Resumo de MICROARRAY

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MICROARRAY – GENOMICA – UFC (2016.2)
Microarrays = chips de DNA
Lâminas de vidro nas quais segmentos de DNA de fita-única (sondas) são fixados e imobilizados de forma ordenada e em áreas específicas (célula de sonda). 
Na lâmina, cada célula de sonda contém milhões de cópias de um determinado transcrito, ou um segmento gênico em particular, que pode posteriormente ser identificado.
Busca-se identificar variações na expressão de determinados genes que possam ocorrer como respostas biológicas naturais devido à presença de uma patologia, ou alguma outra condição experimental, à qual a amostra em estudo foi submetida.
O princípio da técnica baseia-se principalmente na propriedade de hibridização por complementaridade dos ácidos nucléicos e no fato das sondas no array apresentarem seqüências similares às dos genes de interesse, e complementares às do RNAm ou às do DNAc (DNA complementar), dependendo da tecnologia utilizada.
Mais especificamente, o procedimento envolve a conversão do RNA total obtido a partir do tecido de interesse em DNAc dupla-fita por meio de uma reação de transcriptase reversa. Em seguida, o DNAc serve de molde para uma reação de transcrição in vitro na presença de nucleotídeos marcados com fluoróforos (Cy3 e Cy5), resultando no RNAc (RNA complementar) marcado. Essas moléculas marcadas são hibridizadas à lâmina de microarray e podem se ligar ou não às sondas representadas no mesmo, se ambas as seqüências forem complementares. A lâmina hibridizada é então corada (excitada com laser) e submetida a um scanner, conectado a um software específico que analisa os dados e quantifica a intensidade da fluorescência em cada ponto. O sinal gerado representa a ligação do RNAc proveniente da amostra em e studo com a sonda no array (chip), e tende a ser proporcional à abundância do RNAc presente, até certa concentração de transcritos. A quantificação do sinal permite que a expressão de milhares de genes seja comparada entre diferentes condições experimentais.
Uso:
- Análise simultanea de milhares de copias gênicas. 
- Buscar variações estruturais na seqüência de DNA que possam contribuir para o aumento de susceptibilidade de doenças de uma maneira rápida, econômica e sistemática.
RESUMINDO: determinação de perfis de expressão gênica, ou para o estudo de genômica funcional.
Etapas:
Preparo de amostras
- Todo o RNAm é isolado da célula ou tecido alvo. 
- Convertido em cDNA, pro transcrição reversa (transcriptase reversa).
- Adição de nucleotídeos marcados com fluoróforos. 
Hibridização
- Hibridização comparativa (ou competitiva): análise simultanea de duas amostras (de interesse e a de referência)
- hibridização dos cDNA marcados com fluoróforos às sondas de seq complementares.
Lavagem para a remoção dos cDNAs que não se ligaram às sondas
Detecção, visualização e análise de dados
- exposição à ação de raios laser que excitam os corantes > emissão de luz 
Cada spot de uma lâmina de microarranjo representa o valor da atividade transcricional de um determinado gene em uma situação biológica de interesse.
- as emissões são quantificas quanto a intensidade luminosa emitida > sinais de intensidade, gerados pelos fluoróforos incorporados ao cDNA.
- o software acoplado ao sistema faz a leitura dos sinais cruzando as cores dos fluoróforos (verde e vermelho, criam nuances de amarelo).
Esse programa gera uma tabela de dados numéricos contendo os valores de intensidade dos spots e seus respectivos valores de intensidade do background local (ruído).
- os dados colorimétricos intepretados pelo software são transformados em valores numéricos que indicam a intensidade. 
Os dados originais obtidos como resultado de um experimento com microarranjos são imagens, que representam os níveis de expressão dos genes presentes no suporte sólido, e que devem ser analisadas por um programa específico de análise de imagens.