aula PCR e sequenciamento Alunos

Prévia do material em texto

Motivo da Consulta 
u Criança encaminhada do 
neuropediatra por quadro de 
atraso de desenvolvimento 
neuromotor e dismorfias faciais 
História Pregressa da 
Moléstia Atual 
u  Criança é fruto de união não consanguínea; 
gestação sem nenhuma intercorrência. 
u  Nascido de parto normal, PN: 3000g; l:49 cm; recebeu 
alta com mãe da maternidade 
u  Triagem neonatal sem alterações; triagem auditiva 
normal 
História Pregressa da 
Moléstia Atual 
SMJ	nasceu	com	uma	hérnia	umbilical	discreta	e	o	pediatra	solicitou	que	
apenas	acompanhasse	a	mesma,	pois	até	os	3	anos	ela	poderia	regredir.	Durante	os	
2	primeiros	anos	de	vida,	SMJ	procurou	o	pronto	socorro	por	diversas	vezes	
(aproximadamente	10	vezes)	por	dor	de	ouvido	e	febre,	recebendo	antibiótico	para	
tratar	otite	aguda	média;	da	mesma	forma,	a	mãe	relata	que	foram	frequentes	os	
episódios	de	diarreia	(aproximadamente	mensais)	com	duração	de	15	dias,	que	
sempre	foram	conduzidos	como	quadros	virais.	
Com	3	anos	de	idade,	CMJ	notou	que	o	rosto	de	seu	filho	estava	ficando	um	
pouco	estranho,	que	a	cabeça	dele	estava	aumentando	de	tamanho	e	que	o	
desenvolvimento	neurológico	estava	atrasado	(ainda	não	falava	nessa	idade).	Ela	
procurou	o	pediatra	de	rotina	que	acompanhava	a	criança,	o	qual	concordou	com	a	
mãe	e	solicitou	uma	avaliação	do	neurologista	pediátrico.		
Após	avaliar	a	criança,	o	neurologista	pediátrico	decidiu	encaminhar	a	criança	
para	o	médico	geneticista.		O	médico	geneticista,	ao	avaliar	o	fenótipo	facial	(figura	
1)	do	paciente	que	entrou	na	sala	de	consulta,	já	formulou	uma	hipótese.	
Antecedentes Familiares 
u  MÃE NEGA, EM SUA FAMÍLIA E NA FAMÍLIA PATERNA, 
CASOS DE: 
u  ATRASO DE DESENVOLVIMENTO MOTOR, 
u  DEFICIÊNCIA INTELECTUAL, 
u  DEFICIÊNCIA AUDITIVA CONGENITA, 
u  DEFICIÊNCIA VISUAL, 
u  TRANSTORNOS DE NEURODESENVOLVIMENTO, 
u  ABORTAMENTO HABITUAL, 
u  SINDROMES GENÉTICAS. 
 
Exame Físico Geral 
u  Criança em bom estado geral, corada, hidratada, anictérica, afebril 
u  Respiratório: presença de roncos difusos de transmissão. 
u  Abdômen: fígado com borda romba e palpável à 6 cm do rebordo costal 
na linha hemiclavicular direita; baço percutível e palpável à 3 cm do 
rebordo costal na linha hemiclavicular esquerda; presença de hérnia 
umbilical. 
u  CV: presença de sopro sistólico em foco mitral +3/+6 
u  Extremidades: grandes articulações (joelho, cotovelo, punhos, tornozelo) 
com restrição importante de movimentação; presença de “mãos em 
garra” 
u  Antropometria (aos 4 anos de idade) 
u  PC: 54 cm (acima de + 2DP) 
u  Peso: 13 kg (IMC entre 0 e + 2DP) 
u  Est: 85 cm (abaixo de -2DP) 
Paciente - Foto 
Exames complementares 
Atividade 
enzimática 
Iduronato 
sulfatase do 
paciente 
(nmoles\h\m
g proteína) 
Referência 
Dosagem urinária de GAG´s (ug/mg de 
creatinina) com predomínio de heparan e 
dermatan sulfato 
Paciente: 500 (VR - abaixo de 84 ) 
 
 
Exames Complementares 
Raio X de 
esqueleto 
Exames Complementares 
u  Ecocardiograma: presença de refluxo mitral leve. 
u  US abdominal: presença de hepatoesplenomegalia 
importante 
u  Audiometria tonal: presença de deficiência auditiva 
de condução grau leve. 
u  RNM crânio: normal. 
 
Discussão 
u  Em qual grupo de doença a atividade dessas enzimas 
pode estar alterada? Esse grupo de doença tem 
vários subtipos. Baseando – se na história clínica e 
exames complementares, qual seria o subtipo? 
u  A degradação de qual macromolécula é afetada 
nessa doença? Qual organela celular contém 
enzimas responsáveis pela degradação dessa 
macromolécula? 
 
Os Glicosaminoglicanos (GAG´s) 
u  Cadeias Longas de Dissacarídeos1 
 
Cargas Negativas 
 - Moléculas Hidrofílicas 
Fígado, pulmão, pele, ossos, 
cartilagens, sistema nervoso 
central, córnea, coração, 
tendão 
Quadro 
multissistêmic
o 
1. Acessado em: 
http://chemistry.tutorvista.com/organicchemistry/glycosaminoglycans.html (dia 
15/05/2015) 
Os Glicosaminoglicanos (GAG´s) 
Tipo de MPS GAG afetada Manifestações clínicas predominantes 
MPS I H heparan e dermatan sulfato 
pele, vasos sanguíneos, coração e tendões, 
fígado, pulmão, sistema nervoso. 
MPS I S heparan e dermatan sulfato 
MPS I H/S heparan e dermatan sulfato 
MPS II heparan e dermatan sulfato 
MPS III A heparan sulfato 
fígado, pulmão, sistema nervoso e matriz 
extracelular 
MPS III B heparan sulfato 
MPS III C heparan sulfato 
MPS III D heparan sulfato 
MPS IV A queratan sulfato 
cartilagens, ossos, córnea 
MPS IV B queratan sulfato 
MPS VI dermatan sulfato pele, vasos sanguíneos, coração e tendões 
MPS VII heparan e dermatan sulfato 
pele, vasos sanguíneos, coração e tendões, 
fígado, pulmão, sistema nervoso. 
MPS IX Acido hialurônico 
Os Glicosaminoglicanos (GAG´s) 1 
Tipo de 
MPS 
Nome Enzima Deficiente 
MPS IH Síndrome de Hurler α-L-iduronidase 
MPS IS Síndrome de Scheie α-L-iduronidase 
MPS IH/S Síndrome de Hurler-
Scheie 
α-L-iduronidase 
MPS II Síndrome de Hunter Iduronato-2-sulfatase 
MPS III A Síndrome de Sanfilippo heparan N-sulfatase 
MPS III B - α-N-acetilglicosaminidase 
MPS III C - α-glicosaminida 
acetiltransferase 
MPS III D - N-acetilglicosamina 6-sulfatase 
MPS IV A Síndrome de Morquio galactose 6-sulfatase 
MPS IV B - β-galactosidase 
MPS VI Síndrome de Maroteaux-
Lamy 
N-acetilgalactosamina 4-
sulfatase 
MPS VII Síndrome de Sly β-glicuronidase 
MPS IX Síndrome de Natowicz hialuronidase 
1.Neufeld & Muenzer. In: The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease 2001: 3421-3452; Muenzer J. The 
mucopolysaccharidoses: a heterogeneous group of disorders with variable pediatric presentations. J Pediatr 2004; 144(5 
Suppl): S27-34 
MPS II - Processo celular fisiológico de 
degradação lissosômica 
Núcleo 
Golgi 
Lisossomos 
manose 
receptor de 
M6P 
vesícula de 
transporte 
fosfato 
enzima I2S 
RE 
I2S 
I2S = iduronato-2-sulfatase 
RE = retículo endoplasmático 
Alberts et al. Molecular Biology of the Cell. 4th ed. New York: 
Garland Science; 2002: 744. 
GAG 
receptor de M6P 
vesícula de 
transporte 
Núcleo 
Golgi 
Lisossomos 
RE 
GAG 
local de 
clivagem das 
GAG pela I2S 
I2S = iduronato-2-sulfatase 
 
1Alberts et al. Molecular 
Biology of the Cell. 4th 
ed. New York: Garland 
Science; 2002: 744; 
2Neufeld EF, Muenzer J. 
The Metabolic and 
Molecular Bases of 
Inherited Disease. New 
York: McGraw-Hill; 2001: 
3421-3452. 
Na deficiência de I2S, a via de 
degradação de GAG não ocorre e os 
Lisossomos ficam cheios de GAG. 
Fisiopatologia da MPS II 
u  Qual o padrão de herança da patologia do paciente? Quais são 
as características desse padrão de herança? 
u  A mãe do probando mencionou que quer engravidar novamente. 
Como ter certeza se a mãe tem ou não chances de ter outro filho 
com patologia? Qual exame complementar\técnica de biologia 
molecular estaria mais indicada nesse caso? 
Discussão 
§  IDENTIFICAR CASOS AONDE É INDICADO O DIAGNÓSTICO MOLECULAR 
 
 
§  INVESTIGAÇÃO GENE CANDIDATO (DOENÇAS MENDELIANAS) 
§  DEFINIR ESTRATÉGIA PARA DIAGNÓSTICO MOLECULAR 
§  VANTAGENS DO USO DO DIAGNÓSTICO MOLECULAR 
 
 
 
 
OBJETIVOS DA AULA 
NÍVEIS DE RESOLUÇÃO DE ANÁLISE CROMOSSÔMICA E GENÔMICA 
Figura 5.1 Thompson & Thompson 
SEQUENCIAMENTO SANGER: GENE CANDIDATO 
 
§  HISTÓRIA FAMILIAL (PADRÃO DE HERANÇA) 
§  ANÁLISE CLÍNICA (FENÓTIPO) 
§  TESTES COMPLEMENTARES 
 ATIVIDADE ENZIMÁTICA 
§  EXAMES COMPLEMENTARES 
IMAGEM 
CARDIOVASCULAR 
US 
 
§FUNÇÃO DO GENE (RELEVANTE PARA A DOENÇA) 
 
ENVOLVIDO	EM	DETERMINADA	DOENÇA,	CONDIÇÃO	OU	ANORMALIDADE	
GENE IDS: IDURONATO 2-SULFATASE (MPS II, HUNTER SYNDROME) 
Cytogenetic Location: Xq28 
Região Xq27-q28 
MUTAÇÕES PONTUAIS IDENTIFICADAS 
§  SENTIDO TROCADO 
§  SEM SENTIDO 
§  MUDANÇA DE FRAME 
§  DELEÇÃO DE Aa 
(múltiplos de 3 ) 
 
INATIVADORAS 
IDS GENE: 9 EXONS (24 KB) 
http://www.ensembl.org/Homo_sapiens		
QUAL ESTRATÉGIA? 
MUTAÇÕES 
INATIVADORAS 
(>300) 
VARIANTES 
PATOGÊNICAS (%) 
MUTAÇÕES 
PONTUAIS 
82% 
DELEÇÕES GENE 
OU EXONS 
9% 
REARRANJOS 
COMPLEXO 
9% 
QUAL A ESTRATÉGIA PARA BUSCA DE MUTAÇÕES? 
3’UTR 
Fim da 
transcrição 
Início da 
transcrição 
PROMOTOR 
ATG 
Íntron 
Éxon 
1 2 3 4 5 6 7 8 9 
9 EXONS (~24.000pb) 
Região Regulatória 5’ e 3’ 
5’UTR 
3’ 
QUAL A ESTRATÉGIA PARA BUSCA DE MUTAÇÕES? 
MUTAÇÕES SENTIDO TROCADO (MISSENSE) 
C. 1402C>T: R468W: ARGININA PARA TRIPTOFANO 
C. 1403G>A: R468Q: ARGININA PARA GLUTAMINA 
C. 1403G>T: R469L: ARGININA PARA LEUCINA 
Deleção de 3 nucleotídeos 
c. 473delTCC: del117S : deleção de Serina na posição 117 
Exon 3 
Exon 9 ARGININA:	CGU		 ARGININA:	CGU		
COMO ANALISAR A REGIÃO DE INTERESSE? 
MUTAÇÕES 
INATIVADORAS 
(>300) 
VARIANTES 
PATOGÊNICAS (%) 
EXEMPLO DE 
METODOLOGIA 
UTILIZADA 
MUTAÇÕES 
PONTUAIS 
82% SEQUENCIAMENTO 
DELEÇÕES GENE 
OU EXONS 
9% PCR QUANTITATIVO 
MLPA 
REARRANJOS 
COMPLEXO 
9% 
GENE IDS: EXON 9 
http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0	
	
ALGUNS PARÂMETROS: 
§  LOCALIZAÇÃO 
§  TAMANHO DO PRODUTO DE 
PCR DESEJADO 
§  TAMANHO DE CADA OLIGO 
§  TEMPERATURA DE 
ANELAMENTO APROXIMADA 
§  PORCENTAGEM DE CG EM 
CADA PRIMER 
PRIMERS 
QUÍMICAS 
FÍSICOS 
ANELAMENTO 
	
4	CICLOS	
	
	
3	CICLOS	
2	CICLOS	
1	CICLOS	
FÍSICOS 
EXTENSÃO 
40 CICLOS 
APÓS 40 CICLOS..... 
SUBSTITUIÇÃO DE BASE: O TAMANHO DO PRODUTO NÃO ALTERA 
IDENTIFICAÇÃO DA MUTAÇÃO NO EXON 9 DO GENE IDS 
P1 P2 P3 P4 
Normal ou Mutado? 
151pb 
IDENTIFICAÇÃO DA MUTAÇÃO NO EXON 9 DO GENE IDS 
DELEÇÃO: O TAMANHO DO PRODUTO ALTERA 
P1 P2 P3 P4 
151pb 
MUTAÇÕES 
INATIVADORAS 
(>300) 
VARIANTES 
PATOGÊNICAS 
(%) 
EXEMPLO DE 
METODOLOGIA 
UTILIZADA 
MUTAÇÕES 
PONTUAIS 
82% SEQUENCIAMEN
TO 
DELECÕES 
GENE OU 
EXONS 
9% PCR 
QUANTITATIVO 
MLPA 
REARRANJOS 
COMPLEXO 
9% 
SEQUENCIAMENTO 
SEQUENCIAMENTO: FORMA DE DETERMINAR A ORDEM LINEAR 
DAS BASES DE UM FRAGMENTO (DE PCR, POR EXEMPLO). 
•  MÉTODO DIDESOXI 
–  CRIADO EM 1977 POR FREDERICK SANGER 
–  BASEIA-SE NA EXTENSÃO ENZIMÁTICA DA FITA DE 
DNA E SUA INTERRUPÇÃO PELA INCLUSÃO DE 
ANÁLOGOS DE NUCLEOTÍDEOS DEFICIENTES NO 
GRUPAMENTO 3’ OH (DIDESOXI). 
–  SEPARAÇÃO “ELETROFORÉTICA" DOS FRAGMENTOS 
DIDESOXINUCLEOTÍDEO (ddNTPs) 
CADEIAS PREMATURAMENTE FINALIZADAS 
REAÇÃO	DE	SEQUENCIAMENTO		
DNA MOLDE (PCR) 
 
PRIMER F (OU R) 
TAQ POLIMERASE 
TAMPÃO 
dNTPS (dATP, dCTP, dTTP, dGTP)	
		
ddNTPS, TERMINADORES 
PRODUTO PCR 
EXON 9 IDS 
OS	FRAGMENTO	SÃO	SEQUENCIADOS	SIMULTANEAMENTE	
PRIMER	EXON		9	GENE	IDS	
96	AMOSTRAS	SIMULTANEAMENTE	(	16-	384)	
HIGH	RESOLUTION	ELETROPHORETIC	SEPARATION	
HIGH	RESOLUTION	ELETROPHORETIC	SEPARATION	
HIGH	RESOLUTION	ELETROPHORETIC	SEPARATION	
…CAT	TTT	CGA		TTC	CGT	…	
…CAT	TTT	TGA		TTC	CGT	…	
MUTAÇÃO	EM	HETEROZIGOSE	
(PORTADORA)	
CGA>	TGA	
c.1327C	>	T	transition	in	exon	9	,	changes	codon	443		
PATERNO	 MATERNO	
			
…CAT	TTT	TGA		TTC	CGT	…	
MUTAÇÃO	EM		HEMIZIGOSE			
CGA>	TGA	
c.1327C	>	T	transition	in	exon	9	,	changes	codon	443		
O SEQUENCIAMENTO DE SANGER DO 
GENE IDS REVELOU VARIANTE 
PATOGÊNICA EM HETEROZIGOSE NA 
MÃE 
c. 1505 C>G (p.Trp502Ser) 
 
Com base nisso, e sabendo- se do 
padrão de herança da doença, 
como você faria o Aconselhamento 
Genético? 
Discussão 
QUAL	SERIA	PRÓXIMO	PASSO,	CASO	NÃO	
TIVÉSSEMOS	IDENTIFICADO	A	MUTAÇÃO	
NO	EXON	9	DO	GENE	IDS?	
1 2 3 4 5 6 7 8 9 5’ 3’ 
QUAL A ESTRATÉGIA PARA BUSCA DE MUTAÇÕES? 
MUTAÇÕES MAIS PREVALENTES EXONS 3, 8 E 9 
MUTAÇÕES SENTIDO TROCADO (MISSENSE) 
C. 1402C>T: R468W: ARGININA PARA TRIPTOFANO 
C. 1403G>A: R468Q: ARGININA PARA GLUTAMINA 
C. 1403G>T: R469L: ARGININA PARA LEUCINA 
Deleção de 3 nucleotídeos 
c. 473delTCC: del117S : deleção de Serina 
Exon 3 
Exon 9 
§  MOLECULAR TESTS 
§  CYTOGENETIC TESTS 
§  BIOCHEMICAL TESTS 
 
§  MULTI-METHODS PANEL 
§  MULTI-GENE PANEL 
§  >4700 FENÓTIPOS COM GENES CONHECIDOS (OMIM) 
§  HETEROGENEIDADE ALÉLICA É A REGRA 
§  MUITOS GENES >100 MUTAÇÕES 
§  SEQUENCIAMENTO DE DNA IDENTIFICA TODAS AS MUTAÇÕES 
(INDEPENDENTE DA PREVALÊNCIA, SEREM DESCRITAS) 
§  IDENTIFICA AFETADOS E PORTADORES (DECISÕES GRAVIDEZ) 
§  TERAPIA ESPECÍFICA MUTAÇÕES 
SEQUENCIAMENTO 
CASO CLÍNICO 
2 
“MEU FILHO NÃO CRESCE” 
EDUARDO PERRONE – 28.03.2018 
IDENTIFICAÇÃO PESSOAL 
•  GCJ, sexo feminino, 4 anos, natural e procedente de São Paulo 
 
 
•  Mãe, ACJ, 36 anos, natural e procedente de São Paulo. 
 
MOTIVO DA CONSULTA 
• Encaminhado da Endocrinologia 
Pediátrica por baixa estatura 
HISTÓRIA PREGRESSA DA MOLÉSTIA 
ATUAL 
•  Criança é fruto de união não consanguínea; mãe G1P1A0 
•  US morfológico de primeiro trimestre mostrou discreto aumento de 
translucência nucal. (2,6mm) 
 
•  Parto normal, nascendo com idade gestacional de 39 semanas; peso: 
2,500Kg e comprimento: 49 cm 
•  Notaram que a criança tinha o pescoço um pouco curto ao nascer e com edema 
em mãos, mas como evoluiu bem, recebeu alta com 3 dias de vida. A triagem 
neonatal da criança era normal. 
•  Marcos do DNPM: Apresentou sustento do segmento cefálico com 3 meses, 
sentou sem apoio com 8 meses; andou com 1 ano e falou com 1 ano e 2 meses. 
•  Intercorrências na infância: Com 2 anos, pediatra notou que criança estava abaixo 
da estatura para sua idade e que tinha a face com algumas características 
diferentes. A mesma, diante do quadro da criança solicitou alguns exames 
complementares, porém os mesmos não conseguiram elucidar a causa. A pediatra 
encaminhou a criança para endocrinologista pediátrico que solicitou alguns 
exames e que devido ao fenótipo, associado à baixa estatura, encaminhou a criança 
para você, médico geneticista. 
 
HISTÓRIA PREGRESSA DA MOLÉSTIA 
ATUAL 
ANTECEDENTES FAMILIARES 
•  MÃE NEGA, EM SUA FAMÍLIA E NA FAMÍLIA PATERNA, CASOS 
DE: 
•  ATRASO DE DESENVOLVIMENTO MOTOR, 
•  DEFICIENCIA INTELECTUAL, 
•  DEFICIENCIA AUDITIVA CONGENITA, 
•  DEFICIENCIA VISUAL, 
•  TRANSTORNOS DE NEURODESENVOLVIMENTO, 
•  ABORTAMENTO HABITUAL, 
•  SINDROMES GENÉTICAS 
EXAME FÍSICO GERAL 
•  Criança em bom estado geral, corada, hidratada, eupnéica, anictérica. 
•  Respiratório, Abdômen: normais. 
•  Cardiovascular: presença de sopro sistólico discreto em foco 
pulmonar 
•  Extremidades sem alterações 
•  Antropometria (aos 4 anos de idade) 
•  PC: 48 cm (entre 0 e -1DP) 
•  Peso: 13 kg (IMC entre 0 e + 2DP) 
•  Est: 85 cm (abaixo de -2DP) 
EXAME FÍSICO GERAL 
 EXAME MORFOLÓGICO 
 EXAME MORFOLÓGICO 
RESUMO DO QUADRO 
Criança com baixa estatura, sem aparente 
atraso de DNPM, com alteração de ausculta 
cardíaca. 
QUESTÕES 
1. DESCREVA O EXAME 
MORFOLÓGICO DA 
PACIENTE? 
 EXAME MORFOLÓGICO 
 EXAME MORFOLÓGICO 
QUESTÕES 
2. QUAIS OUTRAS INFORMAÇÕES DO EXAME FÍSICO (ANTROPOMETRIA) SÃO 
IMPORTANTES PARA O RACIOCÍNIO DA ETIOLOGIA DA BAIXA ESTATURA E QUE NÃO 
FORAM MENCIONADAS? 
a.  RELAÇÃO SEGMENTO SUPERIOR/INFERIOR:1,24 (ESPERADA PARA IDADE: 1,22) 
b.  ENVERGADURA-ESTATURA: -4,0 (ESPERADA PARA IDADE: -3,8) 
c.  VELOCIDADE DE CRESCIMENTO: 3,5 CM\ANO 
d.  ESTATURA DOS PAIS: 
 PAI: 180 cm 
 MÃE: 172 cm 
 CANAL DE CRESCIMENTO: 172 + (180-13)/2 +/- 6cm – entre 165 e 176 – entre 0 
e + 2DP 
QUAIS EXAMES COMPLEMENTARES VOCÊ 
SUPÕE QUE A PEDIATRA POSSA TER 
SOLICITADO? 
•  Raio X de idade óssea: compatível com 1 anos e 11 meses 
•  Dosagem GH\IGF-1\IGF-BP3: normal para idade 
•  Dosagem de hormônios tiroidianos (TSH\T4L): normal para idade 
•  Urina I, Urocultura, Hemograma: normais 
•  Anticorpo antitransglutaminase: negativo. 
 
DIANTE DA INVESTIGAÇÃO JÁ 
PREVIAMENTE REALIZADA, QUAIS EXAMES 
COMPLEMENTARES VOCÊ SOLICITARIA? 
•  ECOCARDIOGRAMA: PRESENÇA DE ESTENOSE PULMONAR 
SEM REPERCUSSÃO HEMODINÂMICA 
•  US ABDOMINAL TOTAL E PÉLVICO: SEM 
ALTERAÇÕES\OVÁRIOS VISUALIZADOS 
•  CARIÓTIPO CONVENCIONAL BANDA G: 46,XX 
 
BASEANDO-SE NO FENÓTIPO E NOS 
RESULTADOS ANTERIORES, VOCÊ ENTROU 
EM BANCOS DE DADOS DE DOENÇAS 
MENDELIANAS (WWW.OMIM.ORG) E 
CRUZOU OS TERMOS “PULMONIC 
STENOSIS” AND “SHORT NECK”. 
 
QUAL POSSIBILIDADE DIAGNÓSTICA 
PARA ESSA PACIENTE? 
SÍNDROME DE 
NOONAN 
QUAL EXAME MOLECULAR SERIA MAIS 
ADEQUADO PARA CONFIRMAR O 
DIAGNÓSTICO? 
• SEQUENCIAMENTO DO GENE 
PTPN11 POR TÉCNICA DE 
SANGER: NÃO FORAM 
IDENTIFICADAS VARIANTES 
PATOGÊNICAS NO GENE PTPN11 
APÓS LER O CONTEÚDO DO “GENE 
REVIEWS” CONSTANTE NO OMIM, VOCÊ 
ENCONTRA UMA JUSTIFICATIVA PARA O 
FATO DE O SEQUENCIAMENTO 
ANTERIOR TER VINDO NORMAL. QUAL É 
ESSA JUSTIFICATIVA? 
• HETEROGENEIDADE 
GENÉTICA 
DIANTE DISSO, QUAL EXAME VOCÊ 
SUGERIRIA, PENSANDO AINDA NA HD DE 
SÍNDROME DE NOONAN? 
• Sequenciamento de painéis de genes 
associados a Síndrome de Noonan por 
técnica de sequenciamento de nova 
geração (NGS) 
PAINÉIS COMERCIAIS - RASOPATIAS 
Diferentes Genes com 
Mesmo Fenótipo 
(PTPN11,SOS – Noonan) 
 
 
Diferentes Fenótipos e 
Mesmos Genes 
(KRAS – Costello e Noonan 
PTPN11 – Leopard e 
Noonan) 
 
1870						...								 										1940 											1953 																		1975 				1977 				 						2005																								Atual	
DESCOBERTA	DO	DNA	
(MIESCHER)	
DNA	COMO	‘MATERIAL	
GENÉTICO’	(AVERY)	
DUPLA	HÉLICE	
(WATSON	&	CRICK)	
TERMINAÇÃO	DE	CADEIA	
(SANGER)	
DEGRADAÇÃO	QUÍMICA	
(GILBERT)	
SEQUENCIAMENTO	DE	
NOVA	GERAÇÃO	
BREVE HISTÓRICO 
32 Anos GILBERT	 	 RECEBEU	 	 PRÊMIO	 NOBEL	 DE	 QUÍMICA	 EM	1980,	 QUE	 COMPARTILHOU	 COM	 PAUL	 BERG	 E	
FREDERIC	SANGER	(BRITÂNICO)			
TERCEIRA	GERAÇÃO	
§  Helicos	Bio.	(tSMS)	
§  	Pacific	Bio.	(SMRT)	
§  Nanoporos	
§  Ion	torrent	(Life)	
SEGUNDA	GERAÇÃO	
§  Illumina	(Solexa)		
§  	Roche	454	Pirosequenciamento	
§  SOLiD	(Applied,	Life	Tech)	
PRIMEIRA	GERAÇÃO	
• 	Sanger	
• 	Químico	(Gilbert)	
SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO 
CATCH ALL TERMS 
§  GENE ALVO 
§  ONE-BY-ONE (UMA MOLÉCULA É SEQUENCIADA POR REACÃO) 
CUSTO			 TEMPO	
Genoma	
Humano	
(1990-2003)	
U$	3	Bilhões	 10	anos	
	
2007	
		
	NGS	
Today	 U$	5.000	 1	dia	
§  DEMANDA BAIXO CUSTO: ALTO CUSTO TORNA INVIÁVEL SUA UTILIZAÇÃO 
PARA O SEQUENCIAMENTO DE MUITOS GENOMAS HUMANOS; 
§  NATUREZA ANALÓGICA (COMPARATIVA) DO MÉTODO RESULTA NA 
INCAPACIDADE DE DETECTAR ALELOS RAROS DENTRO DE UMA POPULAÇÃO 
CELULAR. 
LIMITAÇÕES DO MÉTODO DE SANGER 
Next-Generation	
Sequencing	(NGS)	
Throughput (330GB vs. 1read de 600pb) 
Custo	
Rapidez			
Sensibilidade	
Acurácia	
Cobertura				
(Repetição	é	intrínseco)	
PRODUÇÃO DE GRANDE VOLUME DE DADOS À UM BAIXO CUSTO E MENOR 
QUATIDADE DE TEMPLATE 
ALTA	QUALIDADE	DOS	DADOS	GERADOS			
BIOINFORMÁTICA 
Whole Genome Sequencing (WGS). Genoma 
Completo 
§  De novo Sequencing (=from de beginning). 
Sequenciado e montado sem a disponibilidade de 
um genoma de referência 
 
§  Resequencing: Genoma é sequenciado e 
“montado” de acordo com genoma de referência 
 
 Comparar genomas de espécies, câncer… 
 
 
 
SEQUENCIAMENTO DO GENOMA 
PREPARAÇÃO	DA	AMOSTRA	
A	 B	
A	 B	
FRAGMENTAÇÃO	 LIGAÇÃO	DOS	ADAPTADORES	 SELEÇÃO	DOS	FRAGMENTOS	
PREPARAÇÃO 
AMOSTRA 
AMPLIFICAÇÃO 
CLONAL SEQUENCIAMENTO 
§  MECÂNICA 
§  
§  ENZIMÁTICA 
§  EMULSÃO 
 
§  SOLID-PHASE 
(ARRAY BRIDGE) 
 
§  By Ligation 
§  By Synthesis 
(Light Production) 
PREPARAÇÃO AMOSTRA AMPLIFICAÇÃO CLONAL SEQUENCIAMENTO 
 
primer	F	
primer	R	
SEQUENCING	BY	SYNTHESIS		
PCR:	SOLID-PHASE	
Illumina’s	Solexa	
Whole Genome Sequencing (WGS). Genoma Completo 
§  De novo Sequencing (=from de beginning). Sequenciado e 
montado sem a disponibilidade de um genoma de referência 
 
§  Resequencing: Genoma é sequenciado e “montado” de acordo com 
genoma de referência 
 
 Comparar genomas de espécies, câncer… 
 30-50 X de Cobertura 
 
Whole Exome Sequencing 
 180.000 exons-1% genoma, 30 milhões pb 
 500-1000 X de Cobertura (variantes raras) 
 
Target genome sequencing: sequenciamento de áreas de interesse 
 
 
TIPOS DE SEQUENCIAMENTO DO GENOMA 
Whole	Genome	 Exome		 Target	Sequencing	
MUTAÇÕES	PONTUAIS	
CNV	
VARIANTES	ESTRUTURAIS	
MUTACÕES	PONTUAIS	
CNV	
		
MUTACÕES	PONTUAIS	
DELECÕES	
		
§  MECÂNICA 
§  
§  ENZIMÁTICA 
§  Hydrogen Ions 
§  Light Production 
PREPARAÇÃO 
AMOSTRA 
AMPLIFICAÇÃO 
CLONAL 
SEQUENCIAMENTO 
 
TARGET DNA ENRICHMENT 
EXOME TARGET GENE LIST 
§  EMULSÃO 
 
§  SOLID-PHASE 
(ARRAY BRIDGE) 
 
§  By Ligation 
§  By Synthesis 
(Light Production) 
 
§  By Ligation 
§  By Synthesis 
(Light Production) 
TARGER ENRICHMENT 
TARGER ENRICHMENT 
TARGET	SEQUENCING	
SÍNDROME DE NOONAN/RASOPATIAS 
§  EVIDÊNCIA PARA HETEROGENEIDADE DE LOCUS: 
DIFERENTES GENES, MESMO FENÓTIPO (PTPN11 E SOS) 
 
§  ESTRATÉGIA DIAGNÓSTICA 
§  SEQUENCIAMENTO DE GENE ÚNICO (PTPN11) 
§  SEQUENCIAMENTO DE VÁRIOS GENES 
 PAINEL COM 16 GENES 
GENES	(n=16) 	CROMOSSOMO TAMANHO	(PB) 	EXONS 
BRAF	 7q34 208.814	 	21	
CBL	 11q23.3 101.874		 16	
HRAS	 11p15.5 5.045	 7	
NRAS	 1p13.2 12.341	 5	
KRAS	 12p12.1 46.148	 8	
LZTR1	 22q11.2 19.576	 21	
MAP2K1	 15q22.31 105.496	 13	
MAP2K2	 19p13.3 33.864	 13	
NF1	 17q11.2 374.244	 62	
PTPN11	 12q24.13 91.568	 16	
RAF1	 3p25.2 80.626	 20	
RIT1	 1q22 13.597	 7	
SHOC2	 10q25.2 94.125		 14	
SOS1	 2p22.1 143.349	 26	
SOS2	 14q21.3 114.759	 23	
SPRED1	 15q14 105.163	 9	 283	exons	
PAINEL: SÍNDROME DE NOONAN E RASOPATIAS 
§  MOLECULAR TESTS 
§  CYTOGENETIC TESTS 
§  BIOCHEMICAL TESTS 
 
§  MULTI-METHODS PANEL 
§  MULTI-GENE PANEL 
MUDANÇAS NO WORKFLOW DOS TESTES GENÉTICOS 
“SEQUENCE FIRST” 
OBJETIVOS USO DE NGS -PAINÉIS 
§  IDENTIFICAÇÃO DE VARIANTES RARAS (WGS, WES) 
§  CONFIRMAR DIAGNÓSTICO CLÍNICO (HETEROGENEIDADE 
LOCUS E ALÉLICA) 
 
§  OFERECER UMA INTERVENÇÃO TERAPÊUTICA RÁPIDA 
 
§  DEFINIR AS ESTRATÉGIAS TERAPÊUTICAS 
§  ACONSELHAMENTO GENÉTICO 
§  DETERMINAR O PROGNÓSTICO DAS DOENÇAS 
 
 
§  QUANDO SOLICITAR 
§  PARA QUEM 
§  QUE TIPO DE TESTE (SINGLE GENE/PAINEL, WES, WGS....) 
§  COMO INTERPRETAR E COMUNICAR OS RESULTADOS 
§  COMO REPORTAR OS ACHADOS INCIDENTAIS.. 
§  RESULTADOS INCONCLUSIVOS (NOVAS VARIANTES EM GENES 
CUJO PAPEL NA DOENÇA NÃO ESTÁ BEM ESTABELECIDO) 
§  LIMITAÇÕES: PROPORÇÃO DOS PAINÉIS AINDA TEM RESULTADO 
NEGATIVO 
IMPLICAÇÕES DOS TESTES 
DESAFIOS QUE IMPULSIONAM 
§  HETEROGENEIDADE DE LOCUS: 1 DOENÇA, VÁRIOS GENES 
 
 
§  QUÃO ESPECÍFICO É O FENÓTIPO DO PACIENTE ?? (DEFINIRÁ O 
CONJUNTO DE GENES QUE DEVEMOS INVESTIGAR) 
§  SOBREPOSIÇÃO DE FENÓTIPOSMUDANÇAS EM DIREÇÃO AO GENOME-WIDE NGS 
ALGORITMO DE INVESTIGAÇÃO 
DIAGNÓSTICO 
Síndrome 
Cromossômica 
Reconhecível 
Ex.: Síndrome de 
Down, Turner, 
Patau 
Cariótipo 
convencional 
banda G 
Síndrome de 
Microdeleção 
reconhecível (não 
visível ao cariótipo) 
Ex.: Síndrome 
Williams, Síndrome 
Velocardiofacial 
FISH/MLPA 
ALGORITMO DE INVESTIGAÇÃO 
DIAGNÓSTICO 
Estigmas de 
Síndrome 
Cromossômica 
sem definição 
clara de fenótipo 
Hibridização 
Genômica 
comparativa 
ALGORITMO DE INVESTIGAÇÃO 
DIAGNÓSTICO 
Suspeita de Síndrome 
Monogênica bem 
reconhecível 
Gene Único – 
Mutação Específica 
Mais comum 
Síndromes com 
grande 
heterogeneidade 
genética 
Sequenciamento de 
Sanger 
Painel de genes 
(NGS) 
ALGORITMO DE INVESTIGAÇÃO 
DIAGNÓSTICO 
Suspeita de Síndrome 
Monogênica após extensa 
investigação e sem gene 
conhecido ou com grande 
heterogeneidade genética 
Sequenciamento Exômico 
(Tentativa de identificar gene 
candidato) 
REFERÊNCIAS 
•  Annu Rev Genomics Hum Genet. 2013; 14: 355–369. 
•  www.omim.org. Acessado em 01 de março de 2017 
•  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1124. 
Acessado em 01 de março de 2017 
•  Clinical and Molecular Findings of Tunisian Patients 
with RASopathies. Mol Syndromol 2014;5:212–217 
OBRIGADO 
Eduardo Perrone 
duperrone@uol.com.br