Microscopia e Coloração em Biomedicina

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UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO
BIOMEDICINA
MICROSCOPIA E COLORAÇÃO
SÃO PAULO
2018
UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO
BIOMEDICINA
MICROSCOPIA E COLORAÇÃO
Amanda Okamoto rgm: 1750613-1
Professores: Brunella
SÃO PAULO
2018
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO – MICROSCOPIA
O nome microscópio (mikrós, pequeno, e skoppéoo, observar, ver através de) se deve a Jean Faber, membro da antiga Academia dos Lincei (1624)). Este termo designa um microscópio composto por uma objetiva e uma ocular, embora na prática tenha sido estendido a todos os instrumentos ampliadores simples e compostos.
O microscópio é um instrumento que permite observar os objetos não perceptíveis à vista desarmada. Isso se consegue mediante um sistema óptico composto por lentes de cristal que atravessadas pela imagem do objeto ampliam-na. Segundo o número e a posição das lentes, distinguem-se o microscópio simples (lupa = microscópio estereoscópio) e o microscópio composto.
Denominamos microscópio simples a toda e qualquer lente que com ou sem montagem própria, grande ou pequena, biconvexa ou planoconvexa, amplia os objetos. É comumente chamado de lupa. Existem numerosos modelos e variedades.
Podemos dizer que qualquer lente convergente utilizada de maneira que produza uma imagem virtual, e portanto, direta, e maior que o objeto é um microscópio simples. As lupas somente se diferenciam na montagem. Seu manejo é muito simples, e consiste praticamente em orientar a lente de modo que sua face plana ou menos curva fique voltada para o objeto e colocá-la a uma distância tal que este ( o objeto ) fique situado entre o foco e o vértice e tanto mais próximo daquela quanto maior se queira a imagem.
O microscópio composto é constituído pela combinação de dois sistemas de lentes
Convergentes: um próximo do olho do observador, motivo pelo qual é chamado sistema de oculares, e que age como microscópio simples; outro, próximo do objeto denominado sistema de objetivas. Este é o verdadeiro microscópio, que estamos acostumados a ver em todos os laboratórios.
Com os modelos simples é possível obter bons aumentos e realizar excelentes observações pois, salvo para estudos muito especializados, que requerem grandes aumentos, um microscópio comum nos será suficiente para passar horas muito agradáveis e nos permitirá observar qualquer classe de materiais. Salientemos que, por muitas e variadas que sejam suas lentes, qualquer que seja sua potência, o princípio é sempre o mesmo: é suficiente colocar a objetiva de modo que o objeto fique colocado um pouco além do foco principal da lente, mas o mais próximo possível dele, para que a imagem formada seja real e a maior possível ( imagem intermediária).
Dispondo a ocular de maneira que a imagem real obtida pela objetiva fique situada entre o vértice e o foco da ocular, obter-se-á uma imagem virtual direta e maior do que a primeira. Observar-se-á pois, uma imagem do objeto virtual invertida e sumamente aumentada.
Quanto maiores forem as curvaturas das lentes e a distâncias entre o sistema de objetivas e o sistema de oculares maior será o aumento total.
Vimos, por conseguinte, que o microscópio composto possui dois sistemas de ampliação, o de oculares e o de objetivas. Para calcular o aumento total de um microscópio teremos, pois, que multiplicar o aumento próprio da objetiva pelo aumento da ocular.
Ocular: é uma lupa. As mais simples possui no seu interior duas lentes e um diafragma. No interior da ocular temos então: lente de campo, diafragma e a ocular propriamente dita.
Objetivas: são formadas internamente por várias lentes. As resoluções alcançadas e a maior parte da qualidade da imagem final dependem das lentes objetivas.
COLORAÇÃO
A finalidade da coloração é dar cor a diferentes estruturas que compõem os tecidos. Podem ser usadas substâncias que coram de forma difusa as estruturas (colorações difusas), ou que as coram selectivamente (colorações selectivas).Os corantes são compostos orgânicos derivados de compostos cíclicos aromáticos (dado apresentarem elevada capacidade de deslocalização electrónica) e a sua associação a moléculas maiores – cromogéneos – leva a transições electrónicas que originam cor.
 A porção do cromóforo que é responsável pela propriedade da cor é o cromóforo. Os auxocromos, também presentes nos corantes, são grupos substituintes que têm a capacidade de ligar o cromogéneo à substância a ser corada, podendo ser estes grupos amina, átomos de azoto quaternários, grupos ácido sulfónico e grupos carboxilo.
Muitas vezes é necessária a intervenção de uma substância que ligue o corante à estrutura a corar – mordente.
Por vezes, as propriedades espectrais do corante, quando se apresenta em grande concentração de moléculas agregadas, são diferentes daquelas que têm quando monoméricos, resultando na propriedade designada por metacromasia.
Designam-se por fluorocromos aqueles que, excitados por radiação de um determinado comprimento de onda, emitem luz com outro comprimento de onda.
Um corante vital é aquele que é utilizado em células e organismos vivos, dependendo o resultado da coloração das propriedades bioquímicas e da activação fisiológica destas células e organismos.
As colorações progressivas são aquelas em que o tecido alvo é imerso na solução corante até se obter a intensidade de coloração desejada. As colorações regressivas caracterizam-se por, numa fase inicial, todas as estruturas do tecido serem coradas de uma forma intensa; esta coloração é posteriormente removida das estruturas que não se pretendem corar, por perda selectiva do corante, através da sua extração com um solvente.
Os corantes básicos são aqueles cuja propriedade corante é devida ao composto básico da sua molécula e ligam-se preferencialmente à cromatina e às proteínas nucleares. As estruturas que se ligam a estes corantes são denominadas de basófilas. Os corantes ácidos devem conter na sua composição grupos ácidos (aniões). Têm uma afinidade particular para o citoplasma das células e substâncias essenciais, sendo assim denominadas de acidófilas. Os corantes neutros correspondem a compostos cujas propriedades são devidas aos dois compostos das suas moléculas (o ácido e o básico). os seus componentes dissossiam-se quando em contacto com os tecidos e os seus compostos ácidos e básicos associam-se, respectivamente, a componentes celulares acidófilose basófilos. Os corantes indiferentes não possuem grupos capazes de formar sais; são em geral insolúveis em água, mas solúveis em solventes orgânicos.
2. OBJETIVO
Descrever as funcionalidades e tipos de microscópico e técnicas de coloração.
3. TIPOS DE OBJETIVAS
1. Acromáticas – são a mais simples. São aquelas sem nenhuma sofisticação, que os microscópios comuns possuem.
2. Semi-apocromática – são também chamadas de fluorita, porque este material entra na sua constituição, dando alguma correção para as aberrações.
3. Apocromáticas – possuem correção ampla. Abrangem todo o espectro.
4. Planapocromática – possui imersão, com aumento de 63 X e abertura numérica de 1,4. Com ela se consegue o máximo de resolução de um microscópio óptico.
Objetivas de imersão: são objetivas de maior aumento um que se utiliza óleo de imersão para aproveitar toda a abertura numérica da lente. O óleo possui índice de refração tal que impede que os raios luminosos sofram reflexão ao passar do material para o ar contido entre a lamínula e a objetiva.
Condensador: é formado por várias lentes internas. Tem por finalidade concentrar a de modo que a objetiva receba um cone cheio de luz. É regulado pelo diafragma de abertura.
4. TIPOS DE MICROSCÓPICOS
MICROSCÓPICO OPTICO
Os microscópios ópticos são instrumentos projetados para produzir imagens visuais ou fotográficas ampliadas de pequenosobjetos. O equipamento deve realizar três tarefas: produzir uma imagem ampliada, separar os detalhes na imagem e tornar os detalhes visíveis para o olho humano ou para uma câmera. Inclui não só dispositivos de múltiplas lentes com objetivas e condensadores, mas também equipamentos de lentes únicas, geralmente manuais, como as lupas.
Todas as partes de um microscópio funcionam juntas. A luz passa através da abertura pela lâmina e lente objetiva, onde a imagem da amostra é ampliada. Esta percorre o tubo do microscópio até a lente ocular, que amplifica ainda mais a imagem para o visualizador.
Há duas divisões que podem ser colocadas para o estudo do microscópio óptico. Como o próprio nome diz, ele é composto por uma parte óptica, formada por três sistemas de lentes (objetivas, ocular e condensador), pelo diafragma e por uma fonte de incidência de luz. É composto também por uma parte mecânica, que garante o suporte para a visualização.
A visualização no microscópio se dá da seguinte forma: o condensador é responsável pelo ajuste de luminosidade e pela projeção de um cone de luz em um espelho, passando pela lâmina até que chegue às objetivas. O microscópio óptico possui objetivas de 4, 10, 40 e 100, que proporcionam uma visão panorâmica de aumento aproximado de 40x, 100x, 400x e 1000x, respectivamente, sendo que para a visualização de estruturas com aumento de 1000x é necessária utilização de óleo de imersão para que a lâmina não seja danificada. Nas lentes objetivas a imagem é ajustada pelo seu limiar de resolução, que proporciona uma maior riqueza de detalhes; e logo é projetada às lentes oculares, que farão novamente o aumento da imagem, finalizando o processo de visualização.
Por fim, parte mecânica do microscópio é composta pela seguintes estruturas: base, braço, revólver (que permite a troca da objetiva a ser utilizada), platina (haste metálica onde é inserida a lâmina), charriot (possibilita o movimento da platina para melhor focalização da lâmina), canhão ou tubo (onde se localizam as lentes oculares), e parafusos micrômetro e macrômetro (responsáveis pela focalização)
MICROSCOPIA ELETRÔNICA
A relação entre o limite de resolução e o comprimento de onda de uma radiação luminosa é verdadeiro para qualquer forma de radiação , seja ela um feixe de luz ou de elétrons. Com elétrons entretanto , o limite de resolução pode ser muito pequeno. O comprimento de onda de um elétron diminui com o aumento da sua velocidade. Em um microscópio eletrónico , com uma voltagem de aceleração de 100.000 V , o comprimento de onda de um elétron é 0,004 nm .Teoricamente , a resolução de tal microscópio seria cerca de 0,002 nm , que é 10.000 vezes maior do que a do microscópio ótico.
Entretanto , devido ao fato das aberrações de uma lente de elétrons serem mais difíceis de se corrigir do que aquelas produzidas por uma lente de vidro, o poder de resolução da maioria dos mais modernos microscópios eletrônicos é, nas melhores condições, 0,1 nm. Ainda mais, problemas na preparação da amostra, contraste e danos causados pela radiação limitam, efetivamente, a resolução normal para materiais biológicos para 2 nm. Contudo, este valor é cerca de 100 vezes melhor do que a resolução do microscópio óptico .
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO (TEM)
O microscópio eletrônico de transmissão é semelhante ao microscópio óptico, a pesar de muito maior e invertido. A fonte de iluminação é um filamento ou cátodo que emite elétrons do topo de uma coluna cilíndrica de cerca de 2 metros de altura. Sendo os elétrons espalhados através de colisão com as moléculas de ar, primeiramente o ar tem que ser bombeado para fora da coluna para criar vácuo. Os elétrons são então acelerados a partir do filamento por um ânodo e atravessam um pequeno orifício formando um feixe de elétrons que desce pela coluna. Bobinas magnéticas, colocadas ao longo da coluna, convergem o feixe de elétrons assim como as lentes de vidro convergem a luz em um microscópio óptico.
A amostra é colocada no vácuo, através de uma câmara de compressão, na trajetória do feixe de elétrons. Como para o microscópio óptico a amostra é usualmente corada, neste caso, com material denso ao elétron, como veremos na próxima seção. Alguns dos elétrons que atravessam a amostra são espalhados pelas estruturas coradas com material denso aos elétrons o restante é convergido para formar uma imagem de forma análoga ao processo de formação de uma imagem no microscópio óptico em uma placa fotográfica ou em uma tela fosforescente. Devido ao fato de os elétrons disperso se desviarem do feixe, as regiões densas da amostra são destacadas como áreas de fluxo reduzido de elétrons, as quais se mostram escuras.
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE VARREDURA
O SEM - Microscópio Eletrônico de Varredura - utiliza os elétrons que são emitidos da superfície de amostra. A amostra a ser examinada é fixada, desidratada e coberta com uma camada fina de metal pesado. A amostra é varrida por um feixe de elétrons. O trajeto do feixe de elétrons é, em seguida, modificado por um conjunto de bobinas refletoras que o fazem percorrer o espécimen ponto a ponto e ao longo de linhas paralelas (VARREDURA). Ao atingirem o espécimen, os elétrons causam diversos efeitos. Emitem elétrons secundários que são colhidos pelo coletor, passam por um sistema de amplificação e são transformados em pontos de mais ou menos luminosidade. As micrografias são obtidas por fotografia da imagem na tela.
UTILIZAÇÃO:
Obter imagens tridimensionais de superfícies.
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE CRIOFRATURA
As células são congeladas à temperatura do nitrogênio líquido (-196C) e depois fraturado com uma lâmina de bisturi. O corte do plano da fratura tenta mostrar o interior da membrana celular.
UTILIZAÇÃO:
Possibilita uma forma de visualização do lado interno das membranas celulares.
MICROSCOPIA CRIOELETRÔNICA
Uma camada muito fina ( ~ 100 nm ) de uma amostra hidratada rapidamente congelada. Um prendedor de amostra e necessário para manter esta amostra hidratada a -160C no vácuo do microscópio, onde esta pode ser observada diretamente, sem fixação, coloração ou secagem.
UTILIZAÇÃO:
Visão de estruturas internas tridimensionais de vírus por exemplo.
COMPONENTES DO MICROSCÓPICO 
Lente ocular → lente que o visualizador examina para ver a amostra. A ocular geralmente contém um aumento de 10x ou 15x.
Ajuste de dioptria → ferramenta útil para mudar o foco da ocular e corrigir qualquer diferença de visão entre os dois olhos.
Tubo → parte que conecta a ocular às lentes objetivas.
Estativa, braço ou coluna → parte que conecta o tubo à base do microscópio.
Dispositivo macrométrico → estabelece um foco geral para a amostra analisada.
Dispositivo micrométrico → estabelece um foco mais preciso e aumenta o detalhe da amostra analisada.
Revólver → torre rotativa que contém as lentes objetivas. O visualizador gira para selecionar diferentes lentes objetivas.
Lentes objetivas → lentes mais importantes de um microscópio óptico, com aumento de 4x até 100x.
Mesa ou Platina → plataforma plana onde a lâmina é colocada.
Pinça → parte metálica que mantém a lâmina presa.
 Charriot → botões que movem a platina para a esquerda e direita ou para cima e para baixo.
 Interruptor → chave na base do microscópio que liga ou desliga o iluminador.
Iluminação → fonte de luz para um microscópio, geralmente uma lâmpada de baixa voltagem.
Diafragma → ajusta a quantidade de luz que atinge a amostra analisada.
 Condensador → reúne e concentra a luz do iluminador sobre a amostra que está sendo visualizada.
Base → parte que suporta o microscópio e onde a fonte de iluminação está localizada.
TÉCNICAS DE COLORAÇÃO
histológica
Como a maioria dos tecidos é incolor, para que seja possível observá-los ao microscópio de luz, é necessário que sejam empregados corantes. Diferentes técnicas que não somente evidenciam os componentes teciduais, mas também os distinguem entre si. As técnicasde colorações, de um modo geral, se efetuam por processos físico-químicos ou puramente físicos e variam conforme a modalidade, ação, caráter, grau de ação, tempo, número de corantes e a cromatização. 
Antes que o corte seja corado, a parafina em que ele foi incluído deve ser removida (desparafinização). O corte, que já foi aderido à lâmina de vidro por ‘pescagem’ em banho-maria, é banhado no xilol para dissolver a parafina. Devido ao fato de muitos corantes serem solúveis em água, torna-se necessário remover o xilol do tecido e substituí-lo por água (hidratação). O corte é imerso em uma série de concentrações decrescentes de álcool etílico (álcool mais concentrado → álcool menos concentrado), até que esteja hidratado. Depois que o corte estiver hidratado, procede-se á coloração propriamente dita.
 De acordo com o número de cores conferidas às estruturas teciduais pelas colorações simples (um único corante) ou combinadas (que usam mais de um corante), estas recebem a denominação de colorações monocrômicas (uma cor), bicrômicas (duas cores), tricrômicas (três cores) ou ainda policrômicas (mais de três cores).A maioria dos corantes se comporta como substâncias ácidas ou básicas, formando sais (ligações eletrostáticas) com radicais ionizados que estejam presentes nos componentes teciduais. Seguindo este princípio, os componentes teciduais que se coram melhor com corantes básicos, são denominados basófilos, e os que se coram com corantes ácidos, por sua vez, denominam-se acidófilos.
Os constituintes celulares que reagem com os corantes básicos o fazem principalmente por meio de ácidos nucléicos, glicoproteínas ácidas e glicosaminoglicanas. Já os corantes básicos reagem principalmente com proteínas citoplasmáticas, grânulos citoplasmáticos, mitocôndrias e colágeno. 
Para se colorir convenientemente a célula, deve-se recorrer a um método de coloração sucessiva do núcleo e do citoplasma. A combinação mais comum de corantes usada em histologia e histopatologia é a hematoxilina e eosina (HE). A hematoxilina é um corante natural obtido das cascas de pau Campeche. Ela não é realmente um corante e deve ser oxidada em hemateína a fim de tornar-se um corante. Ademais, o corante que resulta (hematoxilina-hemateína) não tem afinidade para os tecidos. Deve ser usado um mordente, como o alumínio ou o ferro, juntamente com a mistura de hematoxilina antes que ela possa corar os tecidos. A mistura cora em azul-púrpura. A eosina é um corante sintético e produz uma coloração avermelhada.
Nas células coradas com HE, os ácidos nucléicos presentes no núcleo são corados pela hematoxilina, corante básico, dando ao núcleo um tom azul-arroxeado. A eosina, por sua vez, um corante ácido, é atraída pelos elementos básicos das proteínas do citoplasma da célula, corando-os de róseo a vermelho. 
Certos corantes reagem com os componentes do tecido e os coram com uma cor diferente da cor da solução corante. A propriedade de mudança de cor do corante chama-se metracromasia. Os corantes azul-de-metileno, azul-de-toluidina e tionina são exemplos de corantes simples que exibem metacromasia. Nos corantes azul as cores mudam para vermelho.
A coloração dos mastócitos com o azul-de-metileno constitui um bom exemplo. Os grânulos do citoplasma coram-se em vermelho-púrpura, enquanto que o resto do tecido fica azul. A causa da metacromasia não é totalmente compreendida, porém tem sido sugerido que é devido à polimerização das moléculas do corante, por meio de reação com enzimas ou outras moléculas teciduais. Julga-se que a presença de macromoléculas com radicais eletronegativos no tecido facilita a polimerização e provoca a mudança de cor.
MICROBIOLOGIA
O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem.A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia e de análises clínicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos. Essa informação permite ao clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis. É possível a análise de vários esfregaços por lâmina, o que facilita a comparação de espécimes clínicos. As lâminas podem ser montadas de forma permanente e preservadas como documentação.
HEMATOLOGIA
O método de preparação para demonstrar melhor os tipos celulares do sangue periférico é o esfregaço de sangue. Uma gota de sangue é colocada diretamente sobre uma lâmina de vidro e espalhada em uma camada fina pela sua superfície. Isso é obtido espalhando-se a gota de sangue com a borda de uma lâmina histológica ao longo de outra lâmina, com o objetivo de produzir uma monocamada de células.
É necessário esfregar uma lâmina sobre a outra rapidamente, antes que o sangue seque ou coagule. Uma pressão excessiva ou qualquer movimento de parada durante esse processo pode comprometer o esfregaço.
É importante lembrar também que a espessura da película é determinada, em grande parte, pelo ângulo formado entre as lâminas no momento da extensão da gota de sangue.
Ângulos maiores que 45°, por exemplo, produzem extensões espessas e curtas, dificultando posteriormente a visualização das células.A mistura de corantes inclui um corante básico e um corante ácido, consistindo basicamente em azul de metileno e eosina Y (ou similar).A afinidade das estruturas celulares por corantes específicos ou por combinações de corantes dessa mistura proporciona uma visualização diferenciada das células sanguíneas.
7. TIPOS DE COLORAÇÃO
Coloração simples - Cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis.
Coloração diferencial - Nessa coloração o corante reage diferentemente com diferentes tipos de bactérias. A coloração de Gram e a álcool - ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais.
Coloração especial - São aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos, flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas. No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. Essas substâncias são chamadas mordentes, e é o caso do iodo na coloração de Gram. Outra função do mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração.
8. CORANTES
AZUL DE METILENO
É um composto é usado como corante para um grande número de diferentes procedimentos de coloração, tais como as colorações de Gram, Wright, e Jenner. Desde que ele é uma técnica de coloração temporária, azul de metileno pode também ser usado para examinarRNA ou DNA sob o microscópio ou em um gel: como um exemplo, uma solução de azul de metileno pode ser usada para colorir RNA sobre membranas de hibridização na técnica de Northern blot para verificar a quantidade de ácido nucleico presente. Quando azul de metileno não é sensível como brometo de etídio, é menos tóxico e não intercala-se em cadeias do ácido nucleico, assim evitando a interferência com a retenção do ácido nucleico nas membranas de hibridização ou com o próprio processo de hibridização. Pode também ser usado como um indicador para determinar se uma célula tal como uma levedura está viva ou não. O azul de metileno torna-se incolor na presença de enzimas ativas, então indicando células vivas. Entretanto se permanecer azul não significa que a célula está inoperante – as enzimas poderiam estar inativas/denaturadas. Deve-se notar que o azul de metileno pode inibir a respiração do levedura enquantodesloca os íons de hidrogênio produzidos durante o processo. A célula da levedura não pode então usar aqueles íons para liberar energia.
PANÓTICO
Pan-óptico é um tipo de corante utilizado em análises laboratoriais com a finalidade de se obter resultados de forma mais rápida. É muito utilizado pelos analistas clínicos em exames hematológicos pois possibilita a visualização de lobos nucleares dos leucócitos, permitindo a distinção entre seus tipos diferentes. Dessa forma, também permite estabelecer a diferenciação entre os leucócitos e hemácias.
LUGOL
Em microbiologia, é empregado na coloração de Gram para reter o colorante violeta cristal. O I2 entra nas células e forma um complexo insolúvel em solução aquosa com o violeta cristal. Existe nesta aplicação, variação da formulação, chamada de Lugol de Gram. O lugol permite a formação de complexos CVI (Cristal Violeta Iodo) insolúveis em água
9. REFERÊNCIAS
http://www.biomedicinaemacao.com.br/2012/02/microscopia-optica.html
http://www.biomedicinabrasil.com/2017/12/o-microscopio-optico-e-seus-componentes.html
https://monografias.brasilescola.uol.com.br/medicina/microscopio.htm
https://www.portaleducacao.com.br/conteudo/artigos/idiomas/preparacao-de-lamina-histologica-coloracao/31094
http://www.ebah.com.br/content/ABAAAfuwMAD/microbiologia-ii-coloracoes
http://www.kasvi.com.br/esfregaco-de-sangue-hematologia/
http://maesquecuidamg6pd.com.br/index.php/2017/01/31/azul-de-metileno-voce-sabe-pra-que-serve/