Estudo da Composição Química Celular

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Citoquímica 
Tatsuya Nagata 
Citoquímica 
• Citoquímica é o estudo da 
composição química celular e dos 
processos biológicos no interior 
das células. 
 
 
E amostra? 
Célula epitelial bucal 
Bonita ??? 
Vamos pintar........ 
Vamos observar.... 
Alvo- organela celular 
 
• Núcleo 
• Retículo Endoplasmático 
• Aparelho de Golgi 
• Citoesqueleto 
 
Quimicamente..... 
 
• Ácidos nucléicos 
• Proteína 
• Polissacarídeo 
• Lipídeo 
 
Visualização 
Corante 
1. Corante 
 Como ligar corante em alvo???? 
•Ligação iônica 
•Ligação covalente 
•Interação hidrofobicidade 
Alvo 
Corante/Fluorocromo 
Lâmina 
 
(A) Ligação iônica 
 
• Coloração mediada ligação eletrostática 
 ligação iônica 
 
• Corante aniônico 
 Corante - negativo (aniônico) 
 Substrato (alvo) - positivo (catiônico) 
 
• Corante catiônico - vice versa 
 
 
 
Corante aniônico (-) 
Cartilagem 
 
Grupo Ponceau - Proteína 
Corante aniônico (-) 
Fast Green - Proteínas 
 
Testículo de rato 
(B) Corante catiônico 
 
– Azul de Toluidina (parede celular) 
– Hematoxilina (núcleo) 
 
 
 
Azul de Toluidina 
•Que tipo de substância 
 é o alvo? 
Hematoxilina 
Qual é o alvo?? 
(C) Interação hidrofobicidade 
 
Afinidades entre 
corante hidrofóbico – alvo hidrofóbico 
Sudan -Lipideos 
Fígado de porco 
(D) Outro tipo de ligação 
• Coloração Específicas (Ligação covalente) 
– Reação de Feulgen (DNA) 
– PAS Lectinas (açucares) 
 
 
Reação de Feulgen – DNA 
PAS – açucares (polissacarídeo) 
fígado de porco 
2. Citoquímica Enzimática 
• Detecção de enzimas “in situ” 
 - Incubação de substrato 
 - Ajustar pH e temperatura para atividade 
de Enzima 
Digestão Enzimática específica 
 
Substrato colorido 
Lâmina 
Substrato incolor 
Alvo (Enzima) 
Visível 
Fosfatase Ácida e Alcalina 
Tubo de Malpighi 
Rico em fosfatase ácida 
Glândula salivar 
Rico em fosfatase alcalina 
Qual é o substrato 
E pH? 
3. Imunocitoquímica 
• Detecção de antígenos “in situ” através de 
anticorpos específicos marcados com Indicadores: 
 
 - Enzimas (microscópio de Luz) 
 - Fluorocromos (ms de fluorescência, 
 Confocal a Laser) 
 - Elementos Eletrondensos (MET) 
 
Ligações entre 
Alvo-Anticorpo-Indicador 
Alvo 
Lâmina 
Enzima/Fluorocromo 
Indicador 
 
Para MET 
Indicador: colóide de ouro 
Para microscópios de luz ou de Fluorescência 
Depende do marcador (Indicador ou Tag) 
Tripes 
Frankliniella occidentalis 
Imunomarcação de 
Vírus (TSWV) 
em intestino de tripes 
Usando microscópio 
de comum 
 
2º anticorpo marcado com 
a enzima peroxidade e incubação 
com substrato DAB 
Imunomarcação de 
Vírus (TSWV) 
em intestino de tripes 
Usando microscópio 
de Fluorescência 
 
2º anticorpo marcado 
Com Fluoroceina (verde) 
Imunomarcação de 
Vírus (TSWV) 
em intestino de tripes 
Usando MEV 
 
Segundo anticorpo 
marcado com ouro 
4. Hibridização “in situ” 
• Detecção “in situ” de 
sequências de DNA ou RNA 
através de sondas 
moleculares marcadas 
Hibridização 
Marcação de Viroide (patógeno de RNA) 
em Cloroplasto (MET) 
FISH 
Detecção de genes 
em cromossomos mitóticos