1ª Prova FMADC Questionário semirrespondido 2018.1

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Disciplina: Ferramentas Moleculares Aplicadas ao Diagnóstico Clínico
Professor: Will de Barros Pita
Aulas: Estrutura/replicação do DNA
Lista de Exercícios Semirrespondida
1) Descreva a natureza química dos nucleotídeos que compõem o DNA e o RNA e a importância da identificação (número) dos carbonos presentes na ribose ou desoxirribose.
 Os nucleotídeos são compostos por base nitrogenada púrica (Adenina ou Guanina) ou pirimídica (Citosina, Timina (DNA) ou Uracila (RNA)), pentose ribose (RNA) ou desoxirribose (DNA) e grupo fosfato. O carbono 2 difere a pentose em ribose ou desoxirribose, pois na ribose ele apresenta hidroxila e na desoxirribose não.
2) Descreva e comente as principais propriedades da molécula de DNA.
O DNA é formado por duas fitas que se complementam formando uma dupla hélice. As bases nitrogenadas estão voltadas para o interior das fitas e elas formam pontes de hidrogênio entre si, o que caracteriza a complementariedade das fitas. Essas pontes de hidrogênio entre as bases se formam porque as fitas de DNA são antiparalelas. Os grupos fosfato estão para o exterior das fitas e eles são os responsáveis por unir um nucleotídeo ao outro. 
3) Descreva o princípio da técnica da FISH e como ela pode ajudar na identificação de alterações cromossômicas.
Se baseia no príncipio da complementariedade das fitas de DNA. Faz-se uma sonda complementar a sua região de interesse e marca-se a sonda com corante fluorescente. O objetivo é o anelamento da sonda com a sequência alvo, para a visualização em microscópio de fluorescência. Detecta sequências específicas de ácidos nucleicos, regiões de microdeleções e rearranjos cromossomais. Detecta aberrações cromossômicas estruturais e numéricas.
4) Quais as vantagens da técnica de FISH em relação às metodologias de bandeamento cromossômico da citogenética clássica.
É uma técnina mais barata, consegue detectar anormalidades numa escala micro, apresenta alta especificidade e sensibilidade, pode ser utilizada para estudar cromossomos de células em metáfase e interfáse e tem uma grande variedade de aplicações dentro de diferentes campos de investigação (análise de danos cromossomais, mapeamento genético, toxicologia molecular, genômica comparativa, biologia evolutiva, ecologia microbiana e diagnóstico de doenças).
5) Descreva o princípio da técnica da aCGH e como ela pode ajudar na identificação de ganho ou perda de material genético.
Se baseia no princípio da complementariedade das bases. Utiliza-se microarranjo de DNA e comparam-se dois genomas diferentes; um controle e outro de teste. As amostras de DNA do controle e do paciente são marcadas com corantes fluorescentes diferentes e são aplicados no microarranjo. As amostras do paciente e do controle competem para se unir ao microarranjo. O que apresentar maior quantidade de material genético vence a competição, é assim que se descobre o ganho ou a perda de material genético. O scanner do microarranjo mede os sinais fluorescentes. O software do computador analisa os dados e gera um gráfico.
6) Imagine um cenário no qual você trabalha em um laboratório de diagnóstico molecular e há a suspeita de uma alteração cromossômica, do tipo translocação recíproca, frequentemente associada à leucemia, em um indivíduo. Você tem à sua disposição no laboratório três metodologias (i) bandeamento G, (ii) FISH e (iii) CGH. Qual técnica você utilizaria para confirmar o diagnóstico? Justifique. 
FISH. Pois a técnica aCGH não faz uma detecção estrutural mas sim quantitativa. A técnica de FISH além de mais barata é mais específica e sensível na detecção desse tipo de alteração estrutural.
7) Imagine um cenário no qual você trabalha em um laboratório de diagnóstico molecular e há a suspeita de que um indivíduo diagnosticado com câncer possua um desbalanço genético. Você tem à sua disposição no laboratório três metodologias, (i) bandeamento G, (ii) FISH e (iii) CGH. Qual técnica você utilizaria para confirmar o diagnóstico? Justifique.
CGH, pois ele é justamente um método que detecta perda ou ganho de material genético de um genoma.
8) O Dogma Central da Biologia Molecular trata do fluxo da informação genética e aborda diversos processos celulares importantes. Comente sobre os modos clássico e especial do Dogma Central e explique sua importância para o controle do metabolismo celular. 
O Dogma Central da Biologia Molecular define o paradigma da biologia molecular, em que a informação é perpetuada através da replicação do DNA e é traduzida através de dois processos: A transcrição que converte a informação do DNA em uma forma mais acessível (uma fita de RNA complementar) e através da tradução que converte a informação contida no RNA em proteínas. 
9) As DNA polimerases são uma classe de enzimas responsáveis pela polimerização (síntese) do DNA e atuam unindo os monômeros que compõem os ácidos nucléicos (nucleotídeos). Por sua importância, esta enzima foi e continua sendo bastante estudada. Uma de suas principais características é a sua lista complexa de exigências para que ocorra a replicação do DNA. Comente sobre as exigências da DNA polimerase durante a replicação do DNA e descreva a base molecular para tais exigências. 
10) Descreva e comente sobre as 3 principais atividades da DNA polimerase, com ênfase na atividade de revisão de erros de polimerização.
A DNA-polimerase não sintetiza outra fita a partir de nucleotídeos livres, ela precisa de um Primer, que é um pedaço de RNA sintetizado por uma RNA polimerase (Primase). Após a síntese do primer de RNA, a DNA polimerase III começa a polimerização no sentido 5’ → 3’. A DNA-polimertase III possui atividade exonucleásica 3’→ 5’, permite que logo após serem adicionados os nucleotídeos sejam retirados e é conferido se o seu pareamento está correto (A com T e C com G). Após a síntese das fitas pela DNA-polimerase III, entra em cena a DNApolimerase I, que retira os primers de RNA e os substitui por nucleotídeos de DNA.
11) A molécula de DNA é composta por duas cadeias de polinucleotídeos dispostas helicoidalmente de forma antiparalela. Esta polaridade oposta traz um problema para a replicação do DNA, uma vez que as DNA pol só conseguem sintetizar DNA no sentido químico 5’-3’. Como este problema é resolvido em nossas células?
A síntese da fita lagging é feita em pequenas partes. O primer de RNA é sintetizado e a fita lagging sofre um “loop” de forma que a polimerização ocorre na mesma direção que ocorre a polimerização da fita leading. Desta forma, a fita complementar à fita lagging é formada em pequenos fragmentos.
12) O que significa PCR no contexto da Biologia Molecular? Descreva o princípio, os objetivos e aplicações desta técnica.
13) A maquinaria proteica responsável pela replicação do DNA in vivo é extremamente complexa e envolve diversos componentes enzimáticos ou não. A PCR consegue mimetizar esse processo dentro de um pequeno tubo. Comente sobre como isso é possível e quais substituições são necessárias para a replicação do DNA in vitro. 
14) Na PCR, os primers fazem mais do que fornecer a 3’-OH necessária para a DNA pol (in vivo). Comente sobre as principais características do primer, sua função adicional na PCR e quais as implicações dessa função extra.
15) Quais as diferenças da PCR convencional e da RT-PCR? Em quais situações a RT-PCR pode ser utilizada? 
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13 de agosto de 2013