Microbiologia AULA Bacilos Gram positivos

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Universidade de Brasília
Departamento de Biologia Celular
Disciplina: Microbiologia Básica
Prof.: Andréa Queiroz Maranhão
 Bacilos Gram Positivos
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 Podem estar dispostos em cadeias.
 Produzem endosporos, resistentes ao calor e muitos agentes químicos, sendo destruídos quando autoclavados a 120ºC por 15 minutos.
 A maioria das espécies é saprófita no solo, água ou vegetação.
 Podem ainda ser encontrados no trato intestinal de alguns animais, inclusive o homem.
 Poucas espécies são patogênicas ao ser humano.
 Dividem-se em dois gêneros: Bacillus e Clostridium.
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 Bacillus
Bacillus anthracis
Imóvel
 Anaeróbio facultativo
 Quimiorganotrófico 
 Catalase-positivo
 O endosporo é oval e é produzido apenas quando a célula vegetativa é cultivada fora do tecido hospedeiro animal, em aerobiose, com temperatura variando de 15 a 40ºC.
 Colônias em ágar apresentam bordas onduladas → “Cabeça de medusa”.
 Quando cultivados na presença de alto teor de CO2, observa-se a formação da cápsula mucóide polipeptídica (ácido poliglutâmico). 
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 No cultivo formam grandes cadeias com extremidades em ângulo reto, enquanto no tecido hospedeiro são encontrados como células únicas ou grupos de 2.
 Normalmente sensível a penicilina.
 Sensível à ação do fago .
 Cresce em aerobiose na maioria dos meios laboratoriais, em temperaturas de 12 a 44ºC, com crescimento ótimo a 37ºC.
 O esporo sobrevive ao aquecimento pelo calor seco a uma temperatura de 160ºC por 60 minutos. A autoclavação é efetiva após 10 minutos a 120ºC. Iodo e cloro podem ser utilizados na desinfeccção.
Lise do Bacillus anthracis pela ação do fago . A área clara corresponde à região onde o fago  foi aplicado.
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Bacillus anthracis. Coloração de Gram. 1500X
Colônias mucóides de Bacillus anthracis. 
Bacillus anthracis em ágar de sangue. Notar a ausência de hemólise.
Eletromicrografia colorida de Bacillus anthracis. 
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Fatores de Virulência
 Cápsula: Formada por ácido poliglutâmico. Inibe a fagocitose. As bactérias não produtoras de cápsula são relativamente não virulentas. A cápsula desempenha seu papel mais importante durante o estabelecimento da doença, tornando-se menos significante nas fases terminais, mediadas pela toxina. A produção da cápsula depende de um plasmídeo pX02.
Bacillus anthracis. 1000X. Anticorpo específico associado a substância fluorescente em reação com o material capsular.
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 Exotoxina: Sua produção é por um plasmídeo sensível à temperatura, pX01. A toxina consiste em 3 componentes antigênicos termolábeis distintos: Fator Edematoso (EF), Protetor de Antígeno (PA) e Fator Letal (LF).
Fator I ou Fator Edematoso: consiste em uma forma inativa de adenilato ciclase (dependente de calmodulina) que, quando ativada, transforma ATP em cAMP, alterando a permeabilidade da célula, provocando extravasamento de fluido e eletrólitos → Edema na pele, brônquios, gânglios linfáticos, estômago ou intestino. Faz parte de um mecanismo de feedback positivo do receptor ANTXR, aumentando a endocitose. Em macrófagos e neutrófilos, é responsável pela inibição da fagocitose, processo que requer ATP.
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Fator II ou Protetor de Antígeno: consiste em uma proteína que se liga a receptores humanos (TEM8 e CGM2) presentes no cérebro, coração, intestino, pulmão, músculo esquelético, pâncreas e macrófagos. Após se ligar ao receptor, o PA é clivado, liberando um fragmento de 63kDa que é retido na membrana celular, formando um complexo em forma de anel de 7 fragmentos. Este complexo pode então se ligar a até 3 moléculas de LF e/ou EF, o que estimula a endocitose do complexo – EF/LF e sua transferência para um compartimento ácido, onde induz a formação de um poro transmembranar, liberando as moléculas de EF e/ou LF no citoplasma. Este fator é essencial para a atividade dos outros dois. É responsável ainda pela indução da formação de anticorpos anti-tóxicos.
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 Fator III ou Fator Letal: metaloprotease dependente de Zn2+ que cliva a proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK), que coordena a sinalização intracelular. A morte celular ocorre independentemente da clivagem da MAPK. O LF promove a ativação das caspases 1 e 5. Promove a liberação de TNF e outras substâncias na corrente sanguínea, essenciais para o efeito letal da toxina. Além disso, é responsável pela inibição da quimiotaxia de células leucocitárias e da diferenciação de monócitos em macrófagos.
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Patogênese e Epidemiologia
 Doença primária de animais herbívoros, principalmente, como gado, ovelhas, cavalos, mulas e cabras.
 O homem adquire a doença ao entrar em contato com a carne, a pele, os ossos, os pêlos e os excrementos desses animais. Pode ser ainda transmitida através da picada de insetos que entraram em contato com animais contaminados (5% dos casos de contaminação cutânea).
 Não é transmitido de pessoa para pessoa.
 A doença pode ser adquirida através do contato dos esporos com a pele e ingestão ou inalação, expondo as mucosas digestiva e respiratória, ricas em aminoácidos, nucleosídeos e glicose, portanto, ambientes favoráveis à germinação do esporo.
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Formas de Contágio
 Inalação: Resulta da inalação de ar contendo esporos. Os esporos então germinam, transformando-se em células vegetativas, que liberam toxinas que levam à hemorragia interna, formação de edemas e morte tecidual. É a forma mais mortal de contágio. A gravidade da forma inalatória advém do fato de que os gânglios (o que gera um quadro de linfadenopatia) para onde as bactérias são levadas localizam-se no mediastino, onde se localizam a traquéia e os grandes vasos do coração. É a forma de contágio utilizada como arma biológica.
MORTALIDADE: 99% dos casos.
Sintomatologia: Geralmente aparece de 7 a 10 dias. Entretanto pode levar de 2 ou 3 dias ou até 60 dias para os sintomas se manifestarem. Uma vez que a germinação começa, a doença progride muito rapidamente.
 Estágio 1: Febre, tosse, dores de cabeça, calafrios, dor torácica. Pode durar de poucas horas a poucos dias.
 Estágio 2: Febre, dispnéia, transpiração, descoloração azulada da pele e morte. Pode durar de 2 a 4 dias.
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Primeiro estágio de desenvolvimento da doença adquirida por inalação. Fagócitos pulmonares presentes nos alvéolos (I.e. macrófagos alveolares e células dendríticas pulmonares) englobam eficientemente os esporos por fagocitose. Uma vez dentro do fagossomo, os esporos em germinação secretam suas toxinas, inibindo o recrutamento de células pró-inflamatórias oriundas dos vasos sanguíneos e desencadeando a migração das células dendríticas pulmonares para os nodos linfáticos. Nesse estágio, as toxinas tem ação parácrina apenas.
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Fase de proliferação. Os bacilli escapam eficientemente do fagossomo e proliferam-se nos nodos linfáticos do mediastino. A secreção de toxinas tem efeitos locais, enfraquecendo as funções das células dendríticas, células T e células B e paralisando o sistema imune.
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Fase terminal. Os bacilli proliferam-se na corrente sanguínea e em locais preferenciais, como o cérebro, onde causam meningite. O grande número de bactérias resulta na produção de grandes quantidades de toxinas, que se difundem por longas distâncias na corrente sanguínea e desencadeiam uma ampla gama de efeitos deletérios.
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 Contágio cutâneo: Forma mais comum de contágio em humanos (95% dos casos). Lesões em regiões como a face, pescoço e braços são inoculadas por esporos, que germinam produzindo um edema gelatinoso na área. O edema evolui até uma úlcera necrótica de onde a infecção pode se disseminar, levando à septicemia. Então, se desenvolve uma escara escura e indolor que seca e desaparece em uma ou duas semanas. Em casos severos, quando a corrente sanguínea é invadida, a doença é freqüentemente fatal. Em 95% dos casos, a inoculação dos esporos se dá através de uma ferida pré-existente. A inoculaçãopode ser mediada ainda por um inseto, que serviria de vetor de transmissão.
 MORTALIDADE: 20% dos casos não tratados.
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Sintomas: 
 Náusea 
 Vômitos contendo sangue 
 Dores abdominais 
 Diarréia com presença de sangue
 Fraqueza
 Perda de apetite 
 MORTALIDADE: 25 – 60% dos casos.
 Ingestão: Resulta da ingestão de alimentos contaminados mal cozidos ou água contendo esporos que não tenha sido tratada com cloro. Os esporos provavelmente invadem a mucosa através de uma lesão pré-existente. 
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Diagnóstico e Tratamento
 Retirada de amostra sanguínea, que é então cultivada de 6 a 24h, quando coram-se as células pelo método de Gram.
 Testes bioquímicos específicos para o Bacillus anthracis são realizados.
 O tratamento é feito com antibióticos, variando com o tipo de contágio:
 Cutâneo: Penicilina (regressão da escara e evita disseminação)
 Eritromicina 
 Tetraciclina
 Ciprofloxacina
 Mucosa respiratória: Penicilina e Estreptomicina
 Cloridrato de Ciprofloxacina
Bacillus anthracis em amostra sanguínea.
 Cipro: Antibiótico aparentemente eficaz contra o Bacillus anthracis que bloqueia a ação da topoisomerase II, enzima nuclear responsável pela condensação e descondensação do DNA bacteriano, inibindo, portanto, replicação, transcrição e tradução do material genético, levando a célula eventualmente à morte.
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Colônias de Bacillus anthracis (direita) e colônias de Bacillus cereus (esquerda). Notar que as colônias de Bacillus cereus são maiores, mais mucóides e apresentam halo de hemólise, ao contrário das colônias de Bacillus anthracis.
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Bacillus Cereus
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 gênero Bacillus
 Bastonetes Gram +, formando cadeias
Móveis ( peritríquios)
Aeróbio facultativo
Formador de esporos ( resistência a calor, desidratação...)
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Intoxicação Alimentar:
Comida associada:
Per. de incubação:
Sintomas:
Duração:
Enterotoxina:
Arroz
< 6 horas
Vômito, náusea e dores abdominais
8 – 10 horas
Termo estável
Carne e vegetais
> 6 horas
Diarréia, náusea e dores abdominais
20 – 36 horas
Termo lábel
Forma emética
Forma diarréica
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Diagnóstico:
A partir dos sintomas ( difícil) ;
Coleta intravenosa e posterior cultura;
 * o isolamento do microorganismo a partir das fezes não é recomendado, pois ele faz parte da microbiota intestinal
Detecção de + de 105 microorganismos B. cereus por grama de comida implicada.
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Tratamento:
Não requer tratamento antimicrobiano;
O tratamento é sintomático;
Se confirmado em testes em vitro, pode-se usar Clindomicina, Vancomicina e Aminoglicosidases.
B. cereus é portador de genes para resitência às penicilinas e cefalosporinas.
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Medidas preventivas:
 Educação para os manipuladores de alimentos e donas de casa, apos os alimentos cozidos não podem permanecer em temperatura ambiente.
 Evitar consumir alimentos requentados, em casos de necessidade, os alimentos devem ser devidamente reaquecidos em tempo e temperatura adequadas. 
 Consumir leites pasteurizados, o leite fresco deve ser sempre fervido antes de ingerido. 
 Armazenar e/ou refrigerar cuidadosamente os alimentos crus ou cozidos. 
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Infecção Ocular:
O B. Cereus é um patógeno primário nas infecções oculares
A infecção se deve a corpos estranhos endooculares
Por lesão com objetos metálicos
Por contaminação com terra
Relação com ambiente rural ou de granja
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Manifestações Clínicas:
Destruição maciça do tecido vítreo e retina;
Comprometimento da visão no período de incubação (14-48 horas);
Formação de abscesso em anel;
Pode desenvolver edema periorbital e tumefação córnea
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Três toxinas estão envolvidas:
Toxina necrótica
Cereolisina
Hemolisina potente
Aumenta a permeabilidade vascular
Fosfolipase C
Papel secundário nas infecções oculares
Interrompe a membrana fosfolipídica
* Ação das outras toxinas
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Tratamento:
 Devido às graves conseqüências, é indicado um enfoque agressivo com vitrectomia. Se utilizam antibióticos sistêmicos, intravítreos, tópicos e perioculares em associação com o procedimento cirúrgico.
 Se deve obter amostras adequadas de líquido ocular para assegurara evolução diagnóstica correta.
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Clostridium
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Princípios gerais
Anaeróbios
Algumas espécies têm importância como causas de doenças
Clostrídios patogênicos: formação de toxinas.
Estão presentes em todo o mundo
A desproporção existente entre a ampla presença dos Clostrídios e as poucas infecções que provocam é explicada pela pouca capacidade de invasão que exibem esses agentes.
Clostridium
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Clostridium botulinum
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Fisiologia e estrutrura
Bacilo Gram positivo flagelado.
Produtor de esporos muito resistentes.
Encontrado em solo, água, alimentos, fezes, enlatados.
Desenvolve-se em meios com baixa concentração de oxigênio (anaeróbios) e com pH neutro ou próximo de 7,0.
Clostridium botulinum
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Sete tipos de C. botulinum, classificados de acordo com o tipo de toxina botulínica produzida. 
Os tipos A, B, E e F são os responsáveis pela maioria dos casos de botulismo em humanos.
A toxina é composta por uma subunidade leve (neurotóxica) e uma ou mais subunidades pesadas.
Clostridium botulinum
Fisiologia e estrutrura 2
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-Bloqueio de neurotransmissão periférica: evita liberação de vesículas de acetilcolina.
-Regeneração neuronal após um tempo
Clostridium botulinum
Patogênese
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Doença rara resultante da intoxicação por toxina botulínica.
Paralisia simétrica descendente dos nervos motores e autônomos.
Três tipos: alimentar, infantil e por ferimentos.
Clostridium botulinum
Botulismo
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Sintomas:
alterações da visão (visão turva, dupla, fotofobia)
flacidez de pálpebras 
secura na boca e garganta 
distúrbios da deglutição 
modificações da voz (rouquidão, voz cochichada, afonia, ou fonação lenta)
flacidez muscular generalizada 
dificuldade de movimentos 
dificuldades respiratórias, cardiovasculares
Botulismo
Clostridium botulinum
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Contraído pela ingestão de alimentos contaminados pela toxina.
Alimentos não esterilizados: presença de esporos que germinam em condições favoráveis (ausência de oxigênio no microambiente, pH neutro)  produção de toxina
Obs.: Como a toxina é termolábil, é recomendado aquecer ou cozer o alimento para que ela seja inativada. 
Contaminações comuns: enlatados, embalados, vegetais, conservas caseiras.
Botulismo de origem alimentar
Clostridium botulinum
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Colonização do trato intestinal após ingestão de esporos de C. botulinum, uma vez que o trato intestinal de uma criança com menos de 1 ano não contém ainda uma flora microbiana normalizada (fator de proteção).
Botulismo infantil
Clostridium botulinum
Mel – fonte comum de esporos do C. botulinum
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		A causa deste tipo de botulismo envolve perfusão da pele, por várias formas: feridas provenientes de punções, fracturas expostas, lacerações, em abscessos devido a drogas de abuso e incisões cirúrgicas.
Botulismo por feridas
Clostridium botulinum
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Antitoxina imediata que atua contra a toxina circulante e não contra a que se fixou no sistema nervoso; portanto sua eficácia dependerá da precocidade do diagnóstico
Tratamento
Clostridium botulinum
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Manutenção das funções vitais (Se o doente apresenta défice respiratório deve ser usada uma máquina de respiração artificial até a paralisia terminar, o que pode demorar alguns dias.)
Tratamento
Clostridium botulinum
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Clostridium Perfringens 
Grande bacilo gram positivo
Imóveis esporulantes
Anaeróbio mas aerotolerantes 
Termo resistentes
Esporos resistentes
Metabolismo rápido 
Hemolítico*
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Clostridium apresentam sulfito redutores 
Produzem doze toxinas além de enzimas 
4 tóxinas subdividem a espécie em tipos de A-E
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Toxina α
Mais importante pois é produzida por todos 
É uma lectinase (fosfolipase c)que provoca lise nos eritrocítos ,plaquetas leucocitos e células endoteliais 
Aumenta permeabilidade vascular havendo hemolise e sangramento 
Hepatoxidade disfunção miocardica
Tipo A é o maior produtor 
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Toxina β produz lesões necróticas causando enterite necrozante é inibida por proteases pancreáticas
Toxina ε é uma pró-toxina que quando ativada aumenta permeabilidade vascular da parede gastroduodenal
Toxina iota aumenta a atividade necrotica e a permeabilidade vascular
 
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Enterotoxina 
É liberada durante a formação de esporos 
Interrompe o transporte de íons no íleo e jejuno 
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Gangrena gasosa 
Potencialmente fatal 
Dor intensa 
Sensação crepitante 
Em uma semana 
causa extensa necrose
 muscular ,choque ,
 insuficiência renal e
 morte dentro de 2 dias 
40-100% mortalidade 
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Intoxicação alimentar
8-24h de incubação 
Sintomas : cólicas abdominais ,diarréia aquosa na ausência de febre , náusea e vômitos
A enterotoxina produzida atua como superantigeno
Fração contaminante de 10 8 
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Enterite necrosante
Necrose aguda 
Rara 
Diarréia sanguinolenta ,choque e peritonite 
C.perfringens tipo C toxina β
50% de mortalidade 
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Clostridium tetani 
Pequeno bacilo gram positivo
Móvel devido a flagelos peritríquios 
Formam endosporos terminais redondos 
Metabolicamente inativos 
Sensibilidade extrema a oxigênio
Ubiquitários 
Apresentam 2 toxinas principais 
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Tetanospasmina
É sintetizada durante a fase estacionária de crescimento
Liberada por lise celular sendo responsável por sintomas
Codificada por plasmídeo e sintetizada como polipeptídio de cadeia simples que é clivada dando origem a cadeia pesada e leve 
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A cadeia pesada se gruda a receptores de membrana neuronal e atua bloqueando a liberação de neurotransmissores em sinapses inibitórias ,causando paralisia espástica 
A ligação é irreversível e portanto a recuperação depende da síntese de novas terminações axonais ou receptores
Não interfere em acetilcolina
A cadeia leve sofre transporte axonal retrógrado em compartimento semelhante a endossoma
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Tétano 
Para desenvolvimento os esporos tem de estar em local com baixo potencial redox
Tempo de incubação de tétano depende da distância da infecção primaria até o S.N.C.
Causada por um pequeno número de indivíduos 
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Sintomas 
Por eles se da diagnóstico
Apenas 30% dos infectados apresenta cultura positiva 
Elevação da temperatura de 2-4oC
Diaforese (suor excessivo)
P.A elevada . Taquicardia
Espasmos que duram 3-4 semanas
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Restrita ao local, rara 
Generalizada mais comum tem como primeiro sinal o comprometimento do masseter sendo o sinal de TRISMO 
Pode ser neonatal quando se dá no coto umbilical e depois se espalha 
Cefálica quando a cabeça é o local da infecção primária
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Tratamento
Desbridamento da ferida primária 
Metronidazol
Imunização passiva com imunoglobulina anti tetânica humana 
Vacinação com toxóide tetânico 
Relaxante muscular curare
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Corynebacterium
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Corynebacterium
 Bacilos gram-positivos; pequenos; pleomórficos; em pequenas cadeias (V ou Y) ou arranjos amontoados semelhantes a ideogramas chineses 
 Parede celular contendo lipídeos especiais – ácido mesodiaminopimélico; polímeros arabino-galactanos; ácidos micólicos
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Corynebacterium
Arranjo em forma de ideogramas...
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Corynebacterium
 Aeróbicos ou anaeróbicos facultativos;
 Metabolismo fermentativo;
 Catalase-positivos;
 Ubíquos; colonizam pele, trato respiratório superior, TGI e trato urogenital;
 Baixa taxa de crescimento 
 Não-móveis; 
 Não formam esporos!
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Corynebacterium
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Corynebacterium
Corynebacterium diphtheriae
 Difteróides (“não-patogênicas”)
 Patógenos oportunistas...
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Outros...
Corynebacterium jeikeium
Corynebacterium urealyticum
Corynebacterium ulcerans
Corynebacterium pseudotuberculosis
Corynebacterium xerosis
Corynebacterium pseudodiphtheriticum
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Corynebacterium
Fatores básicos de virulência:
Exotoxina diftérica
Fosfolipase D
Produção de urease
Resistência a antibiótico
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Difteria
↑↑ mortalidade infantil (antigamente)
1855 - Armand Trousseau
Do grego “Dipthera” (couro, cabudal)
1890 - Emil von Behring 
Prêmio Nobel da Medicina e Fisiologia
 Imunização precoce (atualmente) 
1929 – Ramón cria a vacina...
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Difteria
 Invasão, colonização e proliferação bacteriana 
- ↑ permeabilidade vascular e promove a disseminação do patógeno
- quebra da ligação péptica nos ribossomos; 
 Exotoxina 
 ↓↓ [Ferro] extracelular
Presença de um prófago lisogênico no cromossomo bacteriano. 
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Monômero da exotoxina de Difteria
A - domínio catalítico;
B - domínio ligante a o receptor (HB-EGF) da célula hospedeira;
T - domínio hidrofóbico responsável pela inserção na membrana do endossomo - liberação de A 
 
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Corynebacterium diptheriae 
Apenas humanos...
Transmissão:
 Inalação ou contato epidérmico
Transportado assintomaticamente
 Ocorrência em áreas urbanas pobres amontoados; em população com ↓ imunização 
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Corynebacterium diptheriae
Características clínicas
→ cutânea 
→ respiratório
Coloniza tonsilas, faringe...
Pseudomebrana de pus
Febre baixa, tosse, gânglios inchados... 
* Morte celular de órgãos de ↑ perfusão sanguínea...
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Difteria
Identificação laboratorial:
 - Microscopia 
 (grânulos metacromáticos) 
 - culturas
 - teste in vivo (Schick)
 - teste in vitro 
 (Elek, imunodifusão...)
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Difteria
 Tratamento, prevenção e controle:
Vacina DPT → imunização durante a infância
Antibiótico → penicilina ou eritromicina
Antitoxina
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Difteria
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Obrigada !!!!!!
Comentar sobre o histórico...
B se liga ao receptor nas células-alvo e a toxina é internalizada por endocitose mediada por receptor 
A porção A bloqueia a síntese protéica por ADP-ribosilação do fator EF - 2
Trasnmissão... Carregamos o patógeno assintomaticamente