PCR - Reação em Cadeia da Polimerase

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1. Quais são os componentes químicos de um PCR? E a função de cada um?
Dna-polimerase: A mais usada é a taq-polimerase; é a catalisadora da extensão dos primer, aumento na sua concentração pode resultar na diminuição da sua especificidade.
Solução tampão : Basicamente esta solução contém íons diverso( Na, Cl, K entre outros) que otimizam as condições de reação.
MgCl : Doador muito estável de íons de Mg, que são cofatores indispensáveis para a atividade da enzima.
DNTP: Desequilibrio das misturas de dNTP reduz a fidelidade da Taq. O dNTP reduz o Mg livre, interferindo assim com a atividade da polimerase e diminuindo o anelamento do primer.
2. Quais são as etapas do PCR? Explique cada uma delas.
O procedimento de PCR envolve três etapas, cada uma repetida muitas vezes.
1 – Desnaturação O DNA genômico contendo a sequência a ser amplificada é desnaturado por aquecimento a cerca de 95°C por cerca de 30 segundos. A dupla fita é aberta (desnaturada), tornando-se uma fita única.
2 – Anelamento ou hibridização Após a separação das fitas, um par de iniciadores ou primers (uma fita de DNA específica para o gene que se quer estudar) complementam a fita oposta da sequência de DNA a ser amplificada. Ou seja, um deles é complementar à sequência em uma fita da dupla-hélice de DNA e o outro é complementar à sequência na outra fita. O molde é determinado pela posição dos iniciadores que se anelam a fita. Essa etapa ocorre a uma temperatura de 60°C. 
3 – Extensão ou polimerização Com o molde já identificado, a enzima DNA-polimerase adiciona as bases complementares, formando uma nova fita e então tem-se novamente a duplicação da fita de DNA. Esse processo acontece a uma temperatura de 72°C.
3. Faça uma analogia entre o PCR realizado “in vitro” e a duplicação de DNA realizada fisiologicamente.
- qual procedimento limita o inicio e o final de um gene – “semelhante ao inicio e término da forquilha de replicação”?
- como que eu separo as fitas duplas de DNA? – semelhante à helicase.
- se eu não tenho a primase para adicionar os primers como eles são alinhados? De onde esses são obtidos?
- como que eu resolvo a questão do PCR não ter os fragmentos de Okazaki para realizar a duplicação da fita descontinua?
- de onde eu obtenho os d-nucleotídeos? Para realizar a polimerização da fita?
4. Dê um exemplo prático e explique como eu uso a técnica de PCR.
A PCR ou Reação em Cadeia da Polimerase é uma técnica utilizada diariamente nos laboratórios e possibilita a amplificação de um dado fragmento da amostra de DNA inicial de forma exponencial. Graças ela, um teste genético pode ser iniciado a partir de uma única célula, pois o DNA será́ multiplicado in vitro em quantidade suficiente para ser detectado no teste. Assim, pequenas quantidades de amostras recolhidas a partir de uma cena de crime podem ser comparadas com o DNA de outras pessoas, identificando ou descartando suspeitos durante uma investigação.