Técnicas Básicas de Biologia Molecular FIOCRUZ 2006

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Técnicas Básicas de Biologia 
Molecular 
Diamar Costa-Pinto 
By Diamar 
Visão da Apresentação 
 PCR 
 Bibliotecas genômica e de expressão 
 Sequênciamento 
 Southern, Northern e Western blotting 
 RFLP, SSCP 
 FISH 
 Microarrays 
 
By Diamar 
Diagnóstico do século 21 
- Podemos fazer análises genômicas, 
pois a maioria dos cromossomo já estão 
mapeados. 
- O projeto genoma tem sido uma 
grande ferramenta para unir genomas e 
laboratório clínico. 
By Diamar 
 Mapas Genéticos, Citológicos e 
Físicos 
 
EST – Sequências expressas marcadas. 
cDNA curtos que ligam mapas físicos a 
genéticos 
RFLP- Polimorfismo dos comprimentos 
dos fragmentos de restrição 
 
Eletroforese 
+ - 
Horizontal 
Vertical 
Fonte de eletroforese 
Visualização do gel de agarose 
- 
+ 
Eletroforese 
By Diamar 
Sequenciamento 
 Frederick Sanger (1977), Inglaterra 
 Segundo Prêmio Nobel 
 Síntese de DNA in vitro por término 
didesoxi 
 Mapa físico dos genes e dos 
cromossomos 
By Diamar 
Sequenciamento 
 (continuação) 
 Hood: Semi-automatizado (1986) 
 Venter: Genoma de bactéria usando 
ddNTPs fluorescentes automatizados, 
robóticas e PCR (1995) 
 Perkins-Elmer Corp: Comercializado o 
Sequenciamento totalmente automatizado 
(1999) 
By Diamar 
Considerações 
P 
P 
BN 
A 
C 
G 
T 
U 
OH 
P 
OH OH 
By Diamar 
NTP 
Ribose 
C1 
C2 C3 
C4 
C5 
P 
P 
BN 
A 
C 
G 
T 
OH 
P 
OH OH 
dNTP 
Pentose 
C1 
C2 C3 
C4 
C5 
Ácido ribonucleico Ácido desoxirribonucleico 
O - Necessário 
para ligação 
fosfodiéster 
5’ 3’ 
Polimerização 
ddNTP (Didesoxinucleotídeo) 
By Diamar 
Sequenciamento 
Estuda a integridade da sequência de um DNA 
molde. Analisa diferentes tamanhos de 
fragmentos formados a partir de um primer e da 
inserção randômica de dNTPs (polimeriza) e 
ddNTPs (para a reação) em gel de poliacrilamida. 
ddNTP 
ddNTP 
ddNTP 
Fragmento 1 
Fragmento 2 
Fragmento 3 
Primer 
DNA molde 
dNTP dNTP dNTP 
dNTP 
dNTP dNTP 
DNA polimerase 
A C G T 
A C 
A C G 
T G C A 
Sequenciamento automatizado 
Vídeo do Sequenciamento 
(Cycseqpc) 
By Diamar 
Southern Blotting 
 Edwin M. Southern (1975) 
 Fragmentos de DNA são separados em gel de 
agarose 
 Transferidos para membranas por ação capilar 
 DNA é desnaturado antes ou durante a 
transferência 
 Sonda radioativa de DNA hibrida com o DNA na 
membrana 
 Detecta polimorfismo de DNA ou mutação 
By Diamar 
Southern blot 
By Diamar 
Descrição: 
- Digestão do DNA em teste com enzimas 
de restrição; 
- Resolução dos fragmentos com 
eletroforese em gel de agarose; 
- Transferência do DNA para membrana de 
nylon; 
- Hibridação com uma sonda de DNA ou 
RNA marcada com radioatividade ou 
quimioluminescentes 
Aplicação: Alterações em um único 
nucleotídeos; detecção de inserções, deleções 
e rearranjos; ordenamento de fragmentos do 
DNA em um mapa físico; fragmentos de 
cromossomo. 
 
Com o advento da PCR seu uso tornou-se 
limitado. 
By Diamar 
Southern blot 
46, XY.Síndrome da insensibilidade 
androgênica. Vagina em fundo de 
saco, sem útero ou tubas uterinas. 
1:20.000. Testículos no abdome ou 
canal inguinal (confundidos com 
hérnias, na infância). Defeito 
molecular: varia de deleção 
completa do gene a mutações de 
ponto nos domínios de ligação de 
andrógenos ou ligação ao DNA da 
proteína receptora de andrógeno. 
Sonda de cDNA para o 
gene humano ligado ao X 
de receptor de andrógeno 
hibridando no genoma 
digerido do paciente. 
Exemplo da especificidade das 
sondas. 
Vídeo de Southern blot 
(DNA _DetectivePC) 
Northern blotting 
 Corrida de RNA totais ou mRNA em gel de 
agarose 
 RNAs devem ser desnaturados (formaldeído) 
 Sensibilidade a RNAses 
 Transferência para membrana por ação capilar 
 Sondas de RNA ou DNA para hibridar 
 
 
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Northern blotting 
 (Continuação) 
 Úteis em estudo de expressão gênica 
 Estudo de diferentes tecidos 
 Estuda o padrão temporal de expressão 
de genes durante o crescimento do 
indivíduo 
By Diamar 
By Diamar 
Northern blotting 
Marcadores 
rRNA 
RNAs totais de raízes (R), folhas (L) e flores (F). 
 A – sonda de -tubulina – hibrida todos 
 B - sonda de 1- tubulina – hibrida só flores 
 C - sonda de 3- tubulina – hibrida todos 
 
Western blotting 
 Corrida de proteínas em gel de poliacrilamida 
 Separação e caracterização de proteínas 
 Uso de SDS (sódio dodecil sulfato) para 
desnaturação 
 Transferência para membrana por força elétrica 
 
By Diamar 
Western blotting 
 (continuação) 
 Proteína alvo é identificada por anticorpo mono 
ou policlonal 
 Revelação do sistema com anticorpo secundário 
fluorescente ou radioativo 
 Informa o tamanho e a quantidade das proteínas 
 
 
By Diamar 
Western blotting 
By Diamar 
By Diamar 
Western blotting 
Análise de proteínas por anticorpos específicos após 
eletroforese e transferência para membrana. 
Vídeo Immunoblotting 
(3EIMMBLOT) 
RFLPs 
Polimorfismo dos comprimentos dos 
fragmentos de restrição 
 Uso de enzimas de restrição 
 Produção de fragmentos de DNA de tamanho 
adequados para serem utilizados 
 As Enzimas de restrição são: previsíveis, pouco 
frequentes e clivam fragmentos sítio-específicos de 
DNA 
 Aplicação: compara alelos normais e afetados para 
cada mutação estudada. 
Mapa de Restrição 
By Diamar 
PCR - RFLP 
By Diamar 
By Diamar 
RFLPs 
Polimorfismo dos comprimentos dos 
fragmentos de restrição 
Um caso de erro inato do metabolismo: 
G-6-P-D (glicose-6-fosfato-desidrogenase) 
RFLP de Planta 
DNAs genômico de 
Arabidopis é digerido 
com EcoRI. 
Southern blotting 
com sonda azul e 
verde. 
F1 é heterogênio 
possui fragmentos de 
ambos os genitores. 
F1 autopoliniza: 
1:2:1 Ecotipo 
diferentes: C- 
Colombia, N- 
Niederzenzes e H –
Heterozigoto. 
 
FISH 
Hibridação in situ com fluorescência 
 Detecta DNA localizados dentro de cromossomos 
 Usa lâminas de microscopia 
 Cromossomos estão em metáfase, anáfase e 
interfase 
 Usa sondas de DNA específicas 
By Diamar 
FISH 
(Hibridação in situ com fluorescência) 
Prader-Willi: Imprinting genômico deleção no 
cromossomo 15 paterno. 
By Diamar 
By Diamar 
FISH 
(Hibridação in situ com fluorescência) 
Evolução cromossômica em mamíferos 
Relação evolutiva 
entre cromossomos. 
DNA de gibão 
Hylobates lar 
sondado com DNA 
Humano. 
Setas indicam 
cromossomo 8 do 
gibão. 
Cromossomo 
humano 4 hibrida 
com cromossomo 
(laranja) do macaco 
verde africano. 
SSCP 
Single-strand conformational polymorphism 
Polimorfismo Conformacional da Fita Simples 
 Método baseado na 
mobilidade eletroforética. 
  Gel não desnaturante. 
Protocolo Básico 
 Sensível para 
tamanho e forma da fita 
simples. 
 Detecta a mudança 
de uma base. 
 PCR do gene alvo. 
 DNA desnaturado. 
 (eletroforese) 
 Mobilidade diferente 
da normal indica 
mutação. 
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SSCP 
Single-strand conformational polymorphism 
Polimorfismo Conformacional da Fita Simples 
Microarray – Chip de DNA – 
Microarranjosde DNA 
 Southern blotting em lâmina 
 Chips de genes 
 Pode conter mais de 10.000 sondas oligonucleotídicas 
By Diamar 
 Microdisposição de oligo ou de sondas 
 - Microssíntese de oligos in situ (no chip) 
 - Distribuição de sondas oligonucleotídicas pré 
 fabricadas 
 - Distribuição de fragmentos de DNA ou cDNA 
 Hibridação com mRNA ou cDNA fluorescentes 
 Leitura por scanners 
Microarray – Chip de DNA – 
Microarranjos de DNA 
By Diamar 
By Diamar 
Microarray 
Microarranjos de DNA – Chips de DNA 
 É uma técnica que emprega arranjos (arrays), 
que contêm um grande número de genes 
roboticamente distribuídos de forma ordenada em 
uma placa de vidro. 
Pode comparar a expressão de um grande 
número de gene, simultaneamente. 
 Existem lâminas de 400.000 pontos. 
São feitas com ponteiras de titâneo. 
 Detecção de mutações gênicas e de polimorfismos 
 Detecção de Expressão gênica em diferentes tecidos 
sob condições normais e anormais 
 Sequenciamento do DNA e genotipagem 
Microarray – Chip de DNA – 
Microarranjos de DNA 
 Contras Utilização 
- Técnica cara - Mapear mutações 
- Sensibilidade é reduzida - Oncogenes 
- Lâminas não são reutilizadas - Expressão das vias 
 metabólicas 
- Repetir várias vezes - Regiões regulatórias 
- de genes de levedura 
 
Grande quantidade de - Expressão de genes 
mRNA (2 a 5 µg) anônimos 
 
 - Analisar 10.000 amostras 
 em 12 horas 
Microarray – Chip de DNA – 
Microarranjos de DNA 
Descrição: 
- Hibridação do DNA em 
teste com disposições 
ordenadas de nucleotídeos 
em chip de silicone. 
 
 
Aplicação: 
- Detecção de DNA em 
teste com composição 
conhecida. 
 
By Diamar 
Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA 
By Diamar 
Referências Bibliográficas: 
 MARSHALL, A., and HODGSON, J. 1998. DNA chips: array 
of possibilities. Nature Biotechnology, 16:27-31. 
 MULLINS, K. B. 1990. The unusual origin of polymerase 
chain reaction. Sci. Amer. 262(4): 56-65. 
 SANGER, F., Nickelen, S. And Coulson, A. R. 1977. DNA 
sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. 
Acad. Sci. U.S. 74:5463-5467. 
 SOUTHERN, E.M. 1975. Detection os specific sequences 
among DNA fragments separated by gel eletrophoresis. J. 
Mol. Biol. 98:503-517. 
 
 
By Diamar 
Obrigada!