6. Eletroforese PCR Sequenciamento

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Metodologias Laboratoriais Utilizadas 
na Análise Genética I 
Prof. Dr. Fernando Pacheco Rodrigues 
Departamento de Genética e Morfologia – IB/UnB 
Eletroforese 
PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) 
Sequenciamento de DNA 
ELETROFORESE 
Separação de moléculas em meio sólido 
Carga 
Peso molecular 
Agarose 
Amido 
Poliacrilamida 
ELETROFORESE ELETROFORESE 
1 - Gel; 2 - Aplicação do marcador de peso molecular; 3 - Aplicação das amostras; 4 - Indução 
de corrente elétrica; 5 - Deslocamento e separação dos fragmentos; 6-Eletroforese realizada. 
ELETROFORESE ELETROFORESE 
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Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 
● Desenvolvido por Kary Mullis em 1985 
 
 - Recebeu prêmio Nobel em Química em 1993 
→ Permite a obtenção in vitro de milhares de cópias de uma seqüência 
 específica do DNA 
DNA 
 
dGTP 
dATP 
dCTP 
dTTP 
 
primers 
 
MgCl2 
 
Taq DNA polimerase 
 
Reagentes para PCR: 
Máquina de PCR 
(Termociclador) 
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 
Etapas da PCR 
1ª Etapa: Desnaturação 
2ª Etapa: Anelamento dos primers 
3ª Etapa: Extensão 
↑ T (94º C) 
↓ T (50 - 60º C) 
↑ T (72º C) 
↑ T (94º C) 
↓ T (50 - 60º C) 
↑ T (72º C) 
Repetição do ciclo 
Ciclos Cópias 
1 2 
2 4 
4 16 
10 1.024 
15 32.768 
20 1.048.576 
25 33.554.432 
30 1.073.741.824 
Visualização do produto da PCR 
PCR - vantagens 
 
Capacidade de amplificar especificamente uma seqüência pequena 
em uma genoma enorme 
 
Precisa de um quantidade muita pequena de DNA 
 
Alta especificidade 
 
 
 
PCR - desvantagens 
 
Necessário conhecimento prévio da seqüência 
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Utilização da PCR para a sexagem de aves 
Z Z Z W 
Z CHD -Z 
P2 P8 
Utilização da PCR para a sexagem de aves 
W
CHD - W 
P2 P8 •  O s e g m e n t o d o g e n e C H D - W 
amplificado por PCR possui 362 bp, e 
nele existe um intron que possui 179 bp. 
•  O segmento do gene CHD-Z amplificado 
por PCR possui 345 bp, devido ao fato 
do intron apresentar uma deleção de 17 
bp (tamanho do intron = 162 bp) 
Z Z Z W 
PCR 
Utilização da PCR para a sexagem de aves 
Z CHD - Z P2 P8 
W
CHD - W P2 P8 
Z CHD - Z P2 P8 
Z CHD - Z P2 P8 
Utilização da PCR para a sexagem de mamíferos 
Clyomys bishopi 
Sexagem de embriões 
Esclarecimento da Estrutura do DNA 
(1953) 
Sequenciamento do genoma completo 
da bactéria Haemophilus influenzae 
(1995) 
42 anos 
Sequenciamento do DNA 
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Sequenciamento do DNA 
● Metodologia atual é baseada no Método de Sanger 
 
 - Desenvolvido por Frederick Sanger 
 - 1975 – Sequência do bacteriófago ΦX-174, com 5.386 bp 
 - Conhecido como método de terminação da síntese do DNA 
Sequenciamento do DNA 
● Método de Sanger 
Sequenciamento do DNA 
● Sequenciamento Automático do DNA 
Desenvolvimento das Metodologias de 
Sequenciamento do DNA 
Novos Equipamentos e Novas Tecnologias! 
Pirosequenciamento 
Fonte: Mardis (2008) 
Sequenciamento de Nova Geração (NGS) 
Pirosequenciamento 
GS FLX/454 
(Roche Diagnostics) 
 
 
Até 250 bases/leitura 
Até 400.000 leituras/corrida 
Até 100 Mb/corrida/7,5 horas 
Sequenciamento de Nova Geração (NGS) 
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SOLiD 
(Sequencing by Oligo Ligation and Detection) 
AB SOLiD Sequencer 
(Applied Biosystems) 
 
 
Até 25-30 bases/leitura 
Até 3-4 Gb/corrida/~5 dias 
Sequenciamento de Nova Geração (NGS) 
Ion Torrent 
Sequenciamento de Nova Geração (NGS) 
Ion Torrent 
Sequenciamento de Nova Geração (NGS) Desenvolvimento das Metodologias de 
Sequenciamento do DNA 
● Sequenciamento Automático do DNA 
 
- Redução no tempo para produção de sequências 
 
 Sequenciador automático de 96 capilares → 100.000 nucleotídeos/dia 
 
-  Redução do custo 
Ano Custo/base (US$) 
1985 10 
1993 0,10 – 0,15 
2006 ~ 0,001 
-  Redução tempo e custo 
→ tornou possível a realização de todos os projetos genomas concluídos até hoje 
GENOMAS COMPLETOS 
04/2013 08/2014 12/2015 
Archaea 186 926 1.136 
Bactérias 3.956 37.180 49.559 
Eucariotos 183 8.660 11.122 
4.325 46.766 61.817 
Fonte: Genomes Online Database (www.genomesonline.org) 
Organismos eucariotos já sequenciados 
● Organismos modelos em genética: 
 Arabidopsis thaliana 
 Drosophila melanogaster 
 
 ● Organismos causadores de doenças: 
 Plasmodium falciparum 
 Leishmania braziliensis 
 
● Organismos vetores de doenças: 
 Anopheles gambiae 
 
 ● Animais domésticos: 
 Bos taurus 
 Canis familiaris 
 
● Primatas: 
 Pan troglodytes 
 Homo sapiens 
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Sequenciamento de Genomas no Brasil 
● 2000 – Primeiro genoma obtido no Brasil – Xylella fastidiosa 
 
 
 
● Posteriormente genoma de outros organismos 
 
 Xantomonas axonopodis 
 Xanthomonas campestris 
 Leifsonia xyli 
 Leptospira interrogans 
 Chromobacterium violaceum 
 Mycoplasma hyopneumoniae 
 Mycoplasma synoviae 
 
 Outros... 
 
 
Perspectivas 
● O quê se adquire quando um genoma é sequenciado? 
 
-  Retrato do genoma do organismo 
 Tamanho, composição de bases, sequência, descrição dos elementos 
 conhecidos e desconhecidos, mapa genético. 
 
 
-  Genômica Comparativa 
 Evolução dos Genomas 
 Estudo das relações evolutivas entre os organismos 
 
 
-  Abertura de novos campos de pesquisa 
 Genômica Funcional