Cianobactérias e o grande evento de oxidação: evidências de genes e fósseis

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CIANOBACTERIA E A GRANDE OXIDAÇÃO: EVIDÊNCIA DE GENES E FÓSSEIS
Resumo
As cianobactérias estão entre as mais antigas linhagens evolutivas, esses seres fotossintetizantes oxigenados podem ter se originado antes de 3,0 Ga (?), como evidenciado pelos níveis de oxigênio livres. Durante todo o período pré-cambriano, as cianobactérias foram um dos fatores mais importantes das inovações biológicas, impactando fortemente os primeiros ambientes da Terra. No final do Eon Arqueano, foram responsáveis ​​pela rápida oxidação da atmosfera da Terra durante um episódio referido como o Grande Evento de Oxidação (GOE). No entanto, pouco se sabe sobre a origem e diversidade dos taxas de cianobactérias precoces (precoce = antes da hora u precoce = antigo/ancestral?) , devido a: 
a escassez de depósitos fósseis pré-cambrianos;
características limitadas para a identificação de táxons; 
a pobre preservação de microfósseis antigos. 
Estudos anteriores baseados em 16S rRNA sugeriram que a origem da multicelularidade em cianobactérias pode ter sido associada ao GOE. No entanto, análises de genes únicos têm limitações, ainda mais em ramos profundos. Nós reconstruímos a história evolucionária de cianobactérias usando dados de escala de genoma e reavaliamos o registro fóssil pré-cambriano para obter mais calibrações prévias para uma análise de relógio relaxada (certeza que a tradução dessa última palavra não tem nada a ver). Para as reconstruções filogenômicas, identificamos 756 seqüências de genes conservados em 65 taxa de cianobactérias, das quais oito genomas foram seqüenciados neste estudo. Reconstruções de estado de caráter baseadas em máxima verossimilhança e eminência filogenética bayesiana(han?) confirmam achados prévios de uma ancestral linhagem cianobacteriana multicelular ancestral à maioria das cianobactérias modernas. Análises de relógio relaxadas (sem sentido esse relogi relaxada) fornecem suporte firme para uma origem de cianobactérias no arqueano e uma transição para multicelularidade antes do GOE. É provável que a multicelularidade tenha um impacto maior na adequação da cianobactéria e, portanto, na abundância, do que se supunha anteriormente. A multicelularidade, como uma grande inovação evolucionária, formando uma nova unidade para a seleção de atuar, pode ter servido para superar os obstáculos evolutivos e possibilitou a diversificação da variedade de morfotipos vistos em cianobactérias hoje. 
Palavras-chave: vida precoce, estimativa do tempo de divergência, genômica, atmosfera, grande transição.
Cianobactérias, eubactérias oxifototróficas (isso quer dizer autotróficas? Ali embaixo fala que elas tem estilo de vida autotrófico), estão entre os organismos mais importantes e influentes na evolução de uma Terra aeróbia no Pré-Cambriano (Rippka et al.1979; Castenholz 2001). As cianobactérias são os únicos organismos nos quais a fotossíntese oxigenica evoluiu - característica obtida por outros organismos, tais como plantas e algas, através de endossimbiose com cianobactérias, resultando na formação de cloroplastos (Sagan 1967). Durante o Proterozóico inicial, 2,5-2,3 Ga (talvez esse G.A seja M.A – milhões de anos) , os níveis atmosféricos de oxigênio acumularam rapidamente durante um evento episódico de Grande Oxidação (GOE) Bekker et al.2004; Anbar et al. 2007) como resultado da atividade cianobacteriana levando a grandes mudanças no sistema da Terra (Van Kranendonk et al. 2012), permitindo posteriormente o surgimento evolutivo da vida complexa como a conhecemos. O estilo de vida autotrófico das cianobactérias permitiram-lhes conquistar uma variedade de habitats, incluindo ambientes marinhos, limícolas (deve ser dulciculoas, de água doce ) e do solo, variando em larga escala de temperaturas, desde regiões árticas até fontes termais. Além de sua variedade ecológica, as cianobactérias exibem uma diversidade morfológica impressiva (impressionante?), particularmente para os procariontes. Nessa base, as cianobactérias foram classificadas e divididas em cinco subseções (Rippka et al., 1979; Casten-holz, 2001). Embora não seja confirmado por dados moleculares, esse sistema taxonômico ainda se mostra útil para a classificação de cianobactérias. 
As subseções I e II compreendem cianobactérias unicelulares; subseção I cyanobacter ia (por exemplo, Synechococcus, Synechocystis) reproduzem-se via fi (divisão binária?) a binária ou brotamento (por exemplo, Chamaesiphon); A subseção II de cianobactérias produz uma rápida divisão de uma célula “mãe” vegetativa em células esféricas menores chamadas “baeocistos” (Rippkaet al. 1979); 
As subseções III a V incluem cianobactérias filamentosas com níveis variados de complexidade multicelular. A reprodução nesses táxons ocorre por ruptura do filamento (tricoma) e formação de filamentos móveis de curta duração denominados "hormogonia". Enquanto a subseção III cy-anobactéria cresce unineato (largura de uma célula), filamentos unidirecionais em um plano; 
As bactérias nas subseções IV e V têm a capacidade de formar células diferenciadas, como heterocistos metabolicamente especializados para fixação de nitrogênio e células em repouso, chamados akinetes (Flores e Herrero2010);
As taxas pertencentes à subseção V são as únicas cianobactérias que crescem em filamentos multiseriados (variando a largura da célula) e em vários planos exibem ramificações "verdadeiras", não sendo confundidas com ramificações "falsas" (Rippka et al. 1979; Gugger e Hoffmann 2004).
 Essa variedade de formas permite uma identificação bastante confiável de parentes cianobacterianos no registro fóssil comparado a outros procariontes. As cianobactérias fósseis de todas as subseções foram encontradas em depósitos mesoproterozoícos (Schopf e Blacic, 1971; Horodyski e Don-aldson, 1980; Butterfield, 2000). Cianobactérias pertencentes às subseções I e III foram identificadas no início do proterozóico, incluindo a 1.8 Ga Duck Creek Dolomite na Austrália (Knoll et al. 1988) e 1.9 Ga Belcher Super-group no Canadá (Hofmann 1976). Além disso, 2,0 células em repouso fossilizadas (presentes nas subseções IV e V), denominadas "Archaeoellipsoides", assemelham-se a akinetes do gênero de cianobactérias da subseção IV moderna Anabaena (Amard e Bertrand-Sarfati, 1997). O surgimento de fósseis de cianobactérias atribuídos às subseções IV e V cianobactérias ocorre após o GOE, apoiando a hipótese de que a formação de eritrócitos evoluiu após o aumento do oxigênio atmosférico para permitir a fixação de nitrogênio espacialmente separado da fotossíntese (Tomitani et al. 2006). Diversidade de taxa de cianobactérias logo após o GOE indica uma origem de ancestrais cianobacterianos em algum tempo no Arqueano. No entanto, após o debate em torno de fósseis semelhantes a cianobactérias de 3,5-Gyr (Schopf 1993; Brasier et al.2002; Schopf e Kudryavtsev 2009) e a identificação errônea de biomarcadores de cianobactérias de 2,7-Gir (Brockset al. 1999; Rasmussen et al. al. 2008), a existência de cianobactérias arquianas tem sido questionada. 
 Embora muitos vestígios fósseis multicelulares do Arqueano e Proterozóico (Altermann e Schopf 1995; Schopf 2006) tenham sido interpretados como cianobactérias, o registro fóssil geral é, na melhor das hipóteses, desigual e fornece apenas vislumbres da história desses primeiros procariotos. No entanto, a combinação de filogenômica molecular com dados paleontológicos existentes para aproximar a evolução dos procariontes no Pré-Cambriano permite avaliar a co-evolução da vida e da Terra e nos ajuda a resolver questões relativas à origem da vida complexa hoje. Hipóteses concorrentes atuais que tentam explicar a origem das cianobactérias incluem:
uma origem de cianobactérias imediatamente seguida pelo GOE (Kirsch-vink e Kopp 2008); 
uma origem muito anterior das cianobactérias, baseada na acumulação de oxigênio, pelo menos temporária, nos oceanos e na atmosfera da Terra, em torno de c. 2,8-3,0 Ga (Crowe et al. 2013; Lyons et al. 2014). 
Essas hipóteses,no entanto, ignoram a possibilidade de inovações evolutivas que poderiam ter influenciado a adequação e, portanto, a abundância de cianobactérias. Inovações revolucionárias em cianobactérias poderiam ter desencadeado a rápida oxigenação durante o GOE? Estudos prévios levantaram a hipótese de que a origem da multicianularidade, as incianobactérias, poderia estar causalmente associada ao GOE (Schirrmeister et al. 2013). Nos procariontes heterotróficos, as taxas metabólicas aumentaram superlinearmente com a massa corporal (DeLong et al. 2010). A tomulticelularidade (essa palavra existe mesmo ou tá errada?) de transição com seu aumento no tamanho total poderia ter um efeito semelhante em cianobactérias. Infelizmente, tentativas de resolver a história evolutiva da vida precoce usando abordagens filogenéticas moleculares chegaram a conclusões contraditórias devido à falta de dados e fraquezas na metodologia (Schirrmeister et al. .2013; Shih e Matzke 2013). 
As dificuldades em obter estimativas de idade exata para tais eventos de especiação profunda podem incluir: 
a falta de informações evolutivas retidas em dados moleculares em escalas de tempo tão longas; 
fraquezas no modelo filogenético para inferir corretamente os processos evolutivos que ocorreram durante esses longos períodos de tempo; 
a escassez de pontos de calibração para a estimativa do tempo de divergência.
 Outras dificuldades de calibração envolvem: 
o potencial de sua má atribuição se articular; 
a probabilidade de que a idade dos fósseis de calibração seja uma aproximação pobre da idade do clado. 
Embora o fator limitante da precisão em estudos de tempo de divergência seja invariavelmente a incerteza associada às calibrações fósseis (dos Reis e Yang 2013), em termos do grau em que os mínimos fósseis se aproximam do tempo real de divergência, grande parte da incerteza associada à fitogenia e tempo de divergência a estimativa pode ser diminuída utilizando dados da escala do genoma (dos Reis et al., 2012).
 Neste estudo, pretendemos:
fornecer estimativas de idade mais confiáveis ​​para a história evolutiva de cianobactérias, com base em um grande conjunto de dados envolvendo 756 proteínas altamente conservadas (197 761 aminoácidos);
comparar os achados fósseis de Precam-brian com as cianobactérias modernas, a fim de identificar melhorias nos anteriores. 
A amostragem de taxa cianobacteriana para análises filogenéticas foi baseada em uma árvore filogenética rica em taxa de 1220 publicada anteriormente (Schirrmeister et al., 2011a). Somando-se a um conjunto existente de genomas recentemente obtidos no quadro da representação do filo de cianobactérias impulsionada pela diversidade (Dagan et al.2013; Shih et al. 2013), sequenciamos oito genomas adicionais de cianobactérias. Testamos hipóteses estabelecidas de relações entre estas espécies através de análises filogenéticas de máxima likel-hood. 
A árvore resultante formou a base para análises subsequentes que objetivaram reconstruir estados de caráter multicelulares e estimar as divergências, usando um relógio molecular relaxado.
 Os resultados filogenómicos mostram um aumento do suporte das árvores em comparação com as análises de um único gene e confirmam sugestões prévias de celulite multidimensional precoce em cianobactérias (Schirrmeister et al. 2013).
MATERIAL E MÉTODO 
Amostragem por Saxon
Os genomas cianobacterianos incluídos nos estudos filogenéticos foram escolhidos de modo que representantes de todas as pesquisas foram utilizados e toda a diversidade molecular deste filo foi coberta (Schirrmeister et al.2011a, b). Grupos anteriormente sobreamostrados para análises genomiográficas, tais como picocianobactérias marinhas (Synechococcus e Prochlorococcus), foram amostrados, de modo que a árvore apresentada retratasse a disparidade filogenética conhecida do filo como dados de 16S rRNA recuperados. A análise filogenética incluiu dados genômicos de 27 taxa unicelulares (seção I e II) e 38 multicelulares (seção III a V) (Tabela S1). Após a comparação das fitogenias 16S rRNA e dos estudos filogenômicos (Schirrmeister et al.2011b; Shih et al. 2013), oito amostras adicionais de cianobactéria foram analisadas para seqüenciamento do genoma para investigar a divisão precoce dos taxa de cianobactérias multicelulares e para avaliar a polifilia sugerida da subseção II. cianobactéria. 
As cepas representaram o Synecho-cystis sp unicelular. PCC 9635, o unicelular e baeocistousChroococcidiopsis sp. PCC 8201 e cinco cepas multicelulares pertencentes às cianobactérias filamentosas sem diferenciação celular:
Geitlerinema sp. PCC8501; 
Leptolyngbya sp. PCC 73110; 
Limnothrixredekei PCC 9416;
Pseudanabaena sp. PCC 7704 e PCC 7904; 
Symploca sp. PCC 8002) .
Genome reconstruções DNA genômico (tá estranho) foi extraído usando o NucleoBondâ X G fornecido por Macherey-Nagel (www.mn-net.com) como previamente realizado para o CyanoGEBA (Shih et al. 2013). O sequenciamento de oito genomas cianobacterianos foi realizado na Transcriptômica. Facilidade da Universidade de Bristol usando um Analisador de Genoma Illumina IIx e Illumina HiSeq2500. As leituras pareadas tiveram 100 pb de comprimento e a cobertura para todos os genomas foi > 1009. Das conseqüências resultantes, leituras de baixa qualidade, adaptadores sequenciadores eos primers foram removidos usando o programa de limpeza do adaptador Fastq-mcf (Aronesty 2013). Uma montagem inicial de novo de genomas cianobacterianos recentemente sequenciados foi conduzida utilizando o software Velvet v1.2.10 (Zerbino e Birney2008). Os comprimentos ótimos de K-mer para uma sensibilidade, ainda que específica, foram determinados separadamente para cada genoma baseado nos valores mais altos de N50 e no comprimento máximo de contigência. A montagem do genoma foi aprimorada para alinhar conigências em um genoma de referência artificialmente reconstruído no ABACAS v1.3.1 (Assefa et al. 2009), que foram reconstruídos com base na montadora Velvet usando o software EMBOSS-union (Rice e Breasby 2011). As lacunas nos conjuntos de projetos foram reduzidas, e a completude geral do genoma foi aprimorada usando o software de Mapeamento Iterativo e Montagem para Eliminação de Lacunas (IMAGE) (Tsaiet al. 2010). Tanto ABACES quanto IMAGE foram aplicados como parte do Kit de Ferramentas de Melhoria do Genoma Pós-Montagem (PAGIT; Swain et al. 2012). 
A anotação das seqüências foi realizada através de um algoritmo de correção de seqüência procariótica rápida implementado no Prokka v1.5.2 (Seemann 2014). Para análises adicionais, foi construído um banco de dados incluindo os genomas de 57 taxa de cianobactérias do GenBank, escolhidos para melhor representar a disparidade filogenética. Sequências de proteínas altamente conservadas foram identificadas aplicando o BlastP para pesquisas de similaridade proteína-proteína como parte do algoritmo "Ferramenta de Alinhamento Local Básico" Blast + (Camachoet al. 2009).
Análises filogenômicas usando uma supermatriz ( colocar em itálico? É um topico?)
Vários alinhamentos de sequência incluindo todas as 65 taxa de cianobactérias (Tabela S1) foram reconstituídas para cada uma das 756 proteínas fi cados identi (han ? ) (Schirrmeister et al. 2015, apêndice S1) usando mafft-7,058 (Katoh e Standley 2013). Locais onde as lacunas estavam presentes em 75% dos taxa foram removidos usando Phyutility (Smith e Dunn 2008). Os múltiplos alinhamentos de sequências de todas as 756 proteínas foram concatenados, e análises adicionais foram conduzidas na supermatriz resultante rica em aminoácidos 197 761 (Schirrmeister et al. 2015, apêndice S2). O modelo best-fitting para aproximar a evolução dos aminoácidos foi identificado aplicando o software ProtTest 3.2 (Darriba et al. 2011). O modelo LG + ((Le e Gascuel 2008) foi identificado como o melhor modelo de ajuste. árvores filogenéticas com base em uma probabilidade máxima algo- rithm foram reconstituídas usando a versão pthreads paralelizadas RAxML-7.2.8- para o processador de vários núcleos arquiteturas(Stamatakis et al., 2005) executado na máquina Computação de Alto Desempenho (Bluecrystal) na computação avançada Centro de Pesquisa da Universidade de Bristol. Das 10 árvores de máxima verossimilhança, optou-se por aquela com maior escore de verossimilhança (Fig. 1; Schirrmeister et al. 2015, apêndice S3). As análises de bootstrap para o conjunto de dados concatenados foram executadas 1000 vezes.
FIGURA 1: Árvore de máxima verossimilhança filogenômica. Filogenia de 65 taxa de cianobactérias baseada em uma supermatriz composta de 756 sequências de proteínas transmitidas (197 761 sítios de aminoácidos). O suporte de bootstrap de máxima verossimilhança para clades é indicado nas respectivas ramificações. Estrelas indicam 100% de suporte calculado a partir de 1000 reamostramentos de bootstrap. Os taxa de cianobactérias são codificados por cores. Unicellulartaxa pertencentes às subseções morfológicas I e II são exibidas em amarelo e laranja, respectivamente, enquanto os taxa cianobacacterianos multicelulares pertencentes às subseções III, IV e V são mostrados em verde, azul e rosa, respectivamente. A maioria dos ramos nestaphylogeny é bem suportada. Seis clades distintos poderiam ser reconstruídos com total apoio. Cianobactérias diferenciadas pertencentes às subseções IV e V são os únicos grupos onde dados morfológicos e genômicos congruentemente sugerem uma origem monofilética.
As reconstruções filogenéticas baseadas nas sequências 16S e 23S rRNA16S e 23S rRNA da cianobacteriana 75xa foram alinhadas usando Mafft-7.058 (Katoh e Standley2013) e concatenadas. O Critério de Informação de Akaike, implementado em jModelTest v0.1.1 (78), sugeriu um modelo de substituição reversível no tempo com variação de taxa gama-distribuída entre os locais (GTR + Γ; Lanaveet al. 1984) como o modelo mais adequado de evolução evolutivação. Árvores filogenéticas foram reconstruídas com base máxima verossimilhança usando o RAxML-7.2.8 (Stamatakiset al. 2005). Foram realizadas dez análises de máxima verossimilhança, das quais a de melhor probabilidade é apresentada (Fig. S1; Schirrmeister et al. 2015, apêndice S3). O suporte filogenético foi coletado a partir de 1.000 representações bootstra.
 Reconstrução de estado de caráter ancestral
 Estados de caráter ancestral foram reconstruídos usando a função'ace 'do pacote de macaco (Paradis et al. 2004) em R (http://www.r-project.org./). Os estados ancestrais foram construídos aplicando métodos de máxima verossimilhança com taxas de transição iguais e assimétricas, q01 descreve a transição para multicelularidade e q10 a transição para a unicelularidade. Os estados de caráter foram reconstruídos usando modelos de Markov de tempo contínuo conforme implementado em BayesTraits v.2beta (Pagel et al. 2004). A análise de Monte Carlo da cadeia de Markov (MCMC) foi executada para 1 010 000 iterações, com um burn-in padrão de 10 000. Convergência de todos os parâmetros foi alcançada neste ponto. As taxas de transição q01 eq10 foram amostradas a partir de uma distribuição prévia uniforme com a suposição de que qualquer taxa dentro desse intervalo é igualmente provável. Quatro análises foram realizadas com diferenças para a distribuição uniforme (Tabela S2).
Estimativa e calibração do tempo de divergência Os tempos de divergência foram estimados aplicando-se um relógio relaxado com distribuição da taxa lognormal, que incorpora a heterogeneidade da taxa de idade linear (Drummond et al. 2006). Estudos anteriores confirmaram o monofiletamento do filo Cyanobacteria e Gloeobacter violaceusclosest a um grupo externo eubacteriano (Blank e Sanchez-Baracaldo, 2010; Schirrmeister et al., 2011b; Shih et al, 2013). A posição de G. violaceus fora de um grupo cianobacteriano é ainda apoiada por diferenças morfológicas e genéticas, como a falta de membranas tilacoides (Rippka et al. 1974) e muitos genes ausentes associados aos fotossistemas (Nakamura et al. 2003). A estimativa do tempo de divergência foi conduzida usando o software MCMCTREE, parte do pacote PAML 4.4b (Yang2007), e executada na máquina de computação de alto desempenho (Bluecrystal) no Advanced ComputingResearch Center da University of Bristol. Os comprimentos de filiais foram estimados usando o software CODEML, alsopart do pacote PAML. Novamente, LG + Γ (Le e Gasc-uel 2008) foi selecionado como o modelo de evolução.
 Com base nas taxas de substituição estimadas, usamos uma distribuição gama com um parâmetro de forma de 1 e um parâmetro de escala de 9,53, como antes para as taxas de substituição globais. Na primeira execução sem priorizações de calibração, o vetor gradiente e a matriz de Hesse foram calculados. Para cada análise, realizamos quatro análises de Monte Carlo da cadeia de Markov para 10 milhões de gerações, amostrando a cada 100 gerações, 50% foram removidas como queimadas. Nesse ponto, todos os parâmetros atingiram a convergência. Utilizando a estimação do tempo de divergência, duas hipóteses foram investigadas com diferentes combinações de três calibrações (Tabela 1). Previsões de tempo especificadas pelo usuário e o tempo "efetivo" (conjunto) previamente implementado no cálculo das idades posteriores podem diferir substancialmente (Warnock et al. 2012). Portanto, realizamos as análises sem dados de sequência para obter uma estimativa dos antecedentes efetivos e para assegurar que não diferem de forma não razoável de nossos períodos específicos. Restringindo a origem das cianobactérias (calibração 1) Devido a sua afinidade a um grupo externo eubacteriano, Gloeobacter foi tratada como grupo externo para o resto de Cyanobacteria. A divergência da linhagem Gloeobacter da linhagem do tronco para todas as outras espécies de cianobactérias existentes foi
TABELA 1 
Priores para a calibração da árvore. Analysis Calibration DistributionHypothesis1Hypothesis2A, C Raiz Uniforme (hb) 2.45 3.85 2.45 3.85Seção IV e VUniform (sb) 1.957 2.32 1.957 2.32 Nó 3 Uniforme (sb) 1.957 2.45 2.45 3.33B, D Raiz Uniforme (hb) 2.918 3.85 2.918 3.85Seção IV e VUniform (sb) 1.957 2.32 1.957 2.32 Nó 3 Uniforme (sb) 1.957 2.45 2.45 3.33 A hipótese 1 assume uma origem de multicelularidade no nó 69 após o GOE. Neste caso, o nó 69 é calibrado com uma distribuição uniforme entre 2,45 Ga (início do GOE) e 1,9557 Ga (primeiros fósseis de cianobactérias multicelulares). A hipótese 2 pressupõe uma origem de multicelularidade antes do GOE; portanto, calibração auniforme é usada entre 3,33 Ga (fósseis lisos que não mostram evidência de uma relação cianobacteriana) e 2,45 Ga (o GOE). A raiz foi calibrada supondo que as ciano-bactérias se originaram algum tempo após o pesado bombardeio tardio (3.85), mas (A, C) antes do GOE (2.45) ou (B, D) antes do primeiro acúmulo de oxigênio livre (2.918 Ga) . Além disso, o ânodo que leva às subseções IV e V cianobactérias capazes de diferenciação celular foi calibrado. Akinetes fósseis (1.957 Ga) indicam uma presença deste clado a 1.957 Ga. No entanto, a diferenciação de heterocistos mostra apenas níveis de oxigênio de vantagem competitiva seletiva após o GOE (2.32 Ga)
 .hb (limites rígidos): não permite estimativas fora do intervalo anterior. -idades durante as análises; sb (limites suaves): as estimativas de idade podem cair fora dos anteriores eficazes com uma probabilidade de 5%.
Assumiu-se que ocorreu algum tempo entre 3,85 e 2,918 Ga (Tabela 1, análises A, C) ou 3,85 e 2,45 Ga (Tabela 1, análises B, D), com cada ponto de tempo sendo igualmente provável (distribuição prévia uniforme). O limite inferior da idade da coroa Cyanobacteria nas análises A e C é baseado na evidência isotópica de Mo para a produção de oxigênio da Fórmula Sinqeni, Supergrupo Pongola, África do Sul, indicando indiretamente a presença de oxidação manga, um processo que exigiria oxigênio livre abundante (Planavsky et al. 2014). Com base nos zircuitos U-Pb, as rochas que continham essas assinaturas Mo eram no mínimo de 2,940 Ga ± 0,022 Gyr (Hegneret al. 1984). Análises de isótopos de carbono de rochas de idade similar, como Mushandike, Zimbábuee Steep Rock, no Canadá, sustentam ainda mais a presença precoce de oxigênio como resultado da fotossíntese oxigênio (Nisbet et al. 2007; Nisbet e Nisbet 2008). Para as análises B e D, o limite inferior na idade da coroa Cyanobacteria é baseado no início estimado do GOE (Bekker et al. 2004). O limite superior representa o último final do Late HeavyBombardment, baseado em estimativas para o fim do bombardeio de meteorito da lua (Stäffle of fl er andRyder 2001; Chapman et al. 2007). Dado que se calcula que o bombardeio do fogo celeste tenha terminado em 3.85 Ga, uma idade similar pode ser assumida para a Terra dada a proximidade da lua. Para resumir, a calibração 1 seguiu uma distribuição uniforme de 3,85 a 2,918 / 2,45 Ga com limites rígidos (Tabela 1). 
Restringindo a origem da diferenciação celular terminal (calibração 2)
 Células em repouso fósseis, chamadas akinetes, presentes apenas em cianobactérias capazes de a formação de heterocistos (subsecções IV e V; Fig. 1) foi descrita a partir de c. 2.1 GaFranceville Group, Gabão (Amard e Bertrand-Sarfati1997; Sergeev 2009). Com base nos isótopos Sm-Nd, duas amostras de xisto ricas em kero-gen do Grupo Franceville produziram 2.099 Ga  115 Myr para 2.036 Ga  79 Myr, o que sugere uma restrição mínima conservativa para a calibração de 1.957 Ga (Bros et al. 1992) . Estes fossilakinetes, classificados como Archaeoellipsoides, foram reportados de vários intervalos através do Proterozóico (Horodyski e Donaldson, 1980; Golubic et al., 1995; Sri-vastava, 2005); no entanto, os microfósseis do FrancevilleGroup são as primeiras dessas ocorrências. A monofilia de cianobactérias formando heterocistos e akinetes é confirmada neste estudo. Combinado com a sugestão de um estudo anterior (Tomitani et al. 2006), que argumentou que os heterocistos evoluíram como uma resposta ao aumento dos níveis de oxigênio após o GOE, assumimos que os ancestrais comuns mais recentes das subseções IV e V cianobacteriamust se originaram após o GOE, mas antes para
1.957 Ga. Assumimos uma densidade de calibração anterior uniforme entre 1.957 e 2.45 Ga com 5% de probabilidade prévia de que as estimativas posteriores podem ficar fora desse intervalo (softbounds). Embora akinetes fósseis do FrancevilleGroup também sejam conhecidos do Mesoproterozóico (Horo-dyski e Donaldson, 1980; Golubic et al., 1995), queriam testar quão fortemente a calibração 2 afeta nossa idade. Portanto, uma análise adicional foi executada sem a calibração 2. Neste caso, as seguintes calibrações foram aplicadas:
calibração 1, distribuição prévia uniforme (idade mínima: 2,45 Ga e idade máxima: 3,85 Ga) com hardbounds; 
calibração 2, ausente; 
calibração 3, distribuição prévia uniforme (idade mínima: 2,45 Ga, idade máxima: 3,33 Ga; limites moles = 2,5% cauda em ambos os lados) .
A evolução da multicelularidade - testando duas hipóteses (calibração 3) 
Testamos hipóteses sobre o tempo de origem das cianobactérias multicelulares; duas hipóteses foram especificadas e testadas: se a multicelularidade evoluiu antes ou depois do GIG (Fig. 2). Análises foram conduzidas restringindo a idade da primeira ocorrência de multicelularidade no nó 69 (resultado da reconstrução do estado de caráter ancestral; Schirrmeister et al. 2011b), de modo que essa transição ocorreu com maior probabilidade antes do GOE (H1) ou após o GOE (H2 ). Para H1, 1.957 Ga é definido como a idade mínima. Rochas do Grupo Franceville contêm fósseis de arkinioides e parentes antigos de cianobactérias multicelulares, chamadas de Archaeorestis (Amard e Bertrand-Sarfati, 1997). Depósitos de similaridade da Dolomita de Duck Creek, na Austrália Ocidental (aprox. 2,0 Ga) contêm vários fósseis semelhantes ao gênero de cianobactéria multicelular Lyngbya, chamado Oscillatoriopsis (Knoll et al. 1988). Os limites de probabilidade de cauda macia de 2,5% foram implementados. Uma idade máxima de 2,45 Ga foi escolhida para o início do GOE. Assumimos uma distribuição anterior uniforme com limites moles (Tabela 1). Para H2, definimos a distribuição de probabilidade uniforme no início estimado do GOE (2,45 Ga), conforme estimado por Bekker et al. (2004). Fósseis filamentosos de 3,42-3,35 Ga encontrados na Formação Strelley Pool, Austrália (Wacey et al. 2011; Sugitani et al. 2013), Barberton Greenstone Belt, África do Sul (Walsh 1992; Westall et al. 2001; Westall et al. 2006 ), e possivelmente antes (Awramik et al. 1988; Schopf e Kudryavtsev2009) evidenciam a presença de procariontes multicelulares. Os diâmetros de filamentos desses fósseis são mais probabilísticos do que determinísticos como evidência da presença de cianobactérias. Escolhemos essas ocorrências como base de um limite máximo suave para a origem de cianobactérias multicelulares. Portanto, as densidades de calibração anteriores, o fornode 69, estão uniformemente distribuídas entre 3,33 e
2,45 Ga e as idades mínima e máxima referem-se aos limites de probabilidade de 95% (Tabela 1).
FIGURA 2: Descrição das calibrações utilizadas neste estudo. Aplicam-se restrições de idade à origem das cianobactérias (calibração 1), teorema das secções de cianobactérias IV e V capazes de diferenciação celular (calibração 2) e a origem da multicelularidade com enzimas de cianobactérias (calibração 3). Este estudo tem como objetivo testar duas hipóteses. Hipótese 1: A multicelularidade originou-se em cianobactérias antes do Grande Evento de Oxidação (GOE), proporcionando uma vantagem para as cianobactérias, resultando em maior abundância daqueles procariotos anteriormente carcerados, aumentando assim a produção de oxigênio. Hipótese 2: A multicelularidade evoluiu após o GOE, como uma adaptação a habitats recém-oxidados que se tornaram disponíveis.
RESULTADOS 
Com o objetivo de inferir a história evolutiva das cianobactérias em relação ao seu registro fóssil, foram identificadas 756 sequências de proteínas altamente conservadas (Schirrmeister et al., 2015, apêndices S1, S2) que foram identificadas anteriormente em 65 cianobactérias baseadas em pesquisas de similaridade. Filogenias de cianobactérias baseadas em métodos de máxima verossimilhança são apresentadas na Figura 1 (ver também Fig. S1; Schirrmeister et al., 2015, apêndice S3). 
Comparação de reconstruções filogenéticas baseadas em dados genômicos e ribossômicos 
Para comparação direta de nossa árvore filogenômica (Fig. 1) a árvores nos genes ribossômicos, reconstruímos a filogenia da máxima verossimilhança com base nas seqüências concatenadas de 16S e 23S rRNA dos taxa utilizados neste estudo (Fig. S1). Enquanto os valores de 100% de máxima verossimilhança (BS) suportaram apenas 24 das 64 ramificações da árvore theribosomal, 100% de suporte bootstrap foi inferido para 57 das 64 ramificações da árvore genômica. Várias formas de geração aparecem polifiléticas, como Synechococcus, Geitler-inema e Pseudanabaena. Do outro lado da árvore filogenômica, seis clados principais poderiam ser identificados com suporte total de ressinplanagens de bootstrap. Assumindo que os Gloeobactergroups mais próximos de um grupo externo eubacteriano, comosugerido com base em dados ribossômicos (Schirrmeister et al., 2011b) e filogenéticos (Blank e Sanchez-Baracaldo2010; Shih et al., 2013), o Synechococcus isolado de hotsprings é o primeiro grupo a se separar do restante das cianobactérias, seguido por um ramificação precoce 'Clade 1' de cianobactérias uni-celulares e multicelulares compreendendo Synechocystis sp. PCC 9635 e Pseudanabeana sp. PCC7367, PCC 7704 e PCC 7904 (Clade C, Figs S1, S2). Marina de AcarylorisUnicellular MBIC11017, Acaryochl-oris sp. O CCMEE 5410 e o Thermosynechococcus elongatusBP-1 formam um "Clade 2" separado. O 'Clade 3' compreende os taxa unicelulares e multicelulares de colonização precoce, incluindo picocianobactéria marinha e Prochlorothrixhollandica filamentosa PCC 9006. O 'Clade 4' inclui um grupo de taxa multi-celulares, tais como Arthrospira maxima CS-328 e A.platensis NIES-39, Oscillatoria nigro- viridis PCC 7112, Planktothrix agardhii NIVA-CYA 34 e TrichodesmiumerythraeumIMS101. "Clade 5" e "Clade 6" formam irmãs. "Clade 5" contém subseções IV e V ciano-bactérias, Chroococcidiopsis sp. Unicelulares. PCC 8201 e Chroococcidiopsis thermalis PCC 7203, e multicelularLimnothrix redekei PCC 9416. Chamaesiphonminutus unicelular PCC 6605 e multicelulares Crinalium epipsammun PCC 9333, que estão incluídos neste clade na árvore therbossomática, são agrupados separadamente com bom suporte de alça de inicialização (BS: 75% ) na árvore filogenômica. Os dados fitogenômicos suportam completamente a monofilia das cianobactérias das subseções IV e V capazes de diferenciação celular. A clareza 6 compreende a maioria das cianobactérias das subseções I a III (exceto picocianobactérias marinhas, Synechococcus hotspring e multicelulares precoces) e é bem suportada na filogenômica árvore, mas não resolvido na árvore ribossomal (BS: 41%).
Os clados reconstruídos neste estudo foram comparados com estudos anteriores (Tabela 2; Schirrmeister et al., 2011b; Shihet al., 2013; Sanchez-Baracaldo et al., 2014). Os clades 1 a 6 (este estudo) podem ser comparados diretamente aos clados (A – C, E, F) reconstruídos por Shih et al. (2013). Os táxons multimilionários de ramificação precoce aqui descritos como o Clade 1 podem ser encontrados como Clade C em Schirrmeister et al. (2011b), mas estavam faltando em outros estudos (Blank e Sanchez-Baracaldo, 2010; Sanchez-Baracaldo et al., 2014). Os clados 2 e 3 (este estudo) compreendendo principalmente táxons unicelulares, incluindo pico-cianobactérias e clados 4-6 (este estudo), são comparáveis ​​ao Clade AC e Clade E em Schirrmeister et al. (2011b). Em Sanchez-Baracaldo et al. (2014), o nosso Clade 3 é parcialmente recuperado como Marine SynPro, os clades 4 e 5 foram recuperados como clade PNT, enquanto o Clade 6 é comparável ao deles. 
Reconstrução de estado de caráter ancestral 
A evolução da multicelularidade foi reconstruída usando uma máxima verossimilhança e inferência Bayesiana. Um modelo evolucionário, assumindo taxas de transição iguais, resultou em taxas de 0,7575 (desvio padrão = 0,1978). Para reconstruções de estado de caracteres usando um modelo de comportamento assimétrico, as taxas estimadas foram q01 = 0,5768 (erro padrão = 0,3147) e q10 = 0,8254 (erro padrão = 0,2205), onde q01 define a transição para multicelularidade e q01 a perda de multicelularidade. Adicionalmente, diferentes distribuições prévias uniformes para a estimativa das taxas de transição foram testadas durante as análises Bayesianas dos estados de caráter ancestrais. Alterar as larguras da distribuição uniforme em várias execuções suportou uma transição inicial para a multicelularidade ainda mais (Fig. S3, onlineSupporting Information). Todas as execuções do MCMC exibiram evidências de mistura suficiente. Para todas as análises, as mudanças aceitas nas cadeias apresentaram valores de aproximadamente 30% no tempo de convergência. Os resultados de todas as análises sugerem uma transição muito precoce para multicelularidade em "nó / ramo69" (Fig. 3; Fig. S3; Tabela S3). Através da filogenia, a multicelularidade é subsequentemente perdida, pelo menos, cinco vezes, e recuperada em um, possivelmente dois, ramo levando a Lep-tolyngbya sp. PCC 7376 e Spirulina subsalsa PCC 9445. Portanto, a maioria das cianobactérias modernas é descendente de uma antiga linhagem multicelular.
 Estimativa do tempo de divergência 
A análise do tempo de divergência dos dados filogenômicos empregou três pontos de calibração que foram refinados a partir de calibrações previamente sugeridas para datação de análises de Cyanobacteria (Schirrmeister et al. 2013) e com (C1) origem da Cyanobacteria, (C2) a origem da diferenciação celular como encontrado nas subseções IV e V com base em 2.1 Ga akinetes fossilizados e (C3) a origem da multicelularidade no nó 69 (Fig. 3). Em comparação com as análises prévias, que não puderam resolver o posicionamento filogenético do ancestral comum mais recente (MRCA) das subseções IV e V, nossos dados filogenômicos permitem recuperar o monofiletismo desse grupo, permitindo assim uma calibração mais precisa desse evento de divergência (C2 Para a origem da multicelularidade (C3), dois cenários foram testados, incluindo: (1) uma origem de multicelularidade após o TGO como uma adaptação a habitos colonos recém formados (oxigenados) (Hipótese 1); ou (2) uma origem de multicelularidade antes do GOE, onde as vantagens da multicelularidade poderiam ter resultado em uma abundância crescente de cianobactérias, aumentando a produção líquida de oxigênio e causando o GOE (Hipótese 2; Fig. 2). Os resultados do tempo de divergência são fortemente afetados por escolha de parâmetro se forem empregadas densidades de calibração anteriores não uniformes, como lognormal, (Warnock et al. 2012,2015); portanto, apenas distribuições uniformes foram aplicadas neste estudo. Além disso, Warnock et al. (2012, 2015) apontam que os programas para análise de relógio molecular truncam as calibrações prévias para que as distribuições de idade anteriores estejam de acordo com as ocorrências de eventos de divergência na filogenia. Portanto, os ajustes de calibração conjuntos (efetivos) podem diferir substancialmente dos dados especificados pelo usuário 
antecedentes. Nossas análises realizadas sem dados moleculares mostraram que nossos prévios originais uniformes (Fig. 4; curva tracejada) resultaram em prévias efetivas não uniformes (Fig. 4; redcurve). As faixas etárias de priori especificadas e efetivas eram semelhantes, no entanto, e poderiam ser aceitas para as análises do tempo de divergência. Para a linhagem de cianobactérias (calibração 1; Figura 4), as estimativas de idade posterior foram distribuídas quase uniformemente na hipótese 1 e deslocadas para uma origem de cianobactérias antes de 3.5 Ga para a hipótese 2. Em todas as análises, subseções IV e V capazes de diferenciação celular (calibração 2) A figura 4 apresenta maior probabi- lidade de originação próxima à faixa etária mínima de nossa calibração prévia especi fi cada (1,9–2,1 Ga). No entanto, se este nó não foi utilizado para calibração, uma idade mais jovem é estimada (0,8-1,6 Ga; Fig. S4). Neste caso, idades posteriores semelhantes são estimadas para o nó 3 e a raiz, mas com distribuições de probabilidade mais amplas de 95%. Em todas as análises, as probabilidades posteriores da origem da multicelularidade (calibração 3; Fig. 4) suportam uma idade próxima ao máximo da calibração da idade prévia. A Figura 5 apresenta os resultados da análise de divergência comparando as quatro análises (Tabela 1). As estimativas de idade do nódulo posterior mostram grandes intervalos de confiança de 95%, o que impede uma datação precisa dos eventos de divergência. No entanto, todas as análises, independentemente das suposições prévias aplicadas ao nó 69, apontam para uma origem de multicelularidade em cianobactérias antes do GOE (Fig. 5). A maioria dos clados de cianobactérias modernas (clades 2 a 6) evoluíram após o GOE. Além disso, nossos resultados estão de acordo com as estimativas anteriores de uma origem de marinepicocianobactérias em torno do final do Mesoproterozóico (Sanchez-Baracaldo et al. 2014), embora os intervalos de confiança sejam muito amplos para especificar datas, além disso. Em comparação com as análises anteriores baseadas no 16S rRNAdata (Schirrmeister et al. 2013), os intervalos de confiança são menores em geral, particularmente aqueles das idades profundas dos nós.Diferentes larguras para a calibração da raiz (A, Cvs. B, D na Fig. 5 ) não afetou as estimativas de idade para o nó69, enquanto na Hipótese 1 uma calibração da raiz entre 3,85 e 2,958 resultou em uma estimativa média de 235 milhões de anos mais velha para o nó 69 com distribuição de probabilidade mais ampla.
TABELA 2: Comparação do clado com os estudos anteriores.Clades Study Clade 1 Clade 2 Clade 3 Clade 4 Clade 5 Clade 6 Este estudo foi realizado com o estudo RetsiemrrihcSEedalCCAedalCCedalC et al. 2011 Clade F Clade E Clade C Clade A Clade B Shih et al. 2013 NA Semnome SynPro PNT SPM Sanchez-Baracaldo et al. 2014 Os seis clados que foram reconstruídos neste estudo foram comparados com os resultados de estudos filogenéticos anteriores: Schirrmeister et al. (2011b; baseado em 16S rRNA ribossômico); Shih et al. (2013; baseado em 31 genes); e Sanchez-Baracaldo et al. (2014; baseado em 135 genes mais dois genes ribossômicos).
FIGURA 3: Reconstrução do estado do caráter ancestral para inferir a evolução da multicelularidade. Os estados de caráter ancestral inferidos a partir de análises de máxima verossimilhança supondo taxas de transição assimétricas entre estados foram plotadas em uma árvore ultramétrica de máxima verossimilhança de cianobactérias. Os gráficos de pizza em nós exibem estados de caracteres ancestrais reconstruídos, onde os estados de crescimento unicelulares multicelulares e amarelos são divididos em preto. Os táxons de cianobactérias modulares são exibidos em caixas coloridas, que indicam sua classificação taxonômica de acordo com Rippka et al (1979). As taxas pertencentes às subseções unicelulares I e II são apresentadas com fundo amarelo e laranja, respectivamente, enquanto as cianobactérias multicelulares das subseções III, IV e V são mostradas nas caixas verde, azul e rosa, respectivamente. C1 e C2 referem-se aos clados 1 e 2. A multicelularidade desenvolvida precocemente durante a história da cianobactéria foi perdida várias vezes e recuperada nas colônias.
DISCUSSÃO 
Melhor conjunto de dados para reconstruir a história evolutiva das cianobactérias
Utilizando os dados da sequência 16S rRNA e um conjunto de diferentes hipóteses de calibração, um estudo anterior de Schirrmeister et al. (2013) estimaram tempos de divergência que apontavam para uma origem de cianobactérias no Arqueano Eon, com a multicelularidade mais provavelmente originada antes do GO. No entanto, esses resultados foram baseados em um conjunto minimaldata de sequências de RNA ribossomal 16S (1077-1090nucleotídeos). Embora a ocorrência de sítios variados e sítios altamente conservados tenha feito das seqüências 16S rRNA uma ferramenta ideal para recuperar relações filogenéticas em nível de filo (Woese, 1987), compreende apenas 1.400 sítios de nucleotídeos, com apenas metade deles suscetíveis a mudanças. em filo Cianobactérias. Portanto, as chances são altas de que a informação filogenética possa ter sido perdida devido a múltiplas substituições no local do samenucleotídeo (saturação). Embora os modelos evolutivos tentem explicar múltiplos acertos, com o tempo, as seqüências se saturarão, o que é um problema particularmente para seqüências de nucleotídeos e ramos profundos (Xia et al. 2003). Outro estudo de Shih e Matzke (2013) recuperou muito tempo. origem mais recente dos cianobactérias vivos
concluindo que uma antiga linhagem de haste de cianobactéria é responsável pelos níveis de oxigênio arqueanos tardios. Embora sua técnica de calibração cruzada, cruzada para eventos de duplicação seja inovadora, seus resultados são baseados em apenas duas subunidades de uma enzima (c. 986 aminoácidos). As subunidades ATPase resultaram de um evento de duplicação antiga, que ocorreu antes do último ancestral comum de todos os táxons vivos e, portanto, foi usado no passado para reconstruir a Árvore da Vida (Iwabeet al. 1989). Além da possível saturação de seqüências que pode ter ocorrido nessas seqüências, as filogenias reconstruídas representam a evolução de uma enzima e podem resultar em inferências fortemente equivocadas para a evolução das espécies. Além disso, calibrações de clados de ponta foram consideradas inadequadas para a estimativa precisa de eventos de divergência profunda (Duchene et al. 2014). Neste estudo, o uso de um conjunto de dados impressionantemente grande (197 766 sítios de aminoácidos) ajudou a superar as limitações anteriores. análises poderiam ter tido, não só melhorar substancialmente o suporte estatístico através da filogenia cianobacteriana em comparação com uma única análise genética, mas também corroborando as hipóteses de uma origem precoce de multicelularidade em cianobactérias (Schirrmeister et al. 2011b, 2013).
FIGURA 4: Estimativas de idade prévia e posterior para nós que foram calibrados. Densidade de idade prévia (cinza) e especificadas pelo usuário (vermelho), bem como estimativas de idade posterior (preto) para a origem de cianobactérias (calibração 1), a origem das cianobactérias dos cortes IV e V (calibração 2) e origem da multicelularidade (calibração 3). Compararam-se duas hipóteses, cada uma com (A, C) uma calibração de raiz mais larga (3,85–2,45 Ga) e (B, D) e mais estreita (3,85–2,958 Ga). As estimativas de idade posterior para a origem da multicelularidade (calibração 3) são, em todos os casos, deslocadas para o limite mais antigo dos antecedentes efetivos.
FIGURA5: Tempo de divergência de cianobactérias. Os tempos de divergência foram reconstruídos usando um relógio molecular relaxado. Duas hipóteses foram testadas, onde se supõe que a multicelularidade tenha se originado após o Grande Evento de Oxidação (GOE; Hipótese 1; A, B) ou antes do GOE (Hipótese 2; C, D). A origem das cianobactérias (raiz) foi calibrada entre o final do bombardeio pesado tardio e (A, C) o início do GOE, ou (B, D) os primeiros traços de oxigênio a 2.958 Ga. Em todas as quatro análises, o cianobactéria estima-se que a multicelularidade se origine antes do GOE. Os nós para calibrações 1 a 3 são marcados na primeira árvore filogenômica. As árvores são versões ultramétricas da árvore máxima likeli-capuz apresentadas na Figura 1. As cores referem-se a diferentes subseções morfológicas de cianobactérias. De cima para baixo, os seguintes taxons são exibidos em cada árvore: (Clade 6) Leptolyngbya sp. PCC 7376, Synechococcus sp. PCC 7002, Cyanobacterium aponinum PCC 10605, Cya no-bact�ia stanieri PCC 7202, Synechocystis sp. Subcepa PCC 6803 PCC-N, Cyanothece sp. PCC 7424, Microcystis aeruginosa NIE S-843, Cyanot-hece sp. PCC 8801, Crocosphaera watsonii WH 8501, Xenococcus sp. PCC 7305, Stanieria cyanosphaera PCC 743 7, Gloeocapsa sp. PCC 73106, Halothece sp. PCC 7418, Dactylococcopsis salina PCC 8305, Spirulina subsalsa PCC 94 45, Moorea producens 3L, Symploca sp. PCC 8002, Cole o-fascículo chthonoplastes PCC 7420, Microcoleus sp. PCC 711 3; Crullium epipsammum PCC 9333, Chamaesiphon minutus PCC 6605; (Clade 5) "Nostoc azollae'0708, Cylindrospermopsis raciborskii CS-505, Anabaena cylindrica PCC 7122, Cylindrospermum stagnale PCC 7417, Microchaetesp. PCC 7126, Anabaen a variabilis ATTC 29413, Nostoc sp. PCC 7120, Nodularia spumigena CCY9414, Calothrix sp. PCC 6303, Fischerellamuscicola PCC 7414, Fischerella thermalis PCC 7521, Chlorogloeopsis fritschii PCC 9212, Clorogloeopsis fritschii PCC 6912, Mastigocladopsis diminui PCC 10914, Chroococcidiopsis sp. PCC 8201, Chroococcidiopsis thermalis PCC 7203, Limnothrix redekei PCC 9416; (Clade 4) Arthrospiraplatensis NIES-39, Arthrospira máxima CS-328, Planktothrix agardhii NIVA-CYA 34, Trichod esmium erythraeum IMS101, Microcoleus vaginatusFGP-2, Oscillatoria nigro-viridis PCC 7112; Geitlerinema sp. PCC 7407, Leptolyngbya sp. PCC 73110, Geitlerinema sp. PCC 8501, Nodosilineanodulosa PCC 7104; (Clade 3) Synechococcus sp. WH 8102, Synechococcus sp. CC9605, Synechococcus sp. CC9311, Cyanobium gracile PCC 6307, Synechococcus elongatus PCC 6301, Prochlorothrix hollandica PCC 9006; (Clade 2) Acaryloris marina MBIC11017, Acaryocloris sp. CCMEE541 0, Thermosynechococcus elongatus BP-1; e (Clade 1) Pseudanabaena sp. PCC 7904, Pseudanabaena sp. PCC 7704, Synechocystis sp. PCC963 5, Pseudanabaena sp. PCC 7367; Synechococcus sp. JA-3-3Ab, Synechococcus sp. JA-2-3B’a (2-13), Gloeobacter violaceus PCC 7421.
Comparação dos tamanhos das células de cianobactérias com microrganismos pré-cambrianos 
As cianobactérias modernas exibem uma ampla gama de tamanhos de células que, em média, excedem os tamanhos encontrados entre a maioria dos procariotos (<2 lm; Castenholz 2001). Microfósseis de depósitos pró-terozóicos e arqueanos compreendemformas multicelulares, como filamentos septados e não-septados, e restos nucleares, como esferas e bastonetes. Muitas vezes, os tamanhos dos táxons unicelulares excedem os dos depósitos fossilizados, como observado em depósitos, como Dismal Lake, GunfillChert, Belcher Supergroup e Barberton Supergroup (Hofmann, 1976; Horodyski e Donaldson, 1980; Lanier, 1989; Walsh, 1992). Nos primeiros depósitos arqueanos, como na África do Sul (3,33-3,46 Ga), os tamanhos dos filamentos fósseis não ultrapassam 5 lm (Walsh 1992; Westall et al. 2001). Embora a ocorrência de tubos maiores (10-20 lm) tenha sido observada em depósitos de 3,4 Ga da Austrália Ocidental, estes apresentam poucas características para ligá-los à moderna enzima procariótica. Os primeiros morfotipos multicelulares maiores e bem preservados, com larguras de células de até 28 lm, podem ser observados no Grupo Transvaal de 2,6 Ga (Altermann e Schopf 1995). Os filamentos deste depósito foram comparados a morfotipos bacterianos. Em c. Depósitos de Ma da Austrália Ocidental, foram encontrados filamentos de grande porte (63 lmin de largura) e classificados como Oscillatoriopsismajuscule (Knoll et al. 1988). Fósseis de tamanhos semelhantes são semelhantes aos modernos tamanhos de cianobactérias filamentosas observadas na forma dos gêneros Lyngbya, Oscillatoria e Trichodesmium (Castenholz 2001). Nossos resultados mostram que a multicelularidade evoluiu muito entre as cianobactérias e as estimativas de tempo de divergência (Fig. 5) confirmam sugestões anteriores de cianobactéria. uma origem de multicelularidade anterior ao GOE, independentemente de se utilizar a calibração de fósforo akinete de 2,0 Ga. Supõe-se que: (1) cianobacterialtaxa simples filamentosa estava presente em depósitos de 2,0-Gyr-old; e (2) as cianobactérias foram responsáveis ​​pelo acúmulo de oxigênio durante o Arqueano, indicando a existência de cianobactérias multicelulares antes do GOE. Isso tem um significado significativo para a interpretação de fósseis filamentosos como cianobactérias com base em sua morfologia, incluindo aqueles descritos a partir de uma faixa de sítios a 2,0 Ga (Knoll et al. 1988; Lanier 1989; Amard e Bertrand-Sarfati 1997) e potencialmente do grupo 2,6 Ga TransvaalSuper (Altermann e Schopf 1995) ou ainda mais antigos (Awramik et al. 1988; Schopf e Kudryavtsev 2009). 
Evidências geoquímicas, baseadas em isótopos de Mo e Fe, suportam uma evolução inicial da fotossíntese oxigenada (Nisbet e Fowler 2011). Sistemas de recifes de mais de 2,83 anos de idade de Mushandike, Zimbábue e Steep Rock, no Canadá, parecem ter sido formados em águas oxicas e suportam as hipóteses de oásis de oxigênio arqueano que se baseavam na ausência de fracionamento de massa independente de enxofre (Ohmoto et al. al. 2006). Isótopos de carbono orgânico nestas rochas, adicionalmente, apontam para a atividade cianobacteriana de RuBisCO I nesses depósitos e para a origem de suporte de cianobactérias no Arqueano (Nisbet et al.2007; Nisbet e Fowler 2011).
 Benefícios da multicelularidade de cianobactérias e suas potenciais conseqüências para o GOE
A origem das cianobactérias tem sido amplamente discutida no passado e ainda está longe de ser resolvida. Hipóteses anteriores têm defendido a origem de Cyanobacteriashortly antes do GOE (Kirschvink e Kopp 2008), seguido por um rápido acúmulo de oxigênio como observado durante o GOE. Alternativamente, vários estudos encontraram evidências de oxigênio livre e, assim, inferiram a presença de cianobactérias, centenas de milhões de anos antes do GOE, possivelmente já em 3,0 Ga (Nisbet et al. 2007; Nisbet e Nisbet 2008; Crowe et al. 2013 ; Lyons et al. 2014). O atraso na acumulação de oxigénio livre até que o GOE tenha sido explicado por uma atmosfera fortemente redutora onde o oxigénio inicialmente produzido foi captado por sumidouros de oxigénio, tais como gases vulcânicos reduzidos (Catling e Claire 2005). Foi demonstrado que Fe (II) inibe o crescimento em culturas de Synechococcus (Swanner et al. 2015). Em ambientes arqueológicos, a toxicidade de Fe (II) poderia ter proibido a fotossíntese oxigenada e subsequentemente permitido
por apenas pouca produção de oxigênio. Embora os gases redutores tenham influenciado os níveis de oxigênio, os estudos não levam em conta a importância da diversidade de cianobactérias e do tamanho da população. Como a única fonte biológica de oxigênio durante o início do Pré-Cambriano, a qualidade das cianobactérias e o sucesso ecológico deveriam ter tido um impacto profundo na quantidade de oxigênio líquido livre nos oceanos e na atmosfera da Terra. Sugere-se que a origem da multicelularidade tenha sido uma importante transição na história da cianobactéria, formando novas unidades a serem submetidas à seleção e oferecendo o potencial para aumentar a dança das cianobactérias, consequentemente iniciando o GOE. Além disso, a multicelularidade poderia ter fornecido novas possibilidades para a diversificação e adaptação de bactérias a novos habitats oxigenados. A origem da multicelularidade pode ter tido múltiplas vantagens em um ambiente arqueano. Como já observamos, as taxas metabólicas parecem aumentar de forma super-linear com o tamanho das bactérias heterotróficas (DeLong et al.2010). Da mesma forma, os tamanhos aumentados de cianobactérias multicelulares podem ter resultado em taxas metabólicas mais altas, portanto, maior atividade fotossintética e aumento da produção líquida de oxigênio. Além disso, o crescimento multicelular pode ter proporcionado vantagens competitivas que resultaram em um maior sucesso de crescimento (Fig. 6). Durante a evolução das cianobactérias, a radiação UV deve ter sido uma forte pressão seletiva em diversos táxons de cianobactérias, hoje, que desenvolveram a capacidade de se proteger da radiação UV-A. 
e UV-B usando pigmentos, como scytonemin e shinorine (Sinha e H € ader 2008; Balskus e Walsh2010; Calteau et al. 2014; Rastogi et al. 2014). Embora tenha sido sugerido que o enxofre possa ter proporcionado proteção UV durante o Arqueano (Ueno et al. 2009), a radiação UV poderia ter sido problemática para os organismos fotossintéticos, pois eles dependem da luz solar como fonte de energia, mas, ao mesmo tempo, precisam evitar a radiação letal. Antes do GOE, antes que um escudo de ozônio fosse estabelecido, a radiação ultravioleta (UV) adicional entre 200 e 300 nm (UV-C) teria efeitos letais sobre os órgãos-ismos (Kasting e Catling 2003). A capacidade de mover-se dentro do tapete microbiano, uma característica que tem sido descrita para cianobactérias multicelulares, poderia ter sido de grande vantagem para evitar a radiação letal. Nas comunidades modernas, as cianobactérias multicelulares, como Os-cillatoria e Phormidium, movem-se verticalmente para se posicionarem na luz ideal (Stal, 1995). Além disso, experimentos demonstraram o movimento de cianobactérias finas para evitar a luz UV, onde a prevenção do movimento resultou na inibição da fotossíntese induzida por UV (Kruschel e Castenholz, 1998). Além disso, a multicelularidade pode ter sido vantajosa durante a fixação inicial do substrato no início da maturação (Fig. 6). A maior área superficial de bactérias filamentosas aumenta o contato com o substrato, o que poderia resultar em melhor adesão (Young, 2006). Cianobactérias filamentosas do gênero Oscillatoria
associado à colonização inicial do substrato durante a formação de ferrugem (Stal et al. 1985). A fixação melhorada de cianobactérias filamentosas no final do Arqueano pode ter uma maior formação de manta e, consequentemente, o sucesso de taxa de cianobactérias associadas com as comunidades microbianas. Além disso, a incianobactéria multicelularidade permitiu inovações evolutivas adicionais. A diferenciação celular em cianobactérias, por exemplo, pode somente evoluir em um ambiente multicelular (Rossetti et al.2010). Portanto, potenciais vantagens da multicelularidade, tais como: (1) movimento e (2) melhoria do substrato, em combinação com potenciais aumentos nas taxas metabólicas,poderiam ter sido o gatilho para o sucesso evolucionário das cianobactérias no final do arqueano na oxigenação da Terra.
FIGURA 6: Ilustração da evolução de cianobactérias que conduz ao GOE. A radiação UV-C (abaixo de 290 nm) pode ter sido um grande desafio para as cianobactérias unicelulares amotis. O desenvolvimento da multicelularidade terá proporcionado duas grandes vantagens para a comunidade de ratos: (1) a capacidade de se mover dentro da esteira bacteriana de acordo com os requisitos de luz e / ou a evitação letal de UV-C; e (2) melhor apego durante a fase inicial do desenvolvimento do tapete. Essas vantagens da multicelularidade em combinação com a eficiência enéricamente mais alta da fotossíntese oxigenada podem ter levado a uma maior abundância de estromatólitos dominados por cianobactérias e indiretamente resultaram em maior produção de O2 em direção ao final do arqueano.
CONCLUSÃO 
As cianobactérias originaram-se no meio do arqueano, muito antes do GOE, com taxa multicelular evoluindo em direção ao final do arqueano. Um atraso observado na acu- mulação de oxigênio até o GOE poderia ter sido associado não apenas aos sumidouros de oxigênio que removem o oxigênio, mas possivelmente também com o sucesso evolutivo diminuído das cianobactérias precoces. A multicelularidade proporciona vantagem seletiva durante a história da Terra primitiva, incluindo: (1) movimento dentro dos tapetesmicrobianos para evitar dosagens letais de UV-C; e (2) melhoria da aderência às superfícies durante a formação inicial do tapete que pode ter aumentado substancialmente o sucesso de comunidades de tapetes dominadas por cianobactérias e permitir a adaptação a novos habitats. Comparações de taxa de cianobactérias modernas com microfósseis pré-cambrianos sustentam a presença inferida de cianobactérias multicelulares antes do GOE, mas o registro fóssil não fornece evidência de taxa multicelular entre as primeiras assembléias fósseis quíntuis em 3,33-3,45 Ga.Agradecimentos. Agradecemos a ajuda deAlan McNally, Jane Coghill, Christy Waterfall, Al Tanner, Da-vide Pisani e Mario dos Reis. Agradecimentos especiais vão para o Cal-lum Wright pelo suporte com as máquinas computacionais de alto nível Bluecrystal. Agradecemos ao Institut Pasteur pelo financiamento da coleção de Cyanobacteria Pas-teur Culture, bem como Thierry Lau-rent e Thérer Coursin pela manutenção de cianobactérias e DNA genômico. Além disso, gostaríamos de agradecer a dois revisores anônimos pelos comentários úteis e pontos de discussão interessantes. Agradecemos ainda mais ao grupo de Paleobiologia da Universidade de Bristol por comentários cuidadosos. O BES gostaria de agradecer à Associação Palaeontológica e a Crispin Little pelo convite para contribuir para o simpósio da 58ª Reunião Anual da Associação em Leeds. O BES foi apoiado pelo SwissNational Fund e é actualmente um membro do European Curie Intra EuropeanFellow (330849). O PCJD foi apoiado pelo Natural Environment Research Council (NE / G016623 / 1), Biotecnologia e Conselho de Pesquisa em Ciências Biológicas (BB / J00538X / 1), RoyalSociety Wolfson Merit Award e Leverhulme Trust ResearchFellowship. O trabalho de sequenciamento foi financiado pelo ‘Black SwanFund’ da Faculdade de Ciências da Universidade de Bristol.
DATA ARCHIVING STATEMENTS 
genomas confirmados neste estudo fazem parte do bio-projetoPRJEB9564 no European Nucleotide Archive (ENA). Dados de oito genomas de cianobactérias estão disponíveis no GenBank e no Microscope: www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/www.genoscope.cns.fr/agc/microscope/ Os dados adicionais para este estudo estão disponíveis no Dryad DigitalRepository: http: // dx.doi.org/10.5061/dryad.h75ht
INFORMAÇÕES DE SUPORTE 
Informações Adicionais de Suporte podem ser encontradas na versão on-line deste artigo: S1 Árvore Filogenética de Máxima Verossimilhança baseada em genes ribossômicos.Fig. S2 Árvore da Máxima Verossimilhança mostrando os números dos nós.Fig. S3 Reconstrução de estado de caractere no nó 69 usando CMMC runs.Fig. S4 Reconstruções do tempo de divergência excluindo a calibração 2.Tabela S1. Taxa de cianobactérias usadas neste estudo.Tabela S2. Taxas de transição anteriores para a reconstrução do estado do caractere, aplicando a inferência bayesiana. Tabela S3. Estados de caráter ancestral reconstruído.Editor. Andrew Smith
REFERENCES