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RESISTÊNCIA DE PEPTÍDEO NATRIURÉTICO DE ARTÉRIAS MESENTÉRICAS EM RATO ESPONTANEAMENTE HIPERTENSIVO É ALIVIADO PELO EXERCÍCIO
INTRODUÇÃO
Hipertensão é um importante problema de saúde pública Mundial devido à sua alta prevalência e aumento concomitante do risco de doença. Tem sido estimado que 29% da população adulta do mundo, ou aproximadamente 1,56 bilhões de pessoas, terão hipertensão até 2025 (Lemogoum 2014, Shrivastava et al., 2014). A hipertensão infantil é um problema sério de saúde pública. Problema mundial, especialmente na China. Estudos Epidemiológico sugeriram que a hipertensão na infância Faixa na idade adulta. Além disso, a hipertensão 
a infância foi fortemente associada ao aumento das taxas de Morbidade e mortalidade durante a idade adulta (Xi et al. 2014). Portanto, é importante esclarecer Mecanismo que envolveu os "pontos de partida" para hipertensão.
A hipertensão é uma doença caracterizada aumento persistente do tônus ​​vascular, especialmente no Vasculatura de resistência. Tanto os grupos funcionais (isto é, sensibilidade dos músculos lisos vasculares) e estruturais (Isto é, a proporção de espessura mediana em relação ao lúmen Diâmetro) nas artérias de resistência foram encontrados Espontaneamente hipertenso (SHR), assim como em Hipertensão primária humana (Mulvany 1991). Estes Anormalidades são geralmente estreitamente correlacionadas Pressão, mas é uma questão se as anormalidades Causa ou são as conseqüências do aumento do pressão. É importante notar que essas alterações na As artérias de resistência ocorrem tão cedo na vida que Servem como principais "pontos de partida" para a hipertensão. Assim, Sugere que as anormalidades da Atividade muscular e da hemodinâmica na resistência Artérias, particularmente nas fases iniciais da Hipertensão arterial, desempenham um papel importante desenvolvimento de hipertensão (Folkow 1997).
O péptido natriurético atrial (PNA), um Hormônio, principalmente secretado pelo átrio resposta a forças de estiramento induz diurético, natriurético Vasorelaxantes e desempenha um papel importante na Homeostase da pressão arterial, bem como de água e sal Equilíbrio (De Vito 2014). Os estudos in vitro fornecem Evidencia que a ANP é um potente agente vasodilatador em ratos Aorta abdominal, artéria pulmonar e mesentérica Resistência via via cGMP-PKG (Feng et al. 1999, Iwatani et al. 2007).
Foi relatado que, em tais condições fisiopatológicas Como microgravidade (Behnke et al., 2008), e lesões do endotélio (Iwatani et al., 2007), a vasoconstrição Das artérias de resistência mesentérica é alterada,
E estas alterações estão associadas com os níveis de pressão. No entanto, a responsividade das artérias de resistência em fases iniciais da hipertensão primária, bem como papel funcional na hipertensão é amplamente desconhecido. Assim, o estudo atual é entregue para testar a sensibilidade alterações das artérias mesentéricas ao péptido natriurético hipertensos espontâneos, a fim de revelar um novo mecanismo de hipertensão. Além disso, a intervenção efeitos do exercício foram avaliados sob a ótica
Medicina de transformação para fornecer evidências de prevenção e terapêutica por meio do execício físico.
MATERIAIS E MÉTODOS
Reagentes: Todos os produtos químicos e reagentes foram Sigma (Sigma, St. Louis, MO, EUA), a menos que indicado de outra forma. Animais SHR (Ratos Espontâneos Hipertensos) e WKY (Wistar Kyoto) foram alojados em gaiolas separadas Em uma sala com temperatura controlada (22-24 ° C) sob uma pressão de 12 h Luz / ciclo de 12 horas com acesso livre a comida e água. Todos os procedimentos animais descritos neste estudo foram aprovado pelo Comitê de Cuidados com Animais de Xi'an Universidade Médica.
Grupos de animais e protocolos de treino Conforme ilustrado na Figura 1, havia 60 animais Atribuídos em 6 grupos (n = 10): (1) ratos WKY de 4 semanas de idade; (2) SHR de 4 semanas de idade; (3) ratos WKY de 16 semanas de idade; (4) SHR de 16 semanas de idade; (5) ratos WKY de 16 semanas de idade treinados com exercício; (6) SHR de 16 semanas de idade treinado com exercício. Os ratos WKY e SHR nos grupos exercitados foram treinados, livre de carga, 5 dias / semana por 12 semanas em um tanque de 60-90 cm cheio com aproximadamente 50 cm de profundidade de água a 33-35 ° C. Os ratos nadaram em grupos de três ou quatro animais. Os ratos nadaram durante 15 min no primeiro dia, eo A duração da natação foi então progressivamente 60 min / dia em 1 semana.
Avaliação da angiotose
Os ratos foram anestesiados com Pentobarbital sódio (30 mg / kg, i.p.). As artérias mesentéricas foram isoladas de ratos como descrito (Wang et al., 2011) e cortados em anéis. Após a obtenção de uma Contração induzida por NE (norepinefrina, 10-6 mol / l), A integridade funcional do endotélio foi avaliada por registrando o relaxamento para 10-5 mol / l de acetilcolina. As respostas vasculares à ANP foram determinadas Segmentos arteriais mesentéricos a quatro concentrações de ANP (10-9, 10-8, 10-7-, 10 6 mol / l), e os resultados alterações na tensão isométrica foram registradas durante 10 min após cada concentração de ANP. Para a inibição de PED5, Sildenafil (30 μmol / l) foi adicionado à solução do banho 15 min antes do tratamento da ANP. Em análise, o valor máximo amplitude de contração induzida pela norepinefrina (10-6 mol / l foi ajustado como 100%. 
Avaliação da pressão arterial
Os ratos foram anestesiados com Pentobarbital sódio (30 mg / kg, i.p.). A pressão arterial Foi medido através de um cateter de polietileno canulado em As artérias carótidas esquerdas. Sistólica arterial e diastólica pressão arterial (PAS e PAD) foram continuamente Através de um sistema de aquisição de dados (BL-420S Sistema, Taimeng, Chengdu, China).
Medições de cGMP plasmático e ANP
O sangue foi recolhido em tubos contendo EDTA, e foi imediatamente colocado em gelo. As amostras foram centrifugada a 2000 rpm durante 30 min, separada por plasma e armazenado a -80 ° C. ANP plasmático e cGMP foram determinados kits comercialmente disponíveis (Ásia Instituto de Imunotecnologia, Hospital Geral de Exército Popular de Libertação da China, Pequim, China). O De plasma de cGMP para plasma ANP (cGMP / ANP) foram Calculados e utilizados como marcadores in vivo de sinalização Sensibilidade à ANP. Ensaios de actividade de PDE5 de tecido A atividade de PDE foi medida seguindo (Gopal et al., 2001). Artérias mesentéricas Dos ratos foram dissecados e homogeneizados em 20 mmol / l Tris-HCl a pH 7,2, contendo 0,2 mmol / l de EGTA, 5 mmol / L de 3-mercaptoetanol, 2% (v / v) de antiprotease 1 mmol / l de PMSF, 0,1% de Triton X-100, 5 mmol / l MgCl2 usando um homogeneizador de vidro em gelo. O homogeneizados foram centrifugados a 14000 xg durante 30 min a 4 ° C, os grânulos foram ressuspensos na homogeneização E centrifugou-se a 14000 xg durante 30 min a 4 ° C. O primeiro e o segundo sobrenadantes foram reunidos e Utilizados para análise posterior.
As reações foram iniciadas pela adição de tecido Homogeneizado a uma mistura reacional contendo 40 mmol / l Mops (pH 7), 0,8 mmol / l de EGTA, 15 mmol / l de magnésio Acetato, 2 mg / ml de albumina de soro bovino, [3 H] cGMP (80000-150000 cpm por tubo de ensaio) e variando Concentrações de cGMP não marcado, respectivamente. As misturas de reacções foram incubadas a 30 ° C durante 15 min. Adicionou-se uma mistura com os seguintes ingredientes Terminar a reacção: 50 mmol / l EDTA, 30 mmol / l Teofilina, 10 mmol / l de GMPc em 100 mmol / l de Tris (PH 7,5). Veneno de cobra 50-nucleotidase (Sigma) (200 mg) à mistura de ensaio e incubou se Durante 10 min a 30 ° C. As amostras de ensaio foram diluídas em 1 ml De solução de diluição (0,15 mmol / l de EDTA contendo 100 mmol / l de guanosina) e aplicado a QAE-Sephadex Colunas (8 x 33 mm) pré-equilibradas em 20 mmol / l Amónio (pH 7,4). Os eluatos foram Recolhidos ea quantidade de [3 H] guanosina foi Determinados kits comercialmente disponíveis (Ásia Instituto de Imunotecnologia, Hospital Geral de ExércitoPopular de Libertação da China, Pequim, China).
Western blotting
Para a preparação de lisados ​​teciduais, artérias de ratos foram dissecadas e lavadas com icecold PBS e homogeneizado com tampão RIPA com150 mmol / l de NaCl como descrito (Yu et al., 2010). Célula os lisados ​​foram removidos a 20000 xg durante 10 min. Depois d
e ajuste da concentração protéica, os lisados ​​foram fervido em tampão de carga de amostra de SDS durante 5 min e separados por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (PAGE, 4-15%, BioRad). Os geles foram transferidos para Uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (Immobilon P, Millipore, Bedford, MA, EUA) e Coradas com o primeiro anticorpo indicado anti-rat PDE5 (Diluição 1: 1000, Cell Signalling Technology, Inc., Danvers, MA, EUA), e anti-β-actina humana (40 ng / ml, Santa Cruz Inc., Santa Cruz, CA, EUA). Anticorpo a ligação foi detectada com peroxidase de rábano (HRP) - Acoplado secundário seguido por Deteção de quimioluminescência (ECL Plus; Amersham Pharmacia, Uppsala, Suécia).
					
Analise estatistica
Os dados quantitativos são apresentados como dados individuais ou como média + desvio padrão. As análises estastiticas foram feitas com o SPSS, versão 15.0 (SPSS Science, Chicago, IL, EUA). Significados estatísticos de Diferenças globais entre grupos múltiplos foram. Analisados ​​por ANOVA de sentido único. Diferenças Entre dois grupos independentes foram analisados Teste t de aluno. P valores inferiores a 0,05 foram considerados significativo.
RESULTADOS
Exercício de treinamento invertido elevação da pressão arterial em Ratos espontaneamente hipertensos os pesos corporais dos ratos jovens (4 semanas de idade) não foram significativamente diferentes (P> 0,05; Teste t não pareado) entre as duas estirpes (SHR 80,1 ± 10,3 g; WKY 75,6 ± 9,2 g; Média ± DP, n = 10). No adulto (16 semanas de idade), os pesos médios foram novamente Significativamente diferente (P> 0,05) entre as duas estirpes (SHR 324,6 ± 42,7 g, WKY 358,7 ± 45,2 g, n = 10).
Conforme mostrado na Figura 2A, a média da artéria carótida As pressões de animais de 4 semanas de idade não foram diferentes entre os ratos WKY e SHR. No entanto, em
animais adultos (16 semanas de idade), o SHR demonstrou pressões arteriais carótidas médias significativamente maiores comparar com ratos WKY de idade uniforme (P <0,01). Como mostrado Na Figura 2B, o treinamento físico reduziu significativamente o Elevação das pressões arteriais carótidas em SHR (P & lt; 0,05).
A sensibilidade de vasos resistentes à PNA diminuiu em SHR
Embora tenha sido extensivamente fatores envolvidos no início e desenvolvimento de Hipertensão nos SHRs permanece por resolver (Komolova et al. Al. 2012). Apenas como relatado previamente, a pressão de sangue Ainda não estava elevado em SHR de 4 semanas de idade (Komolova et al. 2012, Török et al. 2006, Corbett et al. 2007). A fim de Saber se as alterações da resposta vascular à ANP são "Iniciador" ou "resultado" da hipertensão, Propriedades vasorelaxantes induzidas pela ANP tanto em (Antes da hipertensão) e adultos (hipertensão) SHR. Em juvenis (4 semanas de idade) WKY ou espontaneamente Hipertensos, a ANP induziu uma dose dependente Relaxamento das artérias mesentéricas precontracting por 10-6 Mol / l NE. Artérias mesentéricas de SHR de 4 semanas de idade demonstraram resposta atenuada à ANP na dose de 10-8 mol / l ou 10-9 mol / l em comparação com a idade correspondente WKY (Figura 3A). Diferentemente, o relaxamento das Artérias de SHR de 16 semanas de idade foi atenuada ANP na dose de 10-9 mol / l para 10-6 mol / l (Fig. 3B). Consequentemente, a razão plasmática cGMP / plasma ANP foi marcadamente reduzido em SHR juvenil (4 semanas de idade) (Fig. 3C) e mesmo diminuiu no adulto (16 semanas de idade) Grupo (Fig. 3D), sugerindo que a geração de cGMP Apesar da alta estimulação da ANP. O fato de a ANP a resistência ocorreu antes da formação de hipertensão predisposição para hipertensão.
O aumento da atividade da PDE5 foi culpado pela ANP Resistência em SHR
NPRA-cGMP (receptor peptídico natriurético
A-guanosina monofosfato cíclico) é o sinal clássico que envolveu os efeitos vasorelaxantes de ANP, e cGMP atua como o segundo mensageiro. ANP liga-se ao NPR-A acoplado a guanilato em partículas Ciclase, estimulando sua ação biológica aumentando CGMP ea cGMP é degradada por Fosfodiesterasestais como PDE5 (Kuhn 2003). Para o Revelar o mecanismo subjacente da ANP Resistência à hipertensão arterial, testámos a expressão Bem como a atividade da PDE5 nas artérias mesentéricas. Conforme ilustrado na Figura 3E, a expressão de PDE5 Foi significativamente aumentada em SHR jovens (4 semanas de idade) comparado com WKY como controle, e foi mesmo amentou no SHR adulto (16 semanas de idade). Em conformidade, A atividade da PDE5 também foi significativamente tanto jovens como adultos SHR (Fig. 3F). Importante, Sildenafil, um inibidor da PDE5, eficientemente suprimido a atividade de PDE5 (Figura 4A), e atenuou a ANP Resistência em SHR (Fig. 4B).
A resistência da ANP foi atenuada pelo exercício físico 
Estudos experimentais e observações clínicas Mostraram claramente que a atividade física diminui o Pressão tanto em indivíduos normais quanto hipertensos Melhora da sensibilidade à insulina, facilitando a vasorelaxação à insulina (Li et al., 2009). Nós assim Especulam que o exercício também pode afetar a ANP sensibilidade da artéria de resistência. Apenas como suposto, o exercício significativamente potencializou os efeitos vasodilatadores da ANP, vasorelaxamento arterial para ANP em SHR (Fig. 4C), mas não Em ratos WKY como controlo (Fig. 4D). Importante, o exercício Suprimiu a actividade aumentada de PDE5 em SHR (Fig. 4E), e aumentou a razão de cGMP / ANP (Fig. 4F). Esta descoberta sugeriu um novo mecanismo envolvido efeitos anti-hipertensivos do exercício: melhorar a sensibilidade vascular à ANP.
DISCUSSÃO
No presente estudo constatamos que a ANP resistência induzida pela disfunção da NPR-cGMP Hipertensão. Esta conclusão baseia-se na Seguintes achados: (1) relaxamento induzido pela ANP Artéria mesentérica foi significativamente atenuada em 4 semanas SHR, e o relaxamento foi mesmo deteriorado em SHR de 16 semanas de idade (Fig. 3A, B). (2) A proporção de plasma CGMP / ANP foi significativamente diminuída em SHR (Fig. 3C, D). (3) A expressão bem como a actividade da PDE5, uma importante regulador da via NPR-cGMP, foi aumentada significativamente em SHR (Fig. 3E, F). (4) Exercício (Fig. 4C) ou sildenafil (Fig. 4B), um inibidor de PDE5, foi capaz de reverter a resistência de ANP em SHR por suprimindo PDE5. Embora a elevação da ANP, bem Produção exagerada de cGMP em SHR nunca foi relatado precocemente (Tremblay et al., 1993, Martel et al., 2010), resistência ao peptídeo natriurético foi inicialmente levantada Conceito por Forfia et al. (2007) em seu relatório sobre o cérebro resistência ao péptido natriurético na insuficiência cardíaca. No atual estudo, encontramos resistência a ANP na hipertensão. Importante, a resistência de ANP das artérias mesenteric Ocorre na fase inicial da hipertensão (4 semanas de idade SHR). Sugere-se que a sensibilidade reduzida da resistência vasos sangüíneos à ANP pode ser culpado predisposição à hipertensão. Permitindo o Vasorelaxing, diurético e natriurético da ANP (De Vito 2014), a diminuição da sensibilidade da ANP 16-year-old SHR levanta a possibilidade de que a ANP resistência desempenha um papel importante no desenvolvimento hipertensão. É bem conhecido que a resistência à insulina Efeitos abrangentes na síndrome metabólica 
Doenças cardiovasculares e envolveu danos de tipos de Órgãos como o coração (Zhang 2014), vasos sanguíneos (Paneni Et ai. 2013, Cubbon et al. 2013). Da mesma forma, a ANP Resistência não pode ser limitada dentro do mesentérico Artérias, mas ocorre no envolvimento sistemático do coração, Artéria, fígado renal ou cérebro. Isto é digno de mais investigação. O sinal NPRA-cGMP é um caminho clássico Induzidapela ANP. Conforme ilustrado na Figura 3 e na Figura 4, PDE5 desempenha um papel vital na resistência ANP. PDE5, Um subtipo de fosfodiesterase que decompõe cGMP, atua um "interruptor" de sinal NPRA-cGMP. Anormalmente melhorado PDE5 induz o estado "desligado" do sinal NPRA-cGMP resultando em resistência a ANP. No presente estudo, encontramos que o sildenafil, um potente inibidor selectivo da PDE5 inverte a resistência do ANP na hipertensão (Fig. 4B). 
O resultado produz evidências para o papel funcional da PDE5 na resistência de ANP. Klaiber et al. (2011) anteriormente relataram uma via de sinalização independente de cGMP. Se a resistência do ANP também está relacionada com o GMPc Independente é desconhecida e precisa
Investigações.
O exercício físico desencadeia ações saudáveis em doenças crônicas do metabolismo (Lancaster e Febbraio 2014). Li et ai. (2009) relataram que a resistência à insulina associada ao envelhecimento foi revertida pelo exercício em ratos. Nós Demonstrar, no presente estudo, que o exercício Alivia a resistência de ANP das artérias mesentéricas em SHR. Esta descoberta dá indícios de um novo mecanismo de Efeitos associados ao exercício contra a hipertensão. Importante, descobrimos que os efeitos do exercício foram Associada à supressão da PDE5, que atua como Uma mudança de NPRA-cGMP caminho. Tomados em conjunto, as evidências do estudo atual Suporta um papel fundamental da PDE5 na modulação da Sensibilidade a ANP por desativação de cGMP. Anormalmente A PDE5 aumentada é culpada pela dessensibilização de NPR-cGMP-PKG, resultando em ANP Resistência, que pode ser revertida por exercício ou sildenafil (Fig. 5).