Preparação e Transformação de E. coli

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UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ 
CURSO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA 
 
 
 
 
 
ANA PAULA MIOLA PERIN 
 
 
 
 
 
 
 Aula Prática 05: Preparação e Transformação de E. coli 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dois Vizinhos 
2017 
1. INTRODUÇÃO 
 
Muitos métodos criados para transformações bacterianas tiveram como base os 
estudos de Mendel e Higa, que mostraram que bactérias tratadas com soluções geladas de 
cloreto de cálcio e logo após aquecidas, podiam ser transfretadas com DNA bacteriófago. 
 A espécie bacteriana Escherichia coli é uma bactéria bacilar Gram-negativa e 
pertence à família das Enterobacteriaceae. São aeróbias e anaeróbias facultativas. O seu 
habitat natural é o lúmen intestinal dos seres humanos e de outros animais de sangue 
quente. A transferência de DNA plasmidial para vetores como a bactéria E. coli é um dos 
fundamentos da biologia molecular moderna. Na transformação química (ou clássica) as 
células são tornadas competentes por incubação numa solução fria de cloreto de cálcio, a 
que se segue um choque térmico de curta duração. 
Na transformação química as células (principalmente de E. coli) são tornadas 
competentes, por incubação numa solução fria de cloreto de cálcio, a que se segue um 
choque térmico de curta duração. Se necessário, é possível aumentar a eficiência do 
processo por recurso a outros íons monovalentes (K+ ou Rb+) ou divalentes (Mg2+ ou 
Mn 2+). 
Plasmídeos são pequenos fragmentos de DNA circular que se replicam 
independentemente do cromossomo da célula hospedeira. Plasmídeos que se 
desenvolvem em bactérias tem sequencias que se ligam a DNA polimerase bacteriana. 
O plasmídeo artificial a puc18 foi geneticamente manipulado para incluir um gene 
de resistência a antibiótico para ampicilina e um gene promotor a enzima beta-
galactosidade (lacZ). O gene LacZ contém uma região de sitio múltiplo de clonagem, com 
uma série de restrições únicas. A digestão com qualquer uma destas enucleases fará um 
único corte linear ao DNA do plasmídeo, permitindo que o mesmo se recombine com o 
DNA estranho. 
A presente prática laboratorial, teve o intuito de fornecer de uma forma didática, 
conceitos e manuseios básicos em preparação e transformação bacteriana, pois essa 
técnica é muito utilizada no ramo de engenharia genética, a qual representa a disciplina. 
 
2. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
2.1. Preparação do meio de Cultura (LB) 
Foi preparado um volume de meio para 100 ml. Foi pesado 1g de triptona, 0,5g 
de extrato de levedura, 1,0g de NaCl e adicionado 100 ml de agua destilada. O meio foi 
auto clavado. Para o meio sólido foi adicionado a mistura 1,5 g de ágar antes da autoclave. 
As células da bactéria E. coli foram postas para cultivo no meio preparado. 
Ficaram em estufa de 37 ⁰C a uma agitação de 120 rpm, por 3 horas em erlenmeyer, para 
após esse procedimento serem preparadas para transformação 
 
2.2. Preparação da E.coli (competência) 
 
Foram adicionados 2 ml das bactérias crescidas e transferidas para microtubos de 
2 ml e em seguidas centrifugadas por 10 minutos a 13.000 rpm. Após centrifugar, foi 
retirado o sobrenadante e o sedimento submetido a 700μl de uma solução A (10 mM 
CaCl2, 10 mM de Tris pH = 7,5) a 4 ⁰C, desagregando o pellet e centrifugado novamente 
por mais 10 minutos em mesma rotação de 13.000 rpm. Em seguida, foi realizado o 
mesmo procedimento de retirada do sobrenadante, porém fora adicionado 500μL da 
solução B (30 mM CaCl2, 10 mM de Tris pH = 7,5) a uma temperatura de 4 ⁰C e mantido 
em gelo por 10 minutos. A solução foi retirada do gelo e centrifugada por mais 10 minutos 
e depois descartado o sobrenadante. O sedimento foi ressupendido por 400μL da solução 
B. 
 
2.3. Transformação da E. coli 
 
A células competentes foram transferidas 200 μl para um tubo de eppendorfs 
estéril e adicionado 5μl do plasmídeos puc18. O material foi incubado no gelo por 10 
minutos e feito um choque térmico incubando as células em banho-maria a 42ºC por 2min 
e em seguida foi transferido novamente para o gelo por 30 segundos. Após o choque 
térmico realizado no eppendorfs, foram adicionados 1 ml do meio LB e agitado por 30 
minutos em temperatura de 37ºC. Posteriormente a agitação, o eppendorfs foi 
centrifugado por 5 minutos e o líquido foi descartado e o sobrenadante ressuspendido por 
uma pequena quantidade de meio restante no tubo. Em placas de petri diferentes foram 
semeados no meios sólidos, com e sem ampicilina (LA- 100μg/ml) como representado na 
figura 1. E mantidos em estufa 37°C por até 24 horas. 
 
Figura 1. Placas de preti com e sem ampicilina 
 
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES 
 
As placas foram analisadas depois que passaram por uma etapa de incubação de 
24 horas. Após esse procedimento foi possível visualizar o crescimento bacteriano e feita 
a comparação dos meios. 
No meio contendo bactéria transformada e ampicilina, foi possível notar o 
crescimento de colônias. No meio com bactérias normais e ampicilina também ocorreu o 
crescimento de colônias. Nos dois meio sem ampicilina e bactéria ocorreu crescimento. 
No meio com bactérias normais e ampicilina não deveria ter ocorrido o crescimento de 
células, isso implica contradição na técnica. Há três hipóteses que podem ter alterado os 
resultados. Primeira, as bactérias utilizadas já tinham um gene de resistência a ampicilina. 
Segunda, o antibiótico utilizado poderia estar fora da sua validade, o que inviabilizou o 
recurso inibidor ou foi usado em baixas concentração que não foram suficientes para 
impedir o crescimento bacteriano. E por fim, a terceira hipótese é que houve 
contaminação por outras células, pois não teve um branco para controle. 
Os resultados então não foram conclusivos pois cada hipótese resulta em um erro. 
Assim não é possível saber se a transformação realmente aconteceu. 
 
4. QUESTÕES 
 
a) O que significa dizer que as bactérias estão competentes? 
Uma bactéria competente é uma bactéria que está apta a receber DNAexógeno. A 
competência pode ocorrer naturalmente ou pode ser produzida através de diferentes 
técnicas. 
 
 
b) Qual a função do Cloreto de Cálcio durante o processo de competência? E por 
que usamos soluções de CaCl2 em duas concentrações diferentes? 
Estas técnicas envolvem tratamento com soluções, com o cloreto de cálcio, e 
mudanças bruscas de temperatura. Os íons de metal e as mudanças bruscas de temperatura 
alteram a permeabilidade da parede celular, fazendo com que estas células permitam a 
entrada de DNA exógeno através da membrana plasmática. cloreto de cálcio sob banho 
de gelo, faz com que a fluidez da membrana celular seja cristalizada, estabilizando a 
distribuição dos fosfatos carregados. Os íons Ca+2 se ligam a estes grupamentos, cobrindo 
as cargas negativas e assim facilitando a atração entre as moléculas do DNA no local 
específico da ligação. O choque térmico complementa este processo, provavelmente 
criando uma diferença de temperatura entre o interior e o exterior da célula bacteriana, o 
que promove a abertura dos poros da membrana bacteriana, auxiliando na entrada 
do DNA através desses canais. 
 
 c) Por que as bactérias foram deixadas por 3 horas crescendo a 37°C antes do início 
da aula prática? Qual a importância desta etapa? 
Para garantir que apenas o microorganismo desejado esteja no meu material, são 
utilizadas as técnicas assépticas: procedimentos que devem ser adotados visando a não 
contaminação de materiais, meios e culturas. 
 
d) Se eu não tivesse cálcio em meu laboratório, poderia usar outro reagente para o 
mesmo processo? 
 Sim desde que o outro reagente liberasseíons quando colocados em meio aquoso. 
 
e) O resultado obtido foi o esperado? Explique: 
 Os resultados não foram como desejados, pois as bactérias que não estavam 
transformadas cresceram em meio contendo o antibiótico. 
 
 
 
 
 
 
5. REFERÊNCIAS 
 
ZAHA, A.et al. Biologia Molecular Básica. 3a. ed. Porto Alegre, Editora Mercado 
Aberto, 2003. 
 
ALBERTS, B.et al. Biologia Molecular da Célula. 5ª. Ed: Editora Artmed. 2010. 
 
GRIFFITHS, A.et al. Introdução a genética. 10 ª. Ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 
2013. 710p.