Aula 8 Ontogênese e diferenciação do tecido linfoide

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LINFÓCITOS
Nós já estudamos os granulócitos e a série vermelha. Nessa parte do nosso curso, estudaremos os linfócitos, que são fundamentais para a resposta imunológica. Esse assunto será abordado muito mais no próximo semestre, na Imunologia.
Professora Flávia é especialista em citometria de fluxo.
Bom dia, professora Flávia
Linfócito: célula com alta relação núcleo/citoplasma, em que o núcleo do linfócito tem mais ou menos a área de uma hemácia.
Linfócitos B: produção de anticorpos.
Plasmócito: a célula efetora dos linfócitos B. Apresenta núcleo rechaçado para a periferia, citoplasma mais basofílico e essa rima peri-nuclear (não rima pré-nuclear) esbranquiçada.
A seta é do slide, não está apontando para a rima
Hoje, o estudo terá foco nos plasmócitos.
Célula tronco precursor hematopoiético progenitor linfoide comum Linfócitos B ou Linfócitos T
Linfócitos B Maturam para plasmócitos
Linfócitos T Dois tipos: TCD4 (helper) e citotóxico
Ao falar de Linfócitos B e T, estamos falando sobre imunidade adaptativa
Célula tronco ativa alguns genes para se diferenciar. O precursor mieloide comum pode derivar para o precursor megacariocítico eritroide ao ativar o gene GATA ou para o precursor monocítico e granulócito ao ativar o PU1.
A fim de desviar para a linhagem dos linfoides, é importante a ativação do PU1 e do Ikaros para especificar o progenitor linfoide comum. Uma vez especificado esse progenitor linfoide comum, passamos a ter genes de maturação ou de especificação de linhagem. Quando “ligamos” esses genes podemos ir para as linhagens diferenciadas dos linfócitos (B, T e NK). 
Genes E2A, EBF, Pax5 – ativação do BCR, um receptor que permitirá a diferenciação para a série B.
Genes GATA-3 e Notch 1 – maturação para o linfócito T.
Hoje se sabe que o gene Notch está envolvido em algumas leucemias e linfomas T, protocolos novos já averiguam a expressão gênica no caso dessas doenças.
Genes Ets(principalmente) e Id – maturação para células NK
Pax5 tem capacidade de desligar a programação mieloide (pois ambos têm PU1 ativado) dos linfócitos, de modo que elas maturem para linfócito B.
Ao ligar GATA-3, há regulação e rearranjo de TCRalfa – que é o receptor de linfócitos T – TCRbeta, TCRdelta, além da diferenciação para CD8 e da ativação do Th2 (levará à resposta humoral), que será melhor abordado na próxima aula, também da IL-4 que seria uma via de regulação do Th2.
Os nossos linfócitos vão participar da formação do nosso sistema imune e serão importantes para a defesa do organismo. Desregulação desses linfoides gerará doenças autoimunes como lúpus, artrite reumatoide e outros.
Quando há mutações desses linfócitos de modo que sejam formados clones (todas as células iguais), temos doenças linfoproliferativas, neoplasias linfoproliferativas que podem ser agudas (leucemia linfoblásticas agudas) (marcadores de imaturidade) ou crônicas (linfomas e leucemia linfocítica crônica) ( marcadores de maturidade). 
Linfócito B – nome vem da Bursa de Fabrícios, descoberto em 1956, e em 1975 foi adaptado em vista à maturação na medula óssea (Bone marrow).
Linfócitos T – o “T” vem de timo, que é onde a célula se matura, apesar de a célula também ser produzida na medula óssea.
Linfócitos NK – natural killers.
Conseguimos, pela imunofenotipagem de citometria de fluxo ou imunohistoquímica, identificar cada um desses linfócitos. Na superfície de uma célula há antígenos, em hematologia usa-se muitos CDs. 
Linfócito T – CD3
Helper T CD4
No HIV faremos a dosagem do CD4, e, quando muito baixa, indica que o paciente tem mais tendência a sofrer com doenças oportunistas.
Citototóxico T CD8
Linfócito B - CD19/CD20
Pode expressar 19 associado ao 22 ou ao 10. Pode expressar também imunoglobulinas (Ig) na superfície. Na aula de hoje veremos como esse processo acontece.
Linfócito NK - CD16, 56 e 57.
CD3 negativo na sua superfície, mas tem a cadeia ε do CD3 presente no citoplasma. Ao fazer a citometria de fluxo, há marcação do anticorpo no meio líquido, nesse caso a marcação com CD3 é negativa na célula NK. Já quando é feita a marcação por imunohistoquímica por uma lâmina de parafina, o anticorpo é capaz de detectar essa cadeia CD3 no citoplasma, dando CD3 positivo.
NK pode expressar antígenos de linhagem, os quais não são de linhagem específica: CD2 e CD7
*CD2, CD5 e CD7 – não especificam linhagem.
Como dar o diagnóstico no caso de suspeita de leucemia?
Técnica de citometria de fluxo.
Tem o anticorpo marcado com fluorocromo, que brilha. 
Exemplo: Uso de anticorpo anti-CD19 e de anti-CD3. Pega-se a cultura das células de leucemias (as quais tem morfologia de célula imatura) e que tem um padrão de anticorpos para células imaturas. Se a célula da leucemia expressar o CD19, emitirá uma luz, a qual na citometria de fluxo será detectada, sendo possível ver também se há marcadores de maturidade, como CD34, PDT. 
Se há marcador B com marcador de maturidade – leucemia linfoblástica aguda (acho que seria crônica)
Marcador B sem (não seria com?) marcador de maturidade – linfoma
O conhecimento desses antígenos nas células ajudam a dar o diagnóstico, se é aguda ou crônica, B, T ou NK
Se eu “pingar” para leucemia linfoblástica aguda B (não seria T?), uso o anti-CD3. Se eu “pingar” e o CD3 não brilhar, significará que não há expressão desse antígeno, ou seja, vai vir negativo. 
Nosso sistema imune tem células efetoras:
Plasmócitos – células efetoras da linhagem B. apresentam imunoglobulinas, ou seja, anticorpos no citoplasma. São capazes de secretar esses anticorpos
TCD8 (citotóxico) – imunidade adaptativa
Uma célula, para fazer sua função, precisa de um estímulo por parte do antígeno. 
Célula efetora depende de duas coisas: ligação do antígeno ao complexo maior de histocompatibilidade e ligação de moléculas de co-estimulação entre moléculas do antígeno ao do nosso sistema imunológico. Quando a co-estimulação não acontece, ocorrendo apenas a ligação ao complexo maior de histocompatibilidade, temos dois fenômenos possíveis: deleção clonal (fazer apoptose para não agredir o self) e a anergia (não atacar, não reagir).
Por exemplo: se eu reconheci uma molécula de adenina (?) no meu corpo, eu não vou atacar o meu próprio corpo. Ou seja, essa célula vai ficar anérgica ou vai morrer. Anérgico é não reagir contra aquilo. Ou ela vai ativar um mecanismo de apoptose e morrer.
O complexo maior de histocompatibilidade do homem é o que chamamos de HLA.
Para fazer um transplante de medula óssea, preciso saber se o receptor é HLA compatível com o doador, ou seja, se o sistema imunológico dele vai se adaptar aos antígenos do meu doador.
HLA são divididos em classe 1 ou classe 2. Todos eles estão no cromossomo 6.
HLA classe 1 – HLA-A, -B e -C
Classe I – todas as células do nosso organismo tem, é o nosso “crachá” para poder estar naquele local.
HLA classe 2 – HLA-DR, -DQ e –DP
Classe II – expresso pelas células apresentadoras de antígenos: monócitos e células dendríticas, linfócito B.
O que o Classe 1 faz?
Processa proteínas internas do nosso citosol e vai apresentar na superfície. Então, por exemplo, se eu pego um antígeno próprio do organismo e expresso na superfície, isso levará ao fenômeno de auto-tolerância, já que eu não quero que essas células sejam atacadas pelo meu sistema imune.
	Quando há um vírus que entra na célula, ele usa nossa maquinaria para formar proteínas novas e expressa essas proteínas, que não são comuns no organismo, na superfície das células. A partir desse mecanismo, os linfócitos T (CD8) reconhecerão a expressão dessas proteínas estranhas e atacarão a célula.
Importância do HLA 1 – autotolerância e atacar células infectadas
Células NK são inibidas pelo HLA classe 1. Linfócitos NK são mais simples, são mecanismos da imunidade inata. Se eles encontram uma célula sem crachá, matam-na, se eles encontram uma célula com crachá, não matam.
Aqui temos a célula com o complexo maior de histocompatibilidade classe 1, ela está apresentando o antígeno que é interno da célulapara um linfócito T citotóxico. Se esse antígeno for, por exemplo, um vírus, que se apropriou da nossa maquinaria, ele ataca. Se for um antígeno normal do corpo, ele não ataca. 
Como funciona o HLA classe 2?
Macrófago: fagocita uma bactéria, processa essa bactéria e a apresenta pelo antígeno na superfície da célula. 
Célula fagocitou um micro-organismo externo, apresenta-o para o linfócito T CD4, por exemplo. De modo a gerar uma resposta imunológica – dar um estímulo a mais para essa célula matar, chamar outras células para matar aquele patógeno.
Nas células apresentadoras de antígeno, há o classe 2. 
Comparações
Classe 1: três alfas e um beta
Classe 2: dois alfa e dois beta.
No classe 1, o antígeno vem de dentro da própria célula; no classe 2, vem de fora.
Linfócito T citotóxico (T CD8), reconhece o HLA classe 1 enquanto o helper (T CD4) reconhece o classe 2.
Qualquer célula do organismo, portanto, pode estimular o CD8 para ter atividade?
Se isso fosse verdade, teríamos CD8 atacando a todo momento qualquer célula do organismo. Ou seja, não é o fato de ter HLA classe 1 que vai estimular o CD8 a atacar. É necessário um co-estimulo. Somente células capazes de liberar o co-estimulo são capazes de ativar o CD8 e também o CD4.
Considerando um caso em que se machucou a pele e a bactéria entrou. Abaixo da pele, temos as células dentríticas, capazes de fagocitar as bactérias estranhas e levar esse antígeno via sistema linfático em direção ao linfonodo mais próximo (causa de ínguas em situações de ferimento ou dor de garganta).
Nesse momento, a principal função da célula dendrítica é fagocitar e digerir essa bactéria. Ela encaminha a bactéria digerida ao linfonodo mais próximo. Nesse, a célula dendrítica perde a função de fagocitar e gera função de co-estímulo, passando a apresentar moléculas co-estimuladoras (B7).
Nesse momento, se há uma célula capaz de apresentar antígenos classe 1 ou 2 e de apresentar co-etimulos, ela é capaz de ativar a função imunológica.
Interação de uma célula dendrítica com um linfócito T naive (que não foi estimulado). 
Célula dendrítica apresenta via HLA (HLA 1 se for CD8 ou HLA 2 se for CD4). 
No caso de ser um linfócito T CD4: essa célula dendrítica, além de apresentar o antígeno, expressa B7, que se liga à molécula estimuladora do T CD4, o CD 28. Agora sim há dois sinais, a célula é então ativada, irá se proliferar, produzirá citocinas e vai se diferenciar.
Linfócito B: Há o antígeno circulante. O linfócito B apresenta um receptor de membrana, o antígeno se liga a ele. Esse antígeno ligado é processado pelo linfócito B, que apresenta o antígeno para o linfócito T. Nesse momento, o linfócito B não foi ativado ainda, ele precisou do co-estimulo do linfócito T via CD40L e CD40, além do HLA, para ser ativado, permitindo que vire um plasmócito e secrete anticorpos.
Aqui embaixo há uma célula apresentadora de antígenos, ela apresenta o antígeno via classe 2 para o CD4 e via classe 1 para o CD8. O CD4 usa a molécula estimuladora CD40 e CD40L, enquanto a célula CD8 usa o CD 28 e o B27 (ela fala B27 toda vez, mas no slide está escrito B7....).
Uma vez que o CD4 é ativado, ele consegue aumentar a expressão de CD40 e CD40L e secretar IL-2, o que estimula também o CD8 a aumentar os seus ligantes e a orquestrar a resposta imunológica. O CD4 ativa o CD8
Assim, somente a ligação do CD8 às vezes não é capaz de ativá-lo totalmente, às vezes é necessário estímulo por parte das citocinas do linfócito T CD4 (IL-2).
Na aula passada, vimos funções do basófilo, eosinófilo, neutrófilo, macrófago. Foi comentado da célula dendrítica também, ou seja, foram comentadas as células da imunidade inata.
A partir da aula de hoje tem-se as células da imunidade adaptativa (linfócitos B e T).
Ficou faltando a respeito da imunidade inata comentar sobre os linfócitos NK e do sistema do complemento.
Na imunidade inata temos elementos humorais e elementos celulares
Elementos humorais podem ser divididos em:
Proteínas de fase aguda
Citocinas
Sistema do complemento
Comum na clínica – sistema está em infecção, vamos fazer um PCR do paciente. É percebida a Proteína C secretada em processos inflamatórios e infecciosos, ela ajuda na opsonização dos micro-organismos.
Ou seja, uma em um exame PCR, a queda do índice da Proteína C indica o quadro de melhora decorrente, por exemplo, de um antibiótico.
Existem outras proteínas que conseguem mostrar ou também participam dessa resposta imunológica.
Citocinas
IL-6 é uma das principais para a resposta inflamatória ao estimular a hexidina (hepcidina). 
IL-2 é capaz de ativar o linfócito T CD8 e também o NK.
A secreção de citocinas chama e ativa células do nosso sistema imunológico.
Macrófago atua na formação de granuloma com auxílio do papel do interferon gama.
Linfócito NK – tem em seu citoplasma perfurinas e granzinas, que são moléculas capazes de perfurar as outras células, então o linfócito NK apresenta citotoxicidade direta ao secretar seus grânulos sobre outras células. 
O linfócito NK tem 2 receptores de superfície: KAR e KIR
KAR – mantém a célula programada para matar (como se fosse o James Bond kkkk) 
KIR – receptor inibidor, impedindo que a célula mate. É ativado pelo complexo maior de histocompatibilidade 1. KIR tem capacidade de reconhecer se é uma célula do organismo. Um tumor, por exemplo, que tenha perdido a função do HLA classe 1 vai ser destruído devido à falta de ligação com KIR. 
Além do tumor, a diminuição da expressão da classe 1 é muito comum em células infectadas por vírus; quando isso acontece, as células infectadas fogem do linfócito T CD8 e sobra para o NK matar.
Experimento feito com sarcoma de Ilke (?)
Células NK cultivadas e estimuladas por IL-2 junto com sarcoma, as células verdes são os sarcomas, as NK são as menores.
Atividade imune é geradora de grânulos (danos?). 
Programar o sistema imunológico para uma resposta localizada. Os pesquisadores conseguiram colocar um receptor de IL-2 no NK. Cultivá-lo in vitro e depois fundir esse NK com (o sarcoma?). 
Recentemente: pegaram um linfócito T e um pedaço de receptor de células B, de modo a ser constantemente ligado ao linfócito T. Isso seria injetado nas pessoas com leucemia B, de modo a fazer com que os linfócitos T dessa pessoa ataquem o tempo todo os linfócitos B.
O linfócito NK apresenta uma toxicidade natural independente de anticorpo (e citotoxicidade celular dependente de anticorpo). Ele expressa uma molécula chamada CD16, que é um receptor FC.
No anticorpo, há a porção Fab, que se liga no antígeno, e a porção FC, que se liga no macrófago, por exemplo, além de se ligar no CD16 do NK.
Ele apresenta CD2, CD7 e pode ou não expressar CD8.
Ele apresenta ε CD3 apenas no citoplasma, não na superfície. Então só será identificado por anticorpos que identificam a cadeia ε no citoplasma.
Ele tem um TCR germiline. Apresenta também CD 56 e CD 57.
Ativação por: IL-2, IL-12, IL-15
Acredita-se que a origem dessa célula é na medula, mas não se sabe ao certo. Ele está presente no baço, no sangue. Tem papel no transplante de medula óssea com relação ao GVHD (doença do enxerto contra hospedeiro- graft-versus-host disease) e GVL (doença do enxerto contra leucemia).
Morfologicamente os linfócito snNK possuem grânulos de citoplasma com materiais capazes de serem citotóxicos e, por isso, apresentam um aspecto denominado de linfócito com grandes grânulos (linfócito large granular). 
Sistema do complemento
Duas vias principais: via clássica X alternativa
Via clássica – ativada por anticorpos. IgM é um anticorpo que é capaz de ativar o complemento muitas vezes até a formação do complexo MAP, que perfura a membrana das células levando à lise dessas. Há moléculas de IgG, sendo que 1 e 3 são capazes, principalmente, de ativar o complemento. Quando o complemento é ativado, C3 é capaz de opsonizar as células estranhas agindo como um anticorpo. Ou seja, ele opsoniza o corpo estranho marcando-o para o sistema imune.
Se a ativação for tão importantepara passar ao C3b, que ativa C5 e se junta com C6, C7, C8 e C9 e forma um grande complexo que funciona como uma “furadeira”, esse complexo é o MAC, o complexo perfura a membrana resultando em uma lise completa da célula. Ou seja, o complemento é capaz de matar a célula sem necessariamente sinalizar para a fagocitose do sistema imune. 
(Posteriormente, perguntando para o professor Fernando a diferença entre as vias, ele disse que a via clássica é aquela ativada com a ação de anticorpos e a via alternativa é aquela em que o complemento se ativa ao entrar em contato com certos microrganismos. Ambas as vias são capazes de desenvolver a cascata até C3b e só opsonizar ou até MAC e perfurar).
IMUNIDADE ADAPTATIVA
Características:
Diversidade – capacidade de reagir a um número ilimitado de antígenos.
Especificidade – um anticorpo para um antígeno específico.
Memória – em um segundo contato, a reposta acontece mais rápido do que em relação ao primeiro contato.
Autotolerância – normalmente não há ataque a células próprias do organismo.
Regulação hipostática (hemostática) – uma vez retirado o antígeno, há redução da resposta imune.
A resposta imunológica acontece principalmente nos órgãos linfoides secundários
Primários ou generativos – formação e maturação das células
Medula óssea- origem dos linfócitos e onde os linfócitos B vão maturar. O linfócito T é gerado na medula óssea, mas é maturado no timo. Essa maturação que ocorre no órgão linfoide primário é independente da exposição a antígenos.
A célula madura vai para a circulação, no momento que ela encontra o antígeno nos órgãos linfoides secundários, há a reposta imunológica. O linfonodo é um exemplo de órgão secundário, assim como baço, tecido linfoide associado às mucosas e tecido linfoide associado à pele.
Distribuição dos linfócitos
Maioria no sangue são T, minoria B. A maioria dos T são CD4, minoria CD8. NA medula é ao contrário, há maioria CD8. É importante conhecer essa predominância no nosso organismo para determinar um diagnóstico. 
Paciente – 28.000 linfócitos. Normal é em torno de 3.500 Como saber se esse linfócito é maligno ou benigno?
Fenotipar esse linfócito. Ele é CD20, CD19 e CD5 com uma expressão de imunoglobulina de superfície fraca. Ou seja, trata-se de um linfócito B. De todos os linfócitos, havia 26.000 B, ou seja, apenas 2.000 T. Nesse caso, a paciente tem uma doença linfoproliferativa B, uma leucemia crônica B, que é um linfoma, na prática.
 Marcadores de imaturidade: CD34, TDT, CD117 na mieloide
Marcadores de maturidade: IgMs de superfície.
No momento em que formo a imunoglobulina de superfície, a célula deixa de ser imatura.
Linfócitos B
A célula tronco é atraída pelo CXCL12 para a medula óssea. A célula tronco na medula óssea vai ter importância para a FLT3, vai ajudar na ligação dessa célula ao estroma da medula óssea, vai fazer com que ela se comprometa à linhagem do progenitor linfoide comum. Aqui haverá as integrinas, que irão ajudar a manter a célula ligada ao estroma, e o próprio estroma secreta interleucina 7, que faz com que essa célula passe de progenitora para formar um primeiro estágio do linfócito B, que é o pró-B precoce. No pró-B precoce, haverá a importância do Kit, que é o CD117 – marcador de maturidade, que mantém o estímulo do estroma para continuar maturando.
Quando a célula termina o seu processo de maturação e sai da medula óssea, ela expressa um anticorpo de superfície.
Além do processo de ativação gênica, há também moléculas de adesão e citocinas participando o tempo todo dessa maturação, elas que vão atestar a passagem de um estágio para o outro. 
Ikaros estimula genes (não dá pra ouvir quais, acho que E2A e EBF), que serão necessários para a ativação de RAG, a qual vai ajudar a mexer o material genético para formar o anticorpo e para a formação de Pax5, que é o marcador da linhagem B e ajuda a formar CD19 e BCR, que é o receptor de células B. 
A maturação na medula óssea é independente de antígeno e a maturação externa é dependente de antígeno. Na maturação na medula óssea, há a presença de células imaturas, não há ainda a formação das imunoglobulinas de superfície, que são o último passo do processo de maturação. Nesse momento, há marcadores de células imaturas presentes como por exemplo TDT. Na célula mais madura passa a expressar o CD20.
A nossa imunoglobulina é formada por duas cadeias pesadas (uma região pareável? (variável) e três regiões constantes) e duas cadeias leves (uma região variável e uma região constante).
A cadeia pesada pode ser IgM, IgD, IgA, IgE e IgG.
Cadeia leve pode ser kappa ou lambda.
Isso é dosado na prática clínica. À medida que é catado o linfoma ou o mieloma, um anticorpo pode diminuir
A cadeia pesada é produzida pelo cromossomo 14. A cadeia leve é produzida pelo 2 (kappa) e pelo 22 (lambda). 
Exemplo: linfoma do manto – translocação 11, 14 (cromossomo 11- gene da ciclina D1).
Linfoma folicular – translocação cromossomo 14 , 18 (contém gene apoptótico)
Linfoma de Buttage – translocação 8 (contém gene de proliferação celular), 14
A maioria dos nossos linfomas são formados por mutações no cromossomo 14. A região variável é a que vai reconhecer o antígeno, a região constante é a que vai se ligar ao receptor do sistema linfocítico (fagocítico) nuclear, como o macrófago.
A imunoglobulina pode ficar na superfície da célula ou pode ser secretada por um plasmócito e ficar livre para opsonizar os micro-organismos.
Cadeia Pesada
Região V, D e J.
Várias regiões V, várias regiões D e várias regiões J. Daqui para trás é a cadeia pesada. Primeira cadeia pesada que existe na sequência é a cadeia Mi, que fará a IgM.
Nas cadeias leves não há região D, apenas V e J. Na hora de recombinar o material genético, vou pegar um pedacinho daqui, um pedacinho daqui e formar o anticorpo(?)
Como são várias possíveis combinações, é possível formar vários anticorpos diferentes dando diversidade ao sistema imunológico. 
A RAG é uma enzima que corta o material genético em uma sequência de sinalização, quando isso ocorre, o gene cortado é preenchido pela TDT (presente em células imaturas) e ligo o material genético com DNA ligase. Esse processo permite que o fragmento que não vai ser usado seja descartado.
MO célula progenitora – nesse momento tem o linfócito pré-B, que tem o DNA germline, eu não mexi no material genético dele ainda. Depois eu vou mexer no material genético até formar uma imunoglobulina de superfície. Essa imunoglobulina, ao reconhecer o self, vai induzir a morte celular, pois o objetivo não é que ela reconheça self. Se não reconhecer, ele é jogado na circulação periférica e passa a ser chamado de B naive.
Ele faz um processo chamado de splicing do RNA, formando outra cadeia pesada, o IgD. Nesse momento, o linfócito B naive encontra um antígeno, deixando de ser naive, ele vai ter a primeira resposta imunológica, que é do tipo IgM. (Primeira resposta é com IgM, apenas depois com IgG, essa noção é útil na clínica).
Se essa célula naive não encontra o antígeno, ela vai ficar circulando no sangue. Quando ela passa por um linfonodo com uma célula dendrítica que reconheceu o antígeno e que está secretando citocinas, ela é atraída para aquele local. 
O linfócito T do linfonodo tem íntima relação com a célula dendrítica, linfócito T apresenta antígeno para o B naive. QUEM APRESENTA? O LINFÓCITO T OU A CÉLULA DENDRÍTICA (SEI QUE DEND APRESENTA PARA T)
No momento que o linfócito B naive é apresentado ao antígeno pela célula dendrítica, ele vai sofrer um processo proliferativo ativando DCN6, prolifera e vira um centroblasto. O centroblasto prolifera, transforma o folículo que era primário em secundário e passa por um processo chamado permutação somato (?) imunoglobulínica, o qual aumenta a sua afinidade pelo antígeno que está reconhecendo, e mutação de classe de imunoglobulina, começando a formar IgM, IgG, IgA e IgE. Ele passa a ser então um centrócito, que sai do centro germinativo podendo virar uma célula B de memória (no momentoem que encontrar aquele antígeno de novo, vai gerar uma resposta IgG, não mais IgM) ou pode se tornae um plasmócito (secretar anticorpos).
Progenitor B – sem mexer no DNA de cadeia pesada, nem de cadeia leve. 
Próximo passo: Pré-B – mexe na cadeia pesada antes da leve. Faz rearranjo do D e do J. O pedaço indesejado é jogado fora via RAG. Depois pega o V, liga ao VDJ.
Isso ocorre em ambos os cromossomos. 
A combinação de VDJ permite formar mais de 10.000 tipos de anticorpos, ou seja, reconhecer mais de 10.000 antígenos. 
Se esse rearranjo não der certo, a célula entra em apoptose. Como testar esse rearranjo? Com uma cadeia leve substituta. Há uma cadeia leve que se une com uma cadeia pesada se formando, resultando em um pré-anticorpo. Ele é testado na superfície da célula. Se houver capacidade proliferativa, a célula continua; se não, texto outro gene, se esse gene funcionar, célula vai pra frente, se não entra em apoptose.
Somente 55% das nossas células produzidas vão para frente, isso é uma forma de garantir que exista uma maquinaria de bom funcionamento.
A cadeia pré-B substituta permite a criação de um pré-receptor (pré-BCR), que é jogado na superfície da célula. Esse receptor é formado por dimerização. Se isso leva a uma ativação celular, via de sinalização para a célula se proliferar e dividir, o receptor está funcional. Desse modo, ao fim desse processo a célula muda de estágio, indo de BCR grande até BCR pequeno.
Se esse receptor não estiver funcionando, testa-se o segundo gene. Se ele funcionar passa de estágio; se não funcionar, a célula morre. 
A sinalização do pré-BCR acontece por duas moléculas principais: o BLNK e o BTK
Ausência de BLNK = bloqueio no pró-B
Mutação do BTK = ausência de B maduro (agamaglobulinemia)
Atualmente existe um anti-BTK – é possível tratar o linfoma B dando um comprimido que inibe a via de sinalização, a via para de proliferar. 
Fenômeno de exclusão alélica
Se um gene não funciona, passa para o próximo; se o gene funciona, para ali. O cromossomo não é testado se o primeiro já funcionar, esse é o fenômeno de exclusão alélica.
Sinaliza para “fenômeno de exclusão alélica” (senão haveria dois receptores de antígenos diferentes na mesma células) o linfócito só expressa um tipo de receptor de antígeno.
Inibe RAG-1 e RAG-2 e aumenta degradação da RAG-2
Pré-B grande – tem a cadeia pesada já rearranjada, cadeia leve germline, porque não há substituição
Pré-B pequeno – essa célula proliferou via BCR, se dividiu em pró-B pequeno, nesse momento já há um rearranjamento da cadeia leve.
Cadeia leve só usa fragmentos do V e J. É possível formar várias combinações. Pode-se formar 30x4 lambidas e 40x5 kappas. 
Eu rearranjo no primeiro gene kappa, se der certo, passo para frente; se não der certo, eu rearranjo o segundo gene kappa; se der certo, eu passo para frente; se não der certo, eu passos para o primeiro gene lambda; se der certo, eu passo para o próximo estádio; se não der certo, eu rearranjo o segundo cromossomo lambda; se der certo, passa para frente; se não der certo, a célula morre.
Com isso, há mais kappa do que lambda. 
Paciente com linfocitose, por exemplo, com todos os linfócitos lambda – isso é normal?
Não, provavelmente há um linfoma ou mieloma que expressa o lambda.
Uma vez que a kappa funcionou então, há um anticorpo completo. Esse é levado à superfície de modo que agora eu tenho um BCR e não mais um pré-BCR.
A primeira cadeia pesada que temos na sequência do cromossomo é a ‘mi’, que é a IgM. Depois surgem as cadeias pesadas que possibilitarão o advento do linfócito B maduro. – Passo a formar também IgD. Como?
Na sequência de DNA – rearranjo VDJ, o que eu não queria joguei para fora via RAG; próxima leitura é a cadeia pesada mi, formação de IgM. Próxima cadeia do cromossomo, é uma cadeia pesada delta que vai formar IgD. O mecanismo de formação de IgD é chamado de splicing alternativo de DNA. Eu traduzo todo o DNA para RNAm. Em um primeiro momento, corto a parte inicial. Em um segundo momento, posso cortar um pouco de IgM e um pouco de IgD. O DNA não está sendo modificado, ele apresenta as duas cadeias diferentemente do caso do switch de classes de imunoglobulina que será mostrado adiante.
Pré BCR – tinha uma cadeia leve substituta
BCR real – cadeia leve ok, cadeia pesada ok.
Aqui do lado, observe que temos IGalfa e IGbeta que são na verdade CD79A e CD79B, tendo uso para fenotipagem.
Uma vez que eu tenho esse receptor BCR formado, a célula está pronta para sair da medula óssea. Se essa célula não encontra nenhum antígeno próprio, ela sai e faz o splicing alternativo. Se ela encontra um peptídio próprio e reage com ele de forma importante, o linfócito pode passar por dois processos. Ou ele vai morrer (deleção clonal) ou ele vai mutar a região da Ig o que é chamado de edição do receptor de cadeia leve, o que permite a sobrevivência do linfócito B. Esses processos existem para que não haja doenças autoimunes.
Se o linfócito formado reagir com o antígeno solúvel próprio do organismo, ele fica anérgico. Vai para a periferia e não é capaz de reagir, e com o tempo morre. Se ele é capaz de reagir fracamente com antígenos self do organismo, ele é autorizado a sobreviver. Nessa situação, esse linfócito vai reagir com o próprio antígeno quando este estiver em grandes quantidades, como em um processo inflamatório com alta exposição desse antígeno, quando pode ser desencadeado um processo autoimune. Essa célula então é chamada de ignorância clonal e é capaz de reagir diferente da anérgica.
A célula B naive expressa CD5 e, se ela não encontrar o antígeno, fica circulando no sangue. Se ocorre um processo no qual há apresentação de antígeno pela célula dendrítica ao linfócito T no folículo primário, a célula B naive entra no folículo pelos estímulos de citocinas liberados pela célula T. Essas células B começam a se proliferar e viram centroblastos. Os centroblastos, ao se proliferarem, empurram a camada de célula B naive que estava só passando por aqui para fora, formando uma região chamada de Zona do Manto.
Desse modo, eu passo a ter um centro germinativo que é o centro da região de proliferação do centroblasto, o qual é circundado pela Zona do Manto.
Na clínica, é possível ter linfomas da zona do manto (CD5 +) e linfomas de centros germinativos.
Se eu tenho folículo primário, não tenho centro germinativo, nem proliferação.
No folículo secundário, eu passo a ter centro germinativo, zona do manto e região de proliferação.
O linfonodo pode ter simplesmente um folículo primário ou pode haver uma proliferação dos linfócitos B formando um folículo secundário. Esses folículos primários e secundários estão na região cortical do linfonodo.
Na região medular – paracortical – há uma região de linfócitos T que ajudam os linfócitos B na resposta imunológica. Por exemplo, a célula dendrítica vem pelo vaso linfático aferente, traz o antígeno, estimula o linfócito T, secreta citocinas, capta o linfócito B e transforma o folículo primário em folículo secundário. 
Podemos ter outros órgãos linfoides além dos linfonodos, como as placas de Peyer do intestino. Mesmo raciocínio. A célula M tem canalículos que permite a entrada de antígenos para o ducto intestinal, e logo abaixo da célula M há todo esse complexo formado de novo (célula dendrítica, estímulo a linfócito T, recrutamento de linfócito B...). No intestino, há receptores de IgA, que é o anticorpo que reveste as secreções do nosso corpo para impedir a entrada de antígenos.
A célula naive entrou aqui e teve a opção de encontrar um antígeno lá de fora e formar um plasmócito IgM. Se isso não acontecer, ela é apresentada a um antígeno por estímulo do linfócito T e ajudado pela AP100. Nesse momento, ela liga um gene chamado BCL6, que permite a proliferação ao mesmo tempo que posso mudar o material genético. BCL6 abre caminho para a proliferação celular, ao mesmo tempo que inibe a morte celular e permite mutação do material genético, que é um processo de permutação somática da Ig. Eupego essa imunoglobulina formada e quero que ela tenha maior afinidade pelo antígeno que está sendo reconhecido. Ou seja, são feitas mutações pontuais nela para ela se ligar com alta afinidade ao antígeno que está sendo reconhecido pelo centro germinativo. 
Se o meu linfócito B é capaz de se ligar com alta afinidade a esse antígeno, ele é resgatado da apoptose.
Ele liga o BCL2, um gene antiapoptótico, com expressão de forma fraca, resgato a célula da apoptose e ela então vai sobreviver ao longo do centro germinativo. Se depois de uma mutação somática, a célula não é capaz de reconhecer com alta afinidade aquele antígeno, ela é programada para morrer. Ela não liga o gene antiapoptótico BCL2.
Uma vez que isso aconteceu, a célula vai passar por um outro processo chamado switch de classe da imunoglobulina. Vou cortar o material genético, jogar fora a cadeia mi, a delta, a épsilon e vai ficar só com a cadeia gama por exemplo, caso queira formar uma IgG, ou só com a alfa caso eu queira formar uma IgA. EU mantenho minha especificidade e troco meu tipo de cadeia efetora. A troca da cadeia efetora é importante (IgA principalmente na secreção, IgG atravessa placenta, IgM pode ativar complemento) se eu tenho diferentes moléculas efetoras com a mesma especificidade eu tenho diferentes funções no organismo.
Nesse momento, a permutação somática aumenta a especificidade. É feito o switch de classe de imunoglobulina, essa célula deixa de ser um centroblasto para passar a ser um centrócito. Começa a ativar a via do NF kappa B, via de ativação celular pós centro germinativo. Com a ativação dessa via, eu desligo o gene BCL 6, paro de proliferar a minha célula e ela começa então a se especificar. Ela pode sair do centro germinativo e virar uma célula de memória ou virar um plasmócito.
Quando eu mantenho o PAX 5 ligado, ela vira uma célula de memória; quando eu desligo o PAX 5 e ativo BLNK, ela vira um plasmócito. O plasmócito secreta anticorpo, célula B de memória dá aquela segunda resposta mais rápida a um antígeno já conhecido.
Alguns linfomas que tem morfologia de centroblasto (BCL6 +), comode Burket ou linfoma difuso de grandes células B pré centro germinativo. Tenho o linfoma folicular [t(14,18)], ligou o BCL2 e o linfoma folicular tem a morfologia de um centrócito. A mutação dele ocorreu nesse momento do estádio de maturação.
Conhecendo a maturação do sistema imunológico, eu sei o gene relacionado a cada problema e os antígenos de superfície expressos em cada momento, permitindo entender melhor que doença está se tratando.
AID é uma enzima que gera mutações pontuais na região variável da imunoglobulina (processo de troca de citocina pirimidina). Você preenche com outras bases, com isso acontece a permutação somática.
Quando eu ativo essa outra enzima APE1, sou capaz de quebrar a fita do DNA e excluir cadeias pesadas, e é possível, portanto, formar células IgG. 
Anticorpos tem especificidade a determinado antígeno e diferentes sistema efetores. Anticorpo específico para o antígeno X. Ele pode ser IgM, IgD, igG1, igG2, igG4 e IgE. Tem várias funções efetoras e cada um age de uma forma:
Diferentes corpos com diferentes funções efetoras permitem especificidade e exercício de diferentes funções.
A citometria de fluxo permite saber cada momento da maturação do linfócito B. Desde o pró B até o B maduro, plasmócito. É possível saber por essa técnica cada momento da maturação do linfócito B pelos antígenos presentes na célula (CD 34 e TdT no estagio inicial, depois o aparecimento de IgG e etc.)
Ao fazer o gráfico do CD 20 com o CD10 (a partir de apenas células B, ou seja, células CD19+). Essas células fazem um caminho de maturação característico, no qual perde 10 e ganha 20. No caso de uma leucemia aguda, a célula não faz esse trajeto, há, nesse caso, uma parada da maturação e acúmulo de células imaturas, que não vão ter uma função efetora normal de linfócitos B e vão ocupar o lugar das células normais.
Tudo isso conseguimos dar o diagnóstico conhecendo a linha de maturação.
Vimos hoje:
Recombinação somática do DNA – recombinação do V, D, J lá dentro da medula óssea, isso ocorre nos linfócitos B e linfócitos T, depois vimos o fenômeno de permutação somática – mutações pontuais para aumentar a afinidade por um antígenos específico.
Por último vimos o processo de switch de classes da imunoglobulina, que permite a formação de anticorpos com a mesma especificidade, mas diferentes classes funcionais, o que é diferente do splicing do DNA.
Parte clínica	
Eletroforese de proteínas – na região A, há a albumina, principal proteína do nosso organismo. E na região beta2gama tem os anticorpos.
No gráfico mostrado em sala há um aumento dos anticorpos, sendo que em um caso há um aumento de vários anticorpos (base larga) e em outro um aumento monoclonal (base estreita).
Anticorpo altera carga das Hc e elas se empilham (rouleaux)
A partir daqui a professora deu alguns exemplos de linfomas, mas ela fazia muita alusão a imagens que não achei no slide, então ficaria meio sem sentido aqui. Ela deu enfoque que cada etapa da maturação do linfócito B poderia estar associada a uma doença diferente.