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Replicação do DNA REPLICAÇÃO DO DNA Prof. Marisa C. Fonseca C. Ph.D FHA Complementaridade das fitas – replicação – cada filamento pode servir como molde para síntese de um nova cadeia; Especificidade do emparelhamento de bases – apenas uma sequência pode ser especificada por cada molde; Replicação semiconservativa – cada fita original de nucleotídeo permanece intacta (conservada); Implicações do Dupla Hélice na Replicação do DNA Modelos de Replicação Replicação Conservativa Molécula de DNA inteira serve como molde para uma molécula totalmente nova; Molécula original – completamente conservada durante a replicação; Modelos de Replicação Replicação Dispersiva Quebra em fragmentos – modelos – síntese de novos fragmentos de DNA; Remontagem de duas moléculas de DNA completas; DNA resultante – intercalamento de DNA velho e novo; Nenhuma molécula original é conservada; Modelos de Replicação Replicação Semiconservativa Duas fitas de nucleotídeos se afastam e cada uma serve como molde para uma nova molécula de DNA Modelos de Replicação Replicação em Tetha Replicação bidirecional Replicação do Ciclo Rolante Células eucarióticas - muitas moléculas de DNA – muitas origens de replicação; Velocidade - 500 a 5000 nucleotídeos por minuto para cada forquilha; Diversas bolhas de replicação – fusão – formação de suas moléculas de DNA idênticas; Replicação Linear Replicação: Procariotos x Eucariotos Um molde de DNA de fita simples; Substratos para montagem da nova cadeia de nucleotídeo; Enzimas e proteínas que “lêem” o molde e reuni os substratos na molécula de DNA; Requerimentos da Replicação Como acontece a síntese do DNA? Meselson-Stahl experiment • 1957 • Cresceram E. coli em meio com N-15 e depois voltaram pra N-14 • Purificação do DNA das bactérias • Três tipos de DNA – N-15 + N-15 – N-15 + N-14 – N-14 + N-14 • Ao aquecer o N-15 + N-14 e separar as fitas ficava claro que uma fita continha N-15 e outra N-14 Replicação semi-conservativa Origens de replicação • Locais com um contexto de sequência específico • Ligam proteínas específicas • Quando acionadas, essas proteínas permitem o início da replicação Origens de replicação Replicação • DNA Polimerase III • Sentido 5’ → 3’ • Nucleotídeos 3P são adicionados – Liberação de Pirofosfato http://207.207.4.198/pub/flash/24/menu.swf Primase • Ribonucleoproteína • Liga-se à helicase em procariotos formando o chamado primossomo • Sintetiza um primer de RNA contendo aproximadamente 11 bases; fornece 3’ OH • DNA polimerase lenta e sujeita a erros • Evita a progressão da forquilha uma vez que a fita líder anda mais rápido Micrografia, bolha de replicação Forquilhas de replicação Forquilha de replicação Replicação das fitas • Fita líder – Primase age uma vez • Fita retardada – Primase age várias vezes – 1967, Fragmentos de Okasaki Okazaki R, Okazaki T, Sakabe K, Sugimoto K. Mechanism of DNA replication possible discontinuity of DNA chain growth. Jpn J Med Sci Biol. 1967 Jun;20(3):255-60 Primase na fita retardada • Deslocamento da forquilha de replicação • Primase faz primer Direções de replicação na Forquilha Desenovelamento do DNA • Retirada das histonas • Proteínas de ligação a fita simples (SSBPs) • DNA helicase – Quebra pontes de H • DNA topoisomerases – Tiram a tensão Forquilha de replicação Polaridade da síntese define fitas líder e retardada (descontínua) DNA polimerase • Enzimas que catalisa a reação de síntese do DNA • Adiciona nucleotídeos tri- fosfato à extremidades 3’OH livre • Alongamento da cadeia de DNA sempre é feito na direção 5’>3’ (endonuclease 5’>3’) • Incapaz de fazer DNA do zero (precisa ter extremidade 3’OH livre) • Possui mecanismo de correção de erros (exonuclease 3’>5’) Tipos de DNA polimerase • DNA polimerase I – Descoberta em 1956 (Kornberg pai) – Função precisa descoberta apenas em 1969: remove o primer de RNA da fita descontínua • DNA polimerase III – Descoberta em 1970 (Kornberg filho) – Principal enzima que realiza a replicação em procariotos • DNA polimerase II – Lenta, envolvida em reparo do DNA Proteínas presentes na origem de Replicação de E.coli DnaA Reconhece a origem e abre a dupla fita em sítios específicos DnaB (helicase) Desenrola o DNA DnaC Auxilia a ligação de DnaB na origem HU Proteína do tipo histona que estimula a iniciação Primase (DnaG) Sintetiza os primers de RNA Single strand binding (SSB) Liga a fita simples de DNA RNA polimerase Facilita a ação da DnaA DNA girase Alivia a tensão torsional gerada pela abertura da dupla-fita Dam Metilase Metila as sequências GATC na OriC Proteínas presentes na forquilha de Replicação de E.coli SSB Liga a fita simples de DNA DnaB (helicase) Desenrola o DNA Primase (DnaG) Sintetiza os primers de RNA DNA Polimerase III Sintese da fita nova DNA Polimerase I Preenche as lacunas e excisa os primers DNA Ligase Liga os fragmentos DNA girase Superenrolamento Síntese das fitas contínua e descontínua é independente O complexo de replicação DNA Replication • DNA Pol precisa de um molde inicial • Primase: gera um molde de RNA complementar • A DNA Pol III agora é capaz de adicionar bases à extremidade 3’OH Eliminação dos fragmentos de Okasaki DNA Pol I Visão geral Repare na posição do primer de RNA Reparo pela Polimerase • Mecanismo de verificação (Proof-reading) • DNA-polimerase possui – Uma atividade de polimerização 5’→ 3’ – Uma atividade de exonuclease 3’→ 5’ Reparo pela Polimerase • Mecanismo de verificação (Proof-reading) • DNA-polimerase possui – Uma atividade de polimerização 5’→ 3’ – Uma atividade de exonuclease 3’→ 5’ DNA Repair • Checagem de pareamento incorreto (eucariotos) • Proteínas especiais para reparo do erro E as extremidades dos cromossomos? Doenças causadas por problemas no mecanismos de replicação • Ataxia de Friedreich's – dano progressivo no sistema nervoso (problemas musculares, na fala e doenças no coração) – forma mais comum das ataxias herdadas – A seqüência GAATTC se repete, quando existem mais de 40 repetições, o indivíduo apresenta a doença. • Xeroderma pigmentosum – envelhecimento precoce – aumento na incidência de câncer – Falha no mecanismo de reparação do DNA causado pela luz UV Requesitos: Helicase para abertura do DNA; Proteínas de ligação a fita simples – manutenção da separação; Girase – remoção das torções a frente; Primase – síntese de primers com 3’-OH; DNA polimerase – Síntese das fitas leading e lagging; Forquilha de Replicação Algumas moléculas – encontro de duas forquilhas de replicação; Sequências específicas – bloqueiam replicação; Proteína de terminação (Tus em E. coli) – liga-se a sequência – bloqueia a helicase; Terminação Taxa de erro celular – 1 por bilhão de nucleotídeo; Erros pela DNA polimerase – 1 por 100 mil nucleotídeos – (revisão) – atividade exonuclease 3’-5’ - correção do erro; Reparo de mau pareamento –deformidades na estrutura secundária do DNA – reconhecimento enzimático – excisão do par de nucleotídeos; Correção de erros depois da replicação Habilidade de distinção da fita velha da nova - metilação (–CH3) ; Fidelidade da Replicação do DNA Fidelidade da Replicação do DNA Múltiplas origens de replicação em seus cromossomos; Mais tipos de DNA polimerase, com diferente funções; Montagem dos nucleossomos imediatamente após replicação: nucleossomos são quebrados no decorrer da replicação e depois remontados a partir de uma mistura aleatória de histonas novas e antigas Replicação em Eucariotos DNA eucariótico contém muitas origens de replicação; Em cada origem – um complexo de multiproteinas de reconhecimento de origem – se liga e inicia o desenrolamento do DNA; Origens em Eucarióticos DNA Polimerase dos Eucariotos Existem ao menos 13 diferentes DNA polimerases em células eucarióticas. Telômeros - Fita lagging – retirada de primers – gap - ausência de 3’-OH encurtamento; Presença de muitas cópias de pequenas sequências repetidas; Telomerase – enzima que adiciona repetições e permite a extensão; Replicação das Pontas Cromossômicas Replicação das Pontas Cromossômicas Replicação das Pontas Cromossômicas Sempre semiconservativa; Início – sequência chamada origem; Síntese de DNA é iniciada por pequenos segmentos de RNA – primers; Extensão no sentido 5’→3’ O novo DNA é sintetizado de dNTPs; na polimerização do DNA, dois fosfatos são clivados dos dNTPs e o nucleotídeo resultante é adicionado ao grupo 3’-OH da cadeia crescente; Continua na fita leading e descontinua na fita lagging; Novos nucleotídeos são complementares e antiparalelos ao seu molde; Ocorre em taxas muito elevadas e com muita precisão; Regras Básica da Replicação PROCESSO DE REPLICAÇÃO FITA CONTÍNUA (FITA LEADING) – sintetizada continuadamente a partir de um iniciador na fita molde 3’ 5’ FITA DESCONTÍNUA (FITA LAGGING) – sintetizada descontinuadamente a partir de múltiplos iniciadores • Sítios descobertos no molde da fita descontínua são copiados em pequenos iniciadores de RNA pela primase. • Cada iniciador é alongado pela DNA polimerase resultando na formação dos FRAGMENTOS DE OKAZAKI. •DNA polimerase remove o primer do RNA do fragmento adjacente e preenche os “gaps” entre os fragmentos que, então, são unidos pela DNA ligase. AS “BOLHAS DE REPLICAÇÃO” • Ori ou O - Origem de replicação • Nos eucariontes, a replicação requer “múltiplas origens”, devido ao tamanho de seu genoma. A replicação é bidirecional e, em ambas as fitas, simultânea. • Este processo gera “bolhas de replicação”. • Replicação de 6x109 pares de base em 8h. O PROBLEMA DA REPLICAÇÃO DOS TELÔMEROS A SOLUÇÃO PARA REPLICAÇÃO DOS TELÔMEROS COMPACTAÇÃO DO DNA COMPACTAÇÃO DO DNA - NUCLEOSSOMO Cromatina – DNA+Proteínas básicas (Histonas) Nucleossomo – Octâmero de Histonas (2H2A+2H2B+H3+H4) + DNA ~ 140pb Solenóide – 6 nucleossomos COMPACTAÇÃO DO DNA - NUCLEOSSOMO EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO ESTRUTURA E REPLICAÇÃO DO DNA Nome: Turma: Data: 1) Quais os componentes de um nucleotídeo? 2) Quais as diferenças entre a molécula do DNA e RNA? 3) O que significa uma cadeia de ácido núcleico ter uma orientação direção 5’- 3’? 4) Por que num organismo a soma de A+C=T+G? 5) Quais são as vantagens da estrutura do DNA que possibilitam o mesmo ser o “guardião” da informação genética de um organismo? 6) Por que a replicação é semiconservativa? 7) Quais as principais enzimas envolvidas no processo de replicação e quais suas funções? 8) O que são os fragmentos de Okazaki? 9) Como acontece a replicação dos telômeros? Conclusões • Replicação semi-conservativa • Bolha de replicação avança em duas direções • Fita líder e fita retardada • Helicases e topoisomerases desenrolam o DNA • Primase faz o primer • DNA polimerase III, DNA polimerase I • DNA ligase • Telomerase
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