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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA 
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA 
CURSO DE FARMÁCIA E BIOQUÍMICA 
PROFESSOR CARLOS ROBERTO MERLIN 
 
 
 
 
 
 
APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS 
DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA II 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FLORIANÓPOLIS 
SEMESTRE 2009.2 
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Sumário 
 
Normas de trabalho no laboratório de microbiologia............................................ 03 
Aula 1 – Meios de cultura..................................................................................... 04 
Aula 2 – Técnicas de cultivo................................................................................. 06 
Aula 3 – Gram – Gram positiva e Gram negativa................................................. 07 
Aula 4 – Esterilização e Desinfecção....................................................................09 
Aula 5 – Microscopia a fresco.............................................................................. 11 
Aula 6 – Antibiograma.......................................................................................... 12 
Aula 7 – Cocos Gram positivos............................................................................ 13 
Aula 8 – Análise do índice colimétrico da água.................................................... 16 
Aula 9 – Enterobactérias.......................................................................................19 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Normas de trabalho no laboratório de microbiologia 
 
 
1. Deixar os materiais como bolsas, pastas, livros e cadernos na estante, na 
entrada do laboratório, e nunca sobre as bancadas de trabalho; 
2. Usar guarda-pó adequado e limpo; 
3. Lavar as mãos com detergente antes e depois da aula prática. Se for portador 
de algum ferimento nas mãos, não participar das atividades práticas; 
4. Antes de iniciar os procedimentos, identificar os materiais que serão utilizados 
nas análises; 
5. NUNCA pipetar nada com a boca; 
6. Não comer, beber ou fumar no laboratório; 
7. Evitar colocar a mão na boca, olhos e ouvidos durante a aula; 
8. Prender cabelos longos para evitar exposição ao fogo da chama do bico de 
Bunsen; 
9. Nunca aplicar maquiagem e cosméticos ou retirar lentes de contato no 
laboratório; 
10. Avisar o professor em caso de contaminação acidental, ferimentos ou cortes 
ocorridos durante a aula; 
11. Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais os 
deixando sobre a bancada; 
12. Flambar as alças, agulhas e pinças antes e após o uso. 
13. Limpar a bancada após finalizar as análises. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Aula 1 
Meios de Cultura 
 
 
 Meios de Cultura: são substratos adequados ao crescimento, multiplicação e 
desenvolvimento dos microrganismos fora de seu hábitat natural. 
 
 O cultivo dos microrganismos exige que determinadas condições sejam 
atendidas. As exigências nutritivas e ambientais são variáveis com o tipo de 
microrganismo, tornando impossível a produção de um único tipo de meio que 
satisfaça todas as condições de todos os tipos de microrganismos. Por outro 
lado, é difícil e impraticável a formulação de um meio de cultura ideal para 
cada tipo de microrganismo. 
 
 No preparo de um meio de cultura é necessário conhecer as exigências 
nutricionais dos microrganismos. São considerados meios essenciais do meio 
de cultura: 
- Fonte de energia 
- Fonte de Carbono 
- Fonte de Nitrogênio 
- Fatores de crescimento 
- Fonte de minerais 
- Água 
 
 Ainda, além dos nutrientes, o meio de cultura deve suprir algumas condições 
ambientais: 
 - pH 
 - Atmosfera 
 - Pressão osmótica 
 
 Classificação dos meios: 
 
 1. Quanto à origem: 
 
 a) Naturais 
 b) Artificiais 
 
 2. Quanto à composição: 
 
 a) Complexos 
 b) Sintéticos 
 
 3. Quanto ao estado físico: 
 
 a) Líquido 
 5
 b) Semi-sólido 
 c) Sólido 
 
 4. Quanto à finalidade: 
 
 a) Meios Básicos 
 b) Meios Seletivos 
 c) Meios Diferenciais 
 d) Meios de enriquecimento 
 e) Meios enriquecidos 
 f) Meios de manutenção 
 g) Meios de transporte 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Aula 2 
Técnicas de Cultivo 
 
 A inoculação de microrganismos pode ser em: 
 
- Meio líquido 
- Meio sólido 
- Meio semi-sólido 
- Na placa de Petry 
 
 Procedimentos 
 
1. Para repique da placa para meio líquido 
 
 Realizar o trabalho próximo ao bico de Bunsen adotando procedimentos que 
evitem a contaminação; 
 Esterilizar a alça de platina na chama do bico de Bunsen e esfriá-la em tubo 
com água destilada ou próximo à chama (ou no próprio meio de cultura líquido); 
 Flambar os bordos da placa na chama do Bico de Bunsen; 
 Abrir a placa de forma que a tampa fique perpendicular ao fundo; 
 Introduzir a alça de platina na placa, tocando a colônia escolhida; 
 Fechar a placa; 
 Retirar a tampa do tubo com meio de cultura líquido, segurando-o com o dedo 
mínimo; 
 Flambar a boca do tubo e mantê-la próxima ao bico de Bunsen; 
 Introduzir a alça de platina carregada no meio de cultura; 
 Flambar a boca do tubo e recolocar a tampa; 
 Esterilizar a alça de platina e recolocá-la no suporte; 
 Identificar o material e colocar seu nome e turma; 
 Incubar a 37º C; 
 Realizar a leitura. 
 
2. Para repique do meio líquido para o meio inclinado 
 
 Realizar o trabalho próximo ao bico de Bunsen adotando procedimentos que 
evitem a contaminação; 
 Esterilizar a alça de platina na chama do bico de Bunsen e esfriá-la em tubo 
com água destilada ou próximo à chama (ou no próprio meio de cultura líquido); 
 Retirar a tampa do tubo contendo a cultura; 
 Flambar a boca do tubo da cultura e recolocar a tampa; 
 Retirar a tampa do tubo com meio de cultura inclinado; 
 Flambar a boca do tubo e mantê-lo próximo do Bico de Bunsen; 
 Introduzir a alça de platina carregada no meio inclinado; 
 Inocular fazendo estrias na superfície do meio, começando do fundo até 2/3 
do comprimento da superfície; 
 Flambar a boca do tubo e recolocar a tampa; 
 Esterilizar a alça de platina e recolocá-la no suporte; 
 Identificar o material e colocar seu nome e turma; 
 Incubar a 37º C e fazer a leitura. 
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Aula 3 
Gram – Gram positiva e Gram negativa 
 
As bactérias coradas pela técnica de Gram pertencem a duas categorias 
distintas: Gram-positivas e Gram-negativas. As diferenças entre os dois grupos é 
resultado da estrutura de suas paredes celulares, visto que as paredes das células 
Gram-negativas possuem um conteúdo lipídico mais elevado que das Gram 
positivas. 
 
Preparação do esfregaço 
 
1. Material: Bico de Bunsen 
 Meio de Cultura (Meio líquido ou sólido) 
 Lâmina LSD 
 Alça de platina 
 
2. Técnica: 
 a) Esterilizar a alça no Bico de Bunsen 
 b) Esfriar a alça 
 c) Meio líquido: pegar 2 alçadas e colocar sobre a lâmina. 
 Meio sólido: encostar levemente a alça sobre a colônia retirando parte da mesma 
e colocar sobre a lâmina fazendo movimentos circulares. 
d) Reesterilizar a alça no Bico de Bunsen. 
e) Fixar o esfregaço aproximando a lâmina na chama do Bico de Bunsen fazendo 
movimentos lentos, até secagem do mesmo. 
 
Técnica de coloração 
 
1. Colocar a lâmina sobre o suporte que está na pia. 
2. Pingar sobre o esfregaço a solução cristal violeta cobrindo-o 
completamente, deixando durante 1 minuto. Retirar o excesso comum filete 
de água corrente. Os microrganismos adquirem tonalidade azul escura ou 
púrpura. 
3. Recolocar a lâmina sobre o suporte. Cobrir o esfregaço com solução iodo-
iodetada por 1 minuto. Esta solução mordente fixa o cristal violeta produzindo 
um complexo violeta-iodo. 
4. Descoloração: solução de álcool etílico a 95% juntamente com acetona 
(700 mL de álcool + 300 mL de acetona) aplicada por gotejamento até que 
não aja mais desprendimento do corante. As bactérias gram(+) sofrem 
desidratação dos carboidratos das paredes celulares promovendo a retenção 
dos corantes. As gram(-) pela dissolução dos lipídeos, tem a porosidade ou a 
permeabilidade da parede celular aumentada não retendo o corante. 
5. Contraste: solução de fucsina (ou safranina) – corante secundário. Aplicar 
sobre o esfregaço por um período de 30s. Se as células permitem o 
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descoramento pelo álcool, elas fixam a fucsina nesta etapa e parecem 
vermelhas (gram-negativas), caso contrário, permanecem com a cor azul 
escura, sendo chamadas Gram-positivas. 
6. Lavar, secar e observar ao MO com a objetiva de imersão. 
 
Gram +  coram de violeta 
Gram -  coram de vermelho 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 9
Aula 4 
Esterilização e Desinfecção 
 
Esterilização: é o ato ou processo de destruir ou eliminar todas as formas vivas de 
um material, ambiente ou objeto. Este processo inclui os endósporos, que são 
formas de resistência ao meio. Esta pode ser feita através de diferentes processos, 
empregando-se agentes físicos (calor, radiação, filtração, gases) e agentes 
químicos. Os métodos mais utilizados são: 
 
 Calor úmido 
- Autoclavação: desnaturação de proteína 
- Vapor fluente: desnaturação de proteínas 
- Tindalização: desnaturação de proteínas 
 Calor seco 
- Fornos (forno de Pasteur): oxidação 
- Flambagem: oxidação 
- Incineração: oxidação 
 Radiação ionizante 
- Radiação gama: destruição de DNA – forma radicais superativos. 
 Radiação não-ionizante 
- Lâmpada UV: altera DNA, através da formação de dímeros. 
 Filtração 
 Gases: óxido de etileno – Alquilação direta dos grupos carboxilas, hidroxilas e 
sulfidrilas, inativando enzimas. 
 Glutaraldeído 
 
Desinfecção: é definida como a eliminação dos microrganismos presentes, capaz 
de transmitir infecção, patógenos, portanto, em um determinado meio e/ou ambiente, 
através de um agente desinfetante, reduzindo ou inibindo o crescimento, sendo que, 
estes podem ser divididos em 3 grupos: agentes químicos, físicos ou 
quimioterápicos. Para que possamos atingir uma desinfecção correta, deve ser 
observado a concentração do produto, as condições do ambiente e o tempo de 
exposição do mesmo. 
 Grupamentos químicos: álcool, aldeídos e derivados, fenóis e derivados, 
halogênios e derivados, ácidos inorgânicos e orgânicos, agentes de 
superfície, biguanidas e agentes oxidantes. 
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Anti-sepsia: Diminuição ou inibição do crescimento de agentes patógenos e outros 
microrganismos que estão presentes nos tecidos vivos. 
 
Assepsia: Ausência de microrganismos em um determinado meio e/ou ambiente 
com utilização de técnicas assépticas apropriadas. 
 
Bacteriostase: Inibição do crescimento bacteriano. 
Degermação: remoção do microrganismo da pele através de técnica mecânica ou 
uso de antisépticos. 
Baixas Temperaturas: efeito microbiostático, onde ocorre a interrupção do 
metabolismo. Ex. geladeira, congelador, nitrogênio líquido. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Aula 5 
Microscopia a fresco 
 
Duas técnicas em geral são empregadas em preparações microscópicas: 
preparações a fresco e preparações fixadas e coradas. A preparação a fresco 
permite o exame de organismos nas condições normais de vida e são 
preferencialmente utilizadas: 
 
 Quando a morfologia da célula pode estar danificada em preparações fixadas 
e coradas; 
 Durante a verificação da mobilidade; 
 Observações de processos fisiológicos; 
 Observação de corpúsculos (vacúolos e material graxo). 
 
Ainda, as preparações a fresco podem ser realizadas com ou sem coloração e 
podem ser realizadas de acordo com as seguintes técnicas: 
 
1. Entre lâmina e lamínula: 
 
1.1 Bactérias cultivadas em meio líquido podem ser avaliadas, colocando-se, 
com uma alça de platina esterilizada, uma gotícula da cultura no centro da 
lâmina, recobrindo-a com lamínula. 
1.2 Para culturas filamentosas, o procedimento denomina-se “entre lâmina e 
lamínula comprimida”. É retirado um pequeno fragmento da cultura em meio 
sólido, que é comprimido entre lâmina e lamínula. 
 
2. Técnica da Gota Pendente: método mais seguro que o anterior leva à 
diminuição no tempo de observação e a conclusões errôneas, particularmente 
em relação à mobilidade bacteriana. 
 
2.1 Procedimento: Untar a borda de uma lâmina escavada com vaselina. 
Transferir uma gotícula da cultura líquida para o centro de uma lamínula, e 
em seguida unir a lâmina e a lamínula. Examinar ao MO no aumento de 40x 
para observar o movimento próprio ou direcional, além do movimento 
brawniano dos microrganismos, sem esquecer de diminuir a intensidade de 
luz. 
 
 12
Aula 6 
Antibiograma 
 
 
A descoberta dos antibióticos foi acompanhada pelo desenvolvimento de 
técnicas de laboratório que permitiam verificar in vitro seu espectro antimicrobiano. 
Esses métodos demonstraram que bactérias da mesma espécie, mas de diferentes 
linhagens, podiam se comportar de modo distinto ante a um mesmo antibiótico. 
Antibiograma é a determinação in vitro da resistência ou sensibilidade de 
uma bactéria a um ou vários antibióticos, a qual pode ser realizada, também, para 
determinar o espectro antimicrobiano de um novo antibiótico. Ressalta-se, que com 
este teste apenas é possível ver qual o melhor antimicrobiano para ser usado na 
terapêutica, e não qual a sua dose ideal. 
A susceptibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como 
sensível, intermediário ou resistente, ou quantitativamente em termos de MIC 
(minimun inhibitory cincentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration). 
 
1. Teste quantitativo de sensibilidade aos antimicrobianos: Método da 
diluição  Consiste em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em 
meio sólido ou líquido e em seguida semear a bactéria em estudo. Após 
incubação determina-se o MIC ou MBC. 
2. Método de difusão de Bawer e Kirby modificado  neste teste discos de 
papel impregnados com o antibiótico são colocados na superfície do ágar 
uniformemente e antecipadamente semeado com o microrganismo. A droga 
se difunde no ágar. Caso ocorra inibição no crescimento do agente sensível, 
formará um halo em torno do disco de antibiótico, que deve ser medido pelo 
seu diâmetro em mm, e comparado com tabelas padronizadas. 
 
Meio de cultura utilizado: geralmente utiliza-se o meio Müller-Hinton, um meio 
enriquecedor e com ausência de substâncias antagônicas. 
Inoculação: saturar um swab de algodão com a suspensão bacteriana, remover o 
excesso de umidade girando o swab contra a parede do tubo. Semear a suspensão 
sobre a superfície estéril do ágar, em 3 direções para obter um inoculo uniforme, 
evitando que qualquer superfície do ágar fique isenta do inócuo. Em seguida colocar 
os discos de antibióticos na superfície do Agar inoculado. Incubar as placas por 24 h 
a 35 – 37º C. 
 13
Aula 7 
Cocos Gram positivos 
 
 
A identificação bacteriana dá-se pela observação das espécies. Para essa 
identificação, devem ser observadas característicasmorfológicas, fisiológicas, 
bioquímicas, sorológicas, genéticas e de patogenicidade das bactérias. Para 
obtenção de algumas dessas informações usam-se recursos como testes 
bioquímicos, além da observação de colônias e de preparações microscópicas 
realizadas a partir desses. 
Em um esfregaço corado pelo método de Gram, as células bacterianas 
apresentam-se coradas em roxo (ou azul), sendo que Staphylococcus ficam 
agrupados em cachos ou arranjos irregulares e os Streptococcus em cadeias ou aos 
pares. 
 
Meios: Caldo 
 Caldo simples nutriente 
 Ágar sangue 
 
Teste de diferenciação entre gêneros: as informações obtidas pela bacterioscopia 
pelo método de Gram e das características de crescimento em meio ágar sangue, 
normalmente são suficientes para distinguir os gêneros. Em caso de dúvida, é 
possível diferenciar os gêneros Streptococcus e Staphylococcus através do teste da 
catalase. Staphylococcus, ao contrário de Streptococcus, produzem esta essa 
enzima. 
Procedimento: em um tubo de ensaio com solução fisiológica colocar uma pequena 
quantidade da colônia formando uma suspensão bacteriana que será utilizada no 
teste, e, em seguida adicionar Peróxido de Hidrogênio (H2O2). 
Resultado: Se houver o aparecimento de bolhas gasosas ou efervescência 
contínua indicam resultado positivo para o gênero Staphylococcus. 
 
Tipos de Hemólise : 
 - Hemólise parcial 
 - Hemólise total 
 - Não apresenta hemólise 
 
Uma vez identificado o gênero Staphylococcus, a diferenciação entre as 3 
espécies é feita através de 2 testes: a pesquisa da enzima coagulase e a 
resistência a novobiocina. As características das colônias também podem ajudar na 
 14
diferenciação, uma vez que somente a espécie S. aureus pode produzir hemólise 
em meio ágar sangue, e apresentar colônias de coloração variando do branco ao 
amarelo fraco. 
 
 
Gênero Staphylococcus: S. aureus   - hemolítico (Staphylococcus coagulase +) 
 S. epidermidis  (Staphylococcus coagulase -) 
 S. saprophyticus  (Staphylococcus coagulase -) 
 
Teste da coagulase: consiste em verificar a coagulação do plasma, através da ação 
enzimática ou da aglutinação de bactérias. 
Esta técnica pode ser feita em lâmina ou em Tubo 
 
Teste da Novobiocina: para diferenciar S. epidermidis e S. saprophyticus, já que S. 
epidermidis é sensível a nova biocina e S. saprophyticus é resistente. Um halo de 
inibição inferior a 16 mm caracteriza resistência. 
Procedimento: com um swab embebido em suspensão bacteriana, semeia-se uma 
placa contendo meio ágar nutriente, em 3 sentidos evitando deixar qualquer 
superfície do meio sem ser semeado. Com a utilização de uma pinça previamente 
aquecida pegar o disco de novobiocina e colocar no centro da placa dando um leve 
aperto no disco para que se fixe bem na superfície do meio evitando que ao virar a 
placa o mesmo caia na tampa, e, incubar a 37º C por 24h. 
 
Gênero Streptococcus: S. pyogenes   - hemolítico 
 S. pneumoniae   - hemolítico 
 
 2. Identificação de espécies de Streptococcus 
Os Streptococcus provocam hemólise em meio ágar-sangue. De acordo com 
o tipo de hemólise, podem ser classificados em: 
 - hemolíticos  hemólise parcial 
 - hemolíticos  hemólise total 
 - hemolíticos  não apresentam hemólise 
 
 
Gênero Streptococcus: S. pyogenes   - hemolítico 
 S. pneumoniae   - hemolítico 
 - hemolíticos  crescem formando colônias circulares, circundadas por uma zona 
marrom-esverdeada. 
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 - hemolíticos  provocam aparecimento de uma zona clara ao redor da colônia. 
Lancefield dividiu esses microrganismos em grupos sorológicos de A a V. Os 
estreptococos isolados com maior freqüência são do grupo A, B, C e G. Para a 
diferenciação dos grupos A e B, 2 testes podem ser realizados: 
 
Teste da sensibilidade à bacitracina: o grupo A é inibido por baixas concentrações 
de bacitracina. Adicionam-se discos de bacitracina sobre a superfície do ágar 
previamente semeado com a suspensão bacteriana a ser testada, incubando a 37º C 
por 24h a 48h. Qualquer halo de inibição caracteriza sensibilidade ao antibiótico. 
 
Prova do fator CAMP: a proteína CAMP é produzida apenas pelos microrganismos 
do grupo B. Em uma placa é semeado horizontalmente uma linhagem de 
Staphylococcus aureus que sabidamente produz  - hemolisina. Perpendicularmente 
a esta linha de semeadura, semeiam-se amostras de Streptococcus a serem 
testadas. As duas estrias devem ficar próximas, no entanto sem se tocarem. Incuba-
se por 18/24 h a 37º C. A proteína CAMP liberada pelo grupo B ira lisar as hemácias 
sensibilizadas pela - lisina estafilocócica. A ação sinérgica entre a proteína CAMP e 
a - lisina formará uma área de hemólise em forma de seta que indica teste positivo. 
 
Grupo Hemólise Bacitracina CAMP 
A  S Negativo 
B  R Positivo 
C  R Negativo 
D   R Negativo 
Enterococo   R Negativo 
Pneumococo  V Negativo 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 16
Aula 8 
Análise do índice colimétrico da água 
 
 
 
A avaliação da qualidade microbiológica da água, seja ela para qualquer fim, 
é de extrema importância. No caso do Brasil, as análises são feitas adotando os 
procedimentos do Standard methods for examination of water and wastewater, da 
American Public Health Association (APHA), podendo estas serem qualitativas ou 
quantitativas. 
 
1. Contagem de bactérias 
Água com altas populações de microrganismos tem maiores possibilidades de 
conter organismos patogênicos, podendo indicar também, um alto conteúdo 
orgânico. Água de boa qualidade para consumo deve ter populações de bactérias 
inferiores a 100 UFC/mL. 
Procedimento 
 Preparar diluição seriada. 
 
 
 Inocular 3 placas com 1 mL, das diluições escolhidas; 
 Verter nas placas 20 mL do meio ágar triptona glicose extrato de levedura 
fundido e resfriado a +/- 50ºC; 
 Misturar e deixar solidificar, identificando as placas com as respectivas 
diluições; 
 Inverter a placa e incubar a 35ºC por 48h; 
 Escolher para a contagem placas que tenham entre 30 e 300 colônias. 
 Fazer o cálculo 
 Nº de UFC/mL = médias das contagens das placas x diluição. 
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2. Pesquisa de coliformes 
No que diz respeito à potabilidade, o aspecto mais importante é o caráter 
qualitativo da população. A maioria das doenças veiculadas pelas águas tem sua 
origem na contaminação fecal, como é o caso da shigelose, hepatite A, rotavírus, 
giardíase, entre outras. Como a liberação dos microrganismos algumas vezes pode 
ser em pequenas quantidades ou de forma descontínua, seria impossível avaliar a 
presença de todos eles em uma amostra de água. Por isso, escolheu-se um 
microrganismo que indicasse a contaminação patogênica, a Escherichia coli. Ela é 
constante no intestino humano e no dos animais de sangue quente, é abundante nas 
fezes, cresce facilmente em meios de cultura e vive bastante tempo na água. No 
entanto, apresenta baixa resistência à cloração e menor viabilidade na água do mar. 
A Escherichia coli faz parte do grupo de microrganismos denominados coliformes, 
constituindo 95% dos coliformes nas fezes. 
Além da potabilidade, a qualidade microbiológica da água é que vai decidir 
sobre seus possíveis usos. 
 
2.1 Pesquisa de Coliformes totais: baseada nas características do grupo 
bastonete Gram-negativo, que produz ácido e gás através da lactose. 
 
2.1.1 Teste Presuntivo: neste teste, presume-se que os microrganismos que 
crescem produzemgás a partir de lactose sejam coliformes. 
 
Procedimento para análises diversas 
 Inocular com 10 mL da amostra 5 tubos contendo 10 mL de caldo lauryl 
triptose concentrado e tubinhos de Durham invertidos; 
 Inocular com 1 mL da amostra 5 tubos contendo 10 mL de caldo lauryl 
triptose e tubinhos de Durham invertidos; 
 Inocular com 0,1 mL da amostra 5 tubos contendo 10 mL de caldo lauryl 
triptose e tubinhos de Durham invertidos; 
 Incubar a 37º C por 24 h; 
 Fazer a leitura, anotando a centena encontrada. NÃO misturar os tubos. 
 Reincubar os tubos negativos; 
 Fazer nova leitura. 
 Usar a tabela para verificar o número mais provável de coliformes por 100 mL. 
 
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2.1.2 Teste confirmativo: inocular uma alíquota de cada tubo positivo do teste 
anterior em caldo lactosado bile e verde brilhante. Os sais de bile inibem o 
crescimento de bactérias não-entéricas e o verde brilhante de bactérias Gram-
positivos, selecionando, assim, os coliformes. 
Procedimento 
 Após o teste presuntivo, transferir com uma alça de platina uma alíquota de 
cada tubo positivo para tubos contendo caldo lactosado bile verde brilhante e 
tubinhos de Durham invertidos; 
 Incubar a 37º C por até 48 h; 
 Fazer a leitura, obedecendo a centena. Os positivos apresentam gás; 
 Usar a tabela para verificar o número mais provável de coliformes por 100 mL. 
 
2.2 Pesquisa de Coliformes Fecais: como os coliformes fecais têm em seu 
ambiente natural temperaturas mais elevadas, podem assim ser diferenciados dos 
coliformes totais. 
Procedimento 
 Após a leitura do teste presuntivo, transferir com a alça de platina uma porção 
de cada tubo positivo para tubos contendo Caldo EC (Escherichia coli) e 
tubinhos de Durham; 
 Incubar a 44ºC por 24 h; 
 Fazer a leitura. Os tubos com presença de gás são positivos. 
 Usar a tabela para verificar o número mais provável de coliformes por 100 mL. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 19
Aula 9 
Enterobactérias 
 
 
Esta família compreende cerca de 80% de todos os bacilos gram-negativos 
isolados no laboratório clínico, sendo que os demais bacilos Gram-negativos 
isolados constituem o grupo das chamadas bactérias não-fermentadoras. 
Enterobactérias são bacilos Gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios 
facultativos, não esporulados, de crescimento rápido que formam colônias distintas 
em meio seletivo indicador, dependendo da sua capacidade metabólica e dos 
componentes do meio. Tem como hábitat o intestino grosso, mas também são 
encontradas fazendo infecção no trato urinário, pulmões, ouvidos, etc. Todas 
fermentam glicose, reduzem o nitrato a nitrito e são citocromo oxidase 
negativas. Alguns gêneros são sempre patogênicos, outros fazem parte da flora 
normal intestinal, porém se inoculadas em outros locais tais como líquor, peritônio e 
pulmões de imunodeprimidos podem causar doenças. 
 
 Semeadura nos meios SS, MC e Teague. 
1. Meio Salmonella-Shigella (SS): meio diferencial empregado para isolar Salmonella 
e Shigella a partir de fezes, urina e alimentos frescos ou enlatados. 
- As bactérias Gram + são inibidas por uma mistura de sais biliares. 
- Shigella e a maioria das enterobactérias formam colônias claras e incolores ou 
transparentes. 
- E. coli formam colônias pequenas, que vão de rosa a vermelho. 
- Algumas Salmonellas formam colônias incolores, transparentes com centro negro 
(H2S). 
 
2. Meio Conkey (MC): meio amplamente utilizado para isolar e identificar 
seletivamente enterobactérias em amostras biológicas, água, esgoto e alimentos. 
- A mistura de sais biliares inibe Gram +. 
- E. coli - colônias vermelhas ou rosadas, devido a fermentação da lactose  a 
diminuição do pH pode fazer com que os meios fiquem rodeados por um precipitado 
de sais biliares. 
- Salmonella – colônias incolores, do transparente ao âmbar. 
- Shigella – colônias incolores, transparentes ou levemente rosadas. 
 
 20
3. Meio Teague (EAM): eosina azul de metileno: meio utilizado para isolamento e 
diferenciação de enterobactérias. Promove uma distinta diferenciação entre as 
colônias de microrganismos fermentadores de lactose e os que não fermentam 
lactose. 
- O meio é ligeiramente inibidor para Gram +. 
- E. coli – colônias elevadas de 2 a 3 mm de diâmetro. Apresentam um centro azul-
negro com borda estreita e clara, e brilho azul metálico azul esverdeado à luz 
refletida (algumas linhagens podem não ter brilho). 
- Salmonella e Shigella – colônias ligeiramente elevadas de 1 a 2 mm de diâmetro, 
transparentes, desde incolor até âmbar. 
A partir de colônias características e isoladas deste meio, inocular no meio 
TSI (Tríplice Sugar Iron) com agulha de níquel cromo, por estria de esgotamento e 
em profundidade. 
 
Meio TSI (ágar ferro tríplice açúcar – glicose, sacarose e lactose): é um meio 
diferencial, recomendado para identificação de bacilos entéricos, baseado na 
fermentação da glicose, lactose e sacarose e na produção de sulfeto hidrogênio 
(H2S). 
Leitura do TSI 
Local Cor Significado 
 Vermelho forte Reação alcalina 
 Vermelho claro Reação neutra 
Ápice e/ou base Amarelo Reação ácida 
 Amarelo e bolhas Formação de gás 
 Preta Produção H2S 
 
Interpretação 
Ápice e base amarela = glicose (+); lactose e/ou sacarose (+). 
Ápice vermelho e base amarela = glicose (+); lactose e/ou sacarose (-). 
Ápice e base vermelho = glicose, sacarose e lactose (-). 
 
 
TSI Salmonella Shigella E.coli 
Lactose - - + 
Sacarose - - + 
Glicose + + + 
Gás + - + 
H2S + - - 
 
 
 21
Provas de Identificação – Testes Bioquímicos 
 
Indol: verificar se a bactéria tem ou não a enzima triptofanase. 
 
 triptofanase 
Caldo triptofano -----------------------------------> indol + amônia ác. Pirúvico 
 
Interpretação: reativo de Erlich (na parede do tubo) em presença do indol forma um 
complexo de vermelha 
 vermelho (+) 
 sem alteração na cor (-) 
 
 
 
Nitrato: verificar a presença da enzima nitrito redutase 
 
 Nirtato redutor 
Nitrato (NO3) -------------------------------------------> Nitrito (NO2) 
 
Reativo de Gries Ilosvay  Reativo A: ác. Sulfanílico 
 Reativo B: ác. Naftilamina 
 
Interpretação: teste positivo – precipitado vermelho-tijolo 
 teste negativo – sem alteração de cor 
 
 
Citrato: verificar se o citrato é utilizado como única fonte de carbono 
 
Interpretação: teste positivo – azul 
 teste negativo – verde 
 
 
Malonato: verificar se o malonato é utilizado como única fonte de carbono 
 
Interpretação: teste positivo – azul 
 teste negativo – verde 
 
 
Uréia: verificar a presença da enzima uréase 
 
 urease 
uréia -----------------------------> amônia 
 
Interpretação: teste positivo – vermelho ou rosa 
 teste negativo – amarelo 
 
 
Fermentação de Carboidratos: determina a capacidade de um microrganismo de 
fermentar a glicose incorporada a um meio base, produzindo ácido ou ácido com 
gás. 
 
 22
 
Glicose 
Lactose ácidos ou 
Sacarose Maltose ácidos com gás 
Manitol 
 
 formiase 
Glicose -----> ác. Pirúvico ----> ác. Fórmico ------------------------> H2 + CO2 
 
 
Glicose 
 
 
Glicose 6P 
 
 
Frutose 6PFrutose 1,6 PP Ac, propiônico 
 
 
 Gliceraldeído 3P Ac. Succínico 
 
 
Ac. Pirúvico 
 
 
 Ac. Lático Acetaldeído 
 
 
 Álcool etílico 
 
 
 
Lisina: verificar a presença da enzima lisina carboxilase 
 
 enzimas 
Glicose --------------------> ácidos (baixa do pH – coloração amarela (-)) 
 
 enzimas 
Lisina ---------------------> cadaverina (diamina) + CO2 (aumenta pH – coloração 
roxa(+)) 
 
 
Vermelho de Metila: testa a capacidade de um microrganismo em produzir ácidos 
orgânicos relativamente estáveis, a partir da fermentação da glicose. 
 
 23
 
 ácido láctico 
 enzimas ácido acético 
Glicose ----------------------------> ácido fórmico pH 4,5 
 ácido succínico 
 ácido etílico 
 
Reagente: solução hidroalcóolica de vermelho de metila (5 gotas) 
Interpretação: teste positivo – vermelho 
 teste negativo – amarelo 
 
 
Vogues Proskauer: determina a capacidade de um microrganismo em produzir um 
composto nitrogenado neutro, o acetilmetilcarbinol (acetoína), a partir da 
fermentação da glicose. 
 
Glicose 
 
 
2 ác. pirúvico 
 
 
Acetilmetilcarbinol (acetoína) 
 
 0,6 mL de alfa-naftol + 0,2 mL de KOH 
40% 
 
 Diacetila + núclea guanidina 
 
 
 Composto vermelho 
 
Interpretação: teste positivo – rosa a vermelho 
 teste negativo – cobre 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 24
 
Provas Salmonella Shigella E. coli 
 
Indol + - - 
Nitrati + + + 
Citrato - - + 
Malonato - - - 
Uréia - - - 
Glicose + + + 
Lactose - - + 
Sacarose - - + 
Maltose + V + 
Manitol + + + 
Lisina + - + 
VM + + + 
VP - - - 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Referências Bibliográficas 
 
 
MURRAY, P.R. et al. Microbiologia médica. 5 ed. Guanabara Koogan, Rio de 
Janeiro, 2006. 
 
PELCZAR, M. J. et al. Microbiologia: conceitos e aplicações. V. 1 e 2. 2 ed. 
Pearson, 2005. 
 
SILVA FILHO, Germano Nunes; OLIVEIRA, Veturia Lopes de. Microbiologia: 
manual de aulas práticas. 2. ed. rev. Florianópolis: Ed. da UFSC, 2007. 157p. 
 
TRABULSI, L. R. Microbiologia 5 ed. Ateneu, 2008