Relatório da disciplina de Microbiologia Geral

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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
SECRETARIA DE EDUCAÇÃO PROFISSIONAL E TECNOLÓGICA
INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO SUL DE MINAS GERAIS, CAMPUS MUZAMBINHO
 
 
 
MEDICINA VETERINÁRIA
 
 
RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS
 
 
 
 
MICROBIOLOGIA
 
 
 
 
 
Discente: Daniele Cristina Alves
Professora orientadora: Alessandra Lima Santos Sandi
 
 
 
 
 
Relatório elaborado e apresentado na disciplina de Microbiologia do Curso de Graduação em Medicina Veterinária do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia –IFSULDEMINAS, Campus Muzambinho, e supervisionado pela Profa. Alessandra Lima Santos Sandi, docente da referida disciplina.
 
 
 
 
 
JUNHO 2017
MUZAMBINHO
SUMÁRIO
 
 
 
Regras de segurança em laboratório
 
	É PROIBIDO:
Ingerir alimentos e bebidas;
Tocar boca e olhos quando usar reagentes químicos;
Brincadeiras ou qualquer exaltação desnecessária;
Manipular substâncias inflamáveis perto do fogo;
Nunca corra, sempre ande.
 
	DEVE-SE USAR:
Jaleco de algodão ou material pouco inflamável;
Calçados fechados, de preferência de couro;
Lenços de papel, não de tecidos;
Pipetadores sempre que utilizar pipetas;
Equipamentos de segurança extra sempre que necessário.
 
FICAR ATENTO: 
Aos sinais de advertência;
Aos rótulos dos reagentes;
Aos sons incomuns;
A odores incomuns;
A compatibilidade dos reagentes.
 
 
 
 
 
 
1. INTRODUÇÃO
 
 
A microbiologia é um dos setores mais complexos do laboratório de análises clínicas e tem como principal papel a determinação de agentes etiológicos envolvidos nos processos infecciosos e sua suscetibilidade aos antibióticos (ARAÚJO, 2011). 
A microbiologia oferece aporte para o reconhecimento das amplas fontes primárias de microrganismos que apresentam riscos de contaminação. As leveduras, as bactérias, os mofos e os protozoários sintetizam uma série de potenciais de contaminação microbiológica que trazem sérios riscos à saúde humana. Portanto, é imprescindível situar os focos que favorecem o crescimento microbiano. 
Cada microrganismo exige condições favoráveis para seu desenvolvimento e colonização. É importante reconhecer o modo de ação desses seres levando em consideração a necessidade de evitá-los e combatê-los. 
A vida humana é relacionada com os microrganismos, abundantes no ambiente, como no solo, no mar, no ar e em todos os ambientes naturais. Esses seres oferecem muitas evidências de sua existência de forma desfavorável, quando destroem objetos e provocam doenças, ou benéfica, na produção de alimentos. Os microrganismos também são responsáveis pela decomposição de restos vegetais e animais para transformá-los em gases e elementos minerais recicláveis por outros organismos.
Microbiologia é a ciência que estuda os microrganismos, seres vivos extremamente pequenos que pertencem a classes e reinos diversos e entre os quais estão os protozoários, as algas microscópicas, os vírus, as bactérias e os fungos.
	Além disso, a microbiologia abrange diversas áreas como medicina, agricultura e indústria. Muitas doenças do homem, dos animais e de plantas são causadas por micro-organismos, daí a importância de conhecê-los. Em alguns processos industriais também desempenham uma função de destaque, como a produção de antibióticos.
	
Os microrganismos também desempenham papel fundamental na origem da vida. Na ausência de micro-organismos as formas de vida mais complexas não poderiam ter surgido e nem poderiam se manter na atualidade pois, o mesmo oxigênio que respiramos é resultado da atividade microbiana. O homem, as plantas e os animais estão ligados as atividades microbianas desde a reciclagem de nutrientes essenciais até a degradação da matéria orgânica. Nenhuma outra forma de vida tem uma importância parecida com a dos micro-organismos na manutenção da vida sobre a Terra. 
 
 
2. CAPÍTULO 1
2.1 MEIOS DE CULTURA, PLAQUEAMENTO E ESTERILIZAÇÃO
 
 
A presente aula prática de Microbiologia foi realizada no Laboratório de Bromatologia no Campus do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sul de Minas Gerais, na cidade de Muzambinho.
O objetivo desta aula foi apresentar o que é e os tipos de meio de cultura existentes, diferenciando-os, além de apresentar técnicas de preparo, tipos de plaqueamento e esterilização.
Os meios de cultura, são meios que oferecem artificialmente condições favoráveis de temperatura, pH, nutrientes, água, para o crescimento e multiplicação de microrganismos nos laboratórios para análises e estudos em cima disso e podem ser preparados com o propósito de haver a inoculação de amostras e proliferação de microrganismos desejáveis nesse meio. 
Para que não haja contaminação de outros microrganismos indesejáveis no meio, é de suma importância a esterilização do meio de cultura e demais materiais utilizados. Cada meio de cultura tem um propósito e uma maneira de ser preparado, dependendo do microrganismo que vai ser inoculado. Eles podem ser caldos ou ágares, diferenciando em líquidos e solidificados, como é utilizado e quantidade.
Cada meio de cultura tem um propósito e uma maneira de ser preparado, dependendo do microrganismo que vai ser inoculado. Eles podem ser caldos ou ágares, diferenciando em líquidos e solidificados, como é utilizado e quantidade. Existem vários tipos de meios de cultura, há os seletivos que têm substâncias inibitórias á certos grupos de microrganismos, sem agir sobre outros; os de pré- enriquecimento tem a função de proporcionar a dessensibilização dos microrganismos injuriados ; os de enriquecimento têm em sua composição sangue, soro ou extrato de tecidos animais ou vegetais como forma de nutrir microrganismos exigentes com nutrientes extras os diferenciais apresenta substâncias que após a incubação proporcionam crescimento alterado, proporcionando assim, melhor identificação dos microrganismos presentes(RUIZ, 2000).
Utilizado em grande escala na microbiologia, principalmente para culturas sólidas de bactérias, o Agar é um meio de cultura obtido a partir de algas marinhas vermelhas e formado por uma combinação de agarose e agaropectina.
Agar é um meio de cultura obtido através de algas marinhas vermelhas e criado por uma combinação de agarose e agaropectina.
Encontrado na forma de pó ou em tiras secas, o Agar tem como característica a capacidade de continuar maleável mesmo quando exposto a temperaturas altas, o que permite sua utilização dentro do escopo de investigação laboratorial.
Devido a sua elevada concentração de carboidratos e sua estrutura química rica em nutrientes, o Agar é um excelente meio de cultura para o crescimento de vários tipos de fungos, leveduriformes e filamentosos. Sua consistência gelatinosa permite uma manipulação fácil e segura dentro do ambiente laboratorial. Em geral, o Agar é utilizado para o estabelecimento de meios seletivos e diferenciais. No primeiro caso, ele pode ser aplicado em determinados grupos de microorganismo, impedindo o crescimento de outros no mesmo ambiente e selecionando um cenário para estudo. No meio diferencial de cultura, o Agar permite estabelecer diferenças entre microrganismos muito parecidos.
Existem três tipos de meios de cultura sendo eles o meio sólido, semissólido e o líquido.
O sólido é composto basicamente por uma grande quantidade de Ágar e alguns nutrientes. O meio semi sólido, já apresenta uma menor quantidade de Ágar em relação ao meio sólido e é utilizado com mais frequência para avaliar a motilidade de bactérias e células vegetais que apresentam cílios. E por último, o meio líquido não contém Agar. É composto por caldo que é um meio de enriquecimento.
Foram apresentados também os meios seletivos, que selecionam o tipo do micro-organismo que vai crescer naquele meio, e o meio diferencial, que é diferenciado, por micro-organismos que ali se desenvolvem, não ser apenas um específico.
Posteriormente foi abordado o tópico sobre plaqueamento, que é o modo como se coloca o meio de cultura sobre a placa de Petri.  Existem
dois tipos: o superficial, que é utilizado para a proliferação de bactérias que necessitam de muito oxigênio e o de profundidade, utilizado para micro-organismos que não necessitam de muito oxigênio.
Quando se trata de análises microbiológicas, é necessário ter um enorme cuidado para não haver a contaminação cruzada, que pode ser oriunda de vidrarias mal lavadas e sem esterilização, ambiente, entre outros. Para que isso não ocorra, os materiais que são usados nestes tipos de análises, passam pelo processo de esterilização que pode ser feita via calor úmido, que é feito através da autoclave; o calor seco, pela estufa; a química através de sanificantes, sendo mais recomendados clorexidine e iodo; e também a luz ultravioleta.
 
 
3. CAPÍTULO 2 – PLAQUEAMENTO
 
	3.1 INTRODUÇÃO
Existem 2 tipos de plaqueamento: plaqueamento em profundidade e plaqueamento por semeadura em superfície. O plaqueamento por profundidade consiste em adicionar a amostra diluída, distribuir o meio de cultura fundido em placa de Petri esterilizada até que se obtenha uma camada de no mínimo 3 mm a 4 mm (por exemplo, para placa de 90 mm de diâmetro, 15 mL a 20 mL de ágar são normalmente requeridos)homogeneizar rapidamente fazendo círculos com a placa. Aguardar o resfriamento e solidificação do ágar, colocando as placas de Petri em uma superfície horizontal e temperatura ambiente.
O plaqueamento por semeadura em superfície consiste em distribuir o meio de cultura fundido em placa e Petri esterilizada até que se obtenha uma camada de no mínimo 3 mm a 4 mm (por exemplo, para placa de 90 mm de diâmetro, 15 mL a 20 mL de ágar são normalmente requeridos). Aguardar o resfriamento e solidificação do ágar, adicionar a amostra diluída e semeia-se com o auxílio de um “loop” ou alça de Drigalsky proporcionando completa absorção da amostra no Ágar.
 
 
 
	3.2 OBJETIVOS
 
Avaliar o número de microrganismos presentes na suspensão através dos métodos de contagem em placa.
 
3.3 MATERIAIS E MÉTODOS 
 
A presente aula prática de Microbiologia foi realizada no Laboratório de Bromatologia no Campus do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sul de Minas Gerais, na cidade de Muzambinho.
A mesma teve seu procedimento experimental que consiste na pesquisa de presença de microrganismos em objetos utilizados no dia a dia e pelo ambiente.
 
3.3.1 Materiais 
 
Os Materiais utilizados para realização da prática para a coleta da análise microbiológica foram swab, diluente (água peptonada) e placas de Petri.
 
	3.3.2 Elementos analisados
 
Os elementos analisados foram chave de carro, alça da mochila, dinheiro e a impressão digital. Analisou-se também elementos ambientais, como o ar de uma sala de aula da turma de Engenharia Agronômica do Instituto.
 
	3.4 MÉTODOS
 
3.4.1 PROCEDIMENTO 1
 
Inicialmente foi dividida uma placa de Petri em quatro quadrantes e realizada a identificação de cada quadrante. 
O procedimento exigiu a umidificação do swab no diluente para passá-lo sobre a superfície da alça da mochila, do dinheiro e da chave do carro. Para cada análise foi utilizado um swab estéril. Após passar o swab pelas superfícies, foi feito um esfregaço no local identificado transferindo para a superfície da placa de Petri. Distribuiu-se o inoculo na superfície e encubou a placa na temperatura de 35ºC, por 48 horas.
 
 
		3.4.2 PROCEDIMENTO 2
 
Para a análise ambiental foram utilizadas quatro placas de Petri estéreis. Elas foram deixadas em uma sala de aula do curso de engenharia agronômica durante o período de aula, em que havia várias pessoas, aumentando assim, o número de microrganismos presentes no ambiente.
As placas foram numeradas de 1 a 4 e cada uma foi deixada por um tempo específico. A placa número 1, ficou exposta no ambiente por 5 minutos; a placa número 2 por 10 minutos; a placa número 3, por 15 minutos e a placa número 4 por 20 minutos.
Em seguida, as placas foram tampadas e encubadas na temperatura de 35°C, por 48 horas.  
 
 
3.5.1 RESULTADOS E DISCUSSÕES
 
PROCEDIMENTO 1
 
Após 48 horas de incubação, foi feita a contagem de colônias em cada quadrante. No quadrante 1, que foi coletada a amostra do dinheiro, as colônias foram incontáveis. No quadrante 2, foi a digital, que apresentou somente 12 colônias. O quadrante 3, apresentou 74 colônias representando a amostra da chave do carro e no quadrante 4, que representa a amostra da alça da mochila, apenas 12 colônias. 
Figura 1 – Formação de Colônias, a partir da amostra
 Coletada da nota de 50 reais
Fonte: Elaborada pelo autor
Figura 2 – Formação de Colônias, a partir da amostra
 Coletada da nota de 50 reais
Fonte: Elaborada pelo autor
Figura 3 – Formação de Colônias, a partir da amostra
 Coletada da nota de 50 reais
Fonte: Elaborada pelo autor
Figura 4 – Formação de Colônias, a partir da amostra
 Coletada da nota de 50 reais
Fonte: Elaborada pelo autor
Figura 5 – Formação de Colônias, a partir da amostra
 Coletada da nota de 50 reais
Fonte: Elaborada pelo autor
. 
 
3.5.2 PROCEDIMENTO 2 
Após 48 horas de incubação, foi feita a contagem de colônias em cada placa. Na placa que ficou exposta 5 minutos, apresentou X colônias. A placa que ficou exposta 10 minutos apresentou X colônias. A que ficou 15 minutos, X colônias e a que ficou 20 minutos, X colônias.
Figura 6 – Contagem de Colônias, após 24 horas.
Fonte: Elaborada pelo autor
Figura 7 – Contagem de Colônias, após 24 horas.
Fonte: Elaborada pelo autor
Figura 6 – Contagem de Colônias, após 24 horas.
Fonte: Elaborada pelo autor
Figura 9 – Contagem de Colônias, após 24 horas.
Fonte: Elaborada pelo autor
4.Capítulo 3 
 
Coloração de Gram
4.1 Introdução
A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853 - 1838), em 1884, e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com o reagente cristal violeta, lugol, álcool-acetona e fucsina básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas.
A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia e de análises clínicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos. Essa informação permite ao clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis. 
É possível a análise de vários esfregaços por lâmina, o que facilita a comparação de espécimes clínicos. As lâminas podem ser montadas de forma permanente e preservadas como documentação.
4.2 Objetivo
Confeccionar uma lâmina e utilizar a técnica de gram para visualizar a morfologia das bactérias ao microscópio óptico.
4.3 Materiais 
Os Materiais utilizados para realização da prática foram lâmina, solução salina, alça bacteriológica, lamparina, colônia de bactérias papel filtroe microscópio. As soluções foram cristal violeta, lugol, álcool-acetona e fucsina.
 
4.4 Métodos
Sobre a lâmina de vidro, colocou-se uma gota de solução salina. Com a alça bacteriológica tocar levemente na superfície da colônia e emulsionar o material na gota de solução salina (caso o microrganismo seja fornecido em solução, colocar uma gota na lâmina). Deixar secar.
Passou-se o esfregaço na chama do bico de Bunsen três vezes a fim de fixar o material. Posteriormente cobriu-se o esfregaço seco com violeta de genciana (cristal violeta) e deixar por um minuto.Lavou-se com água corrente. Esgotou-se a lâmina, e a cobriu com solução de lugol e deixar por um minuto. Esgota-se a lâmina e, mantendo a mesma inclinada, pingou-se
gotas de Álcool-acetona até que não se desprenda mais corante da preparação. Lavou-se com água corrente. Cobriu-se a lâmina com solução de fucsina e deixar por trinta segundos. Lavou-se a lâmina e a cobriu com papel filtro para a secagem da lâmina. Em seguida examinou-se ao microscópio com a objetiva de imersão.
4.5 Resultados:
Gram (+) coram de roxo, gram (-) coram de rosa.
4.6 Conclusão
A coloração de Gram é baseada na capacidade das paredes celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com álcool-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem.
As bactérias Gram positivas coram-se de roxo e as Gram negativas coram-se de vermelho. Esta técnica de coloração permite então a distinção entre bactérias com parede celular mais ou menos rica em peptidoglicanos. De referir que embora uma bactéria Gram negativa nunca possa corar positivamente pelo Gram, uma bactéria estruturalmente Gram positiva pode corar negativamente se a sua parede de peptidoglicano for destruída ou danificada..
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6. REFERÊNCIAS
Araújo, Paulo Caetano Manual de procedimentos técnicos para o clínico de pequenos animais / Paulo Caetano de Araújo. – São Paulo : Roca, 2010.
http://www.prolab.com.br/blog/entenda-o-que-e-agar-e-para-que-serve-esse-meio-de-cultura/<acessado em 23/06/2017>
FERRAZ, F. C.; FEITOZA, A. C. Técnicas de segurança em laboratórios: regras e práticas. São Paulo: Hemus, 2004.
Manual de Procedimentos Técnicos para o Clínico de Pequenos Animais. Roca, 01/2011. Paulo Caetano de Araújo 2011 da 1a Edição pela Editora Roca Ltda.http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_4_2004.pdf <acessado em 23/06/2017>
 
MOURÃO, Campus–Campo; EM ALIMENTOS, Curso Superior de Tecnologia. ISABELA DE SOUZA CELLONI. 2014.
http://www.infoescola.com/bioquimica/coloracao-de-gram/
 
RUIZ, R. L. Manual prático de microbiologia básica. São Paulo: Universidade de São Paulo, 2000. 50-51p.