
 
 
• Diagnóstico 
• Doping 
• Controle de alimentos 
• Controle de medicamentos 
• Contaminação ambiental 
• Toxicologia (intoxicação por 
pesticidas, venenos, plantas tóxicas) 
 
 
 
• Camada delgada (TLC) 
• Camada em papel (PC) 
 
Fase estacionária 
• TLC: sílica (Si2O) 
• PC: celulose + H2O 
 
Fase móvel 
Solvente orgânico 
 
Rf = ds/df 
 
Princípios de separação 
• TLC: separação por adsorção 
└ solubilidade 
• PC: separação por partição 
└ nível de interação de cada 
composto da amostra 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
• Compara e identifica compostos 
 
Amostra aplicada na base da placa → placa 
posicionada sobre o solvente (sem alcançar 
diretamente o local de aplicação dos 
compostos) → solvente difunde pela placa → 
compostos arrastados 
 
• Velocidade de cada composto varia de 
com as interações não-covalentes 
entre as fases estacionária e móvel 
com os analitos 
 
• Compostos apolares maior velocidade 
 
• Compostos polares menor velocidade 
devido interações favoráveis com a 
sílica (polar) 
 
 
Métodos biofísicos de análise 
CROMATOGRAFIA 
APLICAÇÕES 
CROMATOGRAFIA PLANAR 
CROMATOGRAFIA TLC 
 
2 Rafaela Thais Mendes Sonntag I Biofísica Veterinária 
 
 
 
 
 
 
 
 
Resina (fase estacionária) colocada no tubo 
└ beads – carregados 
negativamente ou positivamente 
• Aniônica ou 
catiônica 
 
Aniônica: beads com grupos funcionais 
positivos → retenção de ânions na fase 
móvel 
 
R+ A- + B- ↔ R+ B- + A- 
 
Amostra com solução tampão colocada na 
parte superior → amostra penetra na resina 
 
Grupos carregados de forma oposta à carga 
da resina ficam retidos, ou seja, migram mais 
lentamente. 
 
• Purificação de proteínas: ao alternar 
pH modifica carga líquida e migra com 
velocidades diferentes pela coluna 
 
 
 
 
 
 
• Proteínas com relativamente baixa 
afinidade com a coluna se movem 
mais rapidamente do que as proteínas 
que se ligam ao trocador de íons 
(coluna) com afinidades mais altas 
 
• Quanto maior a afinidade de ligação 
de uma proteína com a coluna, menos 
se moverá 
 
• Para as proteínas fortemente ligadas à 
coluna serem eluidas deverão alterar o 
pH ou alterar concentração de sal 
(muda força iônica) 
└ eluição gradual 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA EM COLUNA 
CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA 
CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA 
COM GRADIENTE DE ELUIÇÃO 
 
3 Rafaela Thais Mendes Sonntag I Biofísica Veterinária 
 
 
 
 
 
 
Resina possui beads que apresentam poros 
nos quais moléculas menores podem se 
encaixar, fazendo com que passem mais 
devagar 
 
• Beads: material esponjoso e poros 
com tamanhos específicos 
 
• Moléculas menores terão mais 
dificuldade de passar e ficarão retidas 
(fração final) já as moléculas maiores 
eluem de forma mais rapidamente 
 
• Separação por tamanho 
 
 
 
• Beads com moléculas específicas 
para interagir com o analito a ser 
separado 
└ antígeno-anticorpo 
└ enzima-substrato 
└ receptor-ligante 
 
• Separação de uma proteína específica 
ou proteínas/moléculas que tenham 
propriedades específicas 
 
• Epóxidos 
 
Para separar a molécula ligada à bead é 
necessário utilizar uma solução que 
apresente maior afinidade para o local de 
ligação da proteína do que o ligante. 
 
Outra maneira de liberar a molécula da 
coluna é alterar as condições da solução de 
modo que o complexo proteína-ligante não 
seja mais estável 
└ mudança de pH, força iônica e/ou 
temperatura (risco de desnaturação) 
 
 
 
 
 
• Separa componentes químicos da 
amostra 
• Determina ausência ou presença do 
composto 
 
Fase móvel: gás 
└ analito também em forma gasosa ou 
volatilizado 
Fase estacionária: sólida ou líquida 
 
Funcionamento 
Dispositivo solta o gás até a fase móvel → 
amostra injetada no gás 
└ diferença de peso dos componentes farão 
que migrem em velocidades diferentes, logo, 
CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO DE 
TAMANHO (GEL FILTRAÇÃO) 
CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE 
CROMATOGRAFIA GASOSA 
 
4 Rafaela Thais Mendes Sonntag I Biofísica Veterinária 
vão acionar o detector em momentos 
diferentes (analito chega ao detector e aciona 
computador) 
 
 
 
 
 
Eixo x: tempo de retenção 
Tempo 0: quando amostra foi injetada 
Tempo final: tempo percorrido até o final 
 
• Cada analito vai ter um tempo de 
retenção que será medido no pico 
• Altura do pico e área do pico 
proporcionais à concentração do 
analito 
└ utiliza a área por parte da curva para 
calcular concentração 
• Picos mais estreitos e nítidos = melhor 
sensibilidade (relação sinal-ruído) e 
melhor resolução (separação de pico) 
 
 
 
 
 
 
 
• Pressões elevadas para forçar a 
passagem do solvente através de 
colunas fechadas que contêm 
partículas muito finas capazes de 
proporcionar separações eficientes 
(com alta resolução) 
 
Fase estacionária 
Partículas porosas esféricas, permeável ao 
solvente, podendo ter algum grupo 
quimicamente ligado. 
 
Fase móvel: líquido 
 
Estrutura de um cromatógrafo líquido: 
 
1- Reservatório de fase móvel; 
2- Sistema de bombeamento da fase 
móvel; 
3- Sistema de injeção; 
4- Sistema analítico: coluna 
cromatográfica; 
5- Sistema de detecção; 
6- Sistema de controle, aquisição e 
registro de dados. 
 
 
 
 
CROMATOGRAMA 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA 
EFICIÊNCIA (HPCL ou CLAE)