Aula Vibrio, Yersinia e Cronobacter Prof Uelinton (1)

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Cronobacter 
Prof. Uelinton Pinto
FoRC - Food Research Center 
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
Universidade de São Paulo
uelintonpinto@usp.br
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Cronobacter
Um patógeno emergente (oportunista)
Família Enterobacteriaceae
G-; oxidase negativa, bacilos móveis
Não halofílicos
Facultativos 
Temperatura de crescimento de 6 a 45C
Sobrevive longos períodos em baixa aW
Origem parece ser ambiental
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Cronobacter
Infecção em neonatos por fórmula reconstituída
Enterocolite necrotizante
Septicemia 
Meningite 
Grupo sob risco – crianças menores que 1 ano de idade (maior risco para menores que 2 meses); imunocomprometidos
Tratamento com antibióticos
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Forma de contaminação
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Recomendações
Refrigerar fórmulas infantis reconstituídas (FIR) a 4°C em até 1 hora da preparação
Esterilizar água para preparação de FIR
Descartar sobras de FIR
Preparar pequenos volumes para diminuir o tempo a temperatura ambiente
Utilizar fórmula aquecida em até 20 min
Refrigerar leite materno a 4°C
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Critério microbiológico para FIR 
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Yersinia 
Prof. Uelinton Pinto
FoRC - Food Research Center 
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
Universidade de São Paulo
uelintonpinto@usp.br
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Yersinia
Causador de infecção gastrintestinal em países nórdicos
13 espécies reconhecidas
4 importantes 
Y. enterocolitica - gastroenterite
Y. pestis (peste bubônica)
Y. pseudotuberculosis (patógeno de roedores)
Y. ruckerii (doença em peixe da familia do salmão e outros pescados de água doce) 
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Yersinia
Família Enterobacteriaceae
G-; oxidase negativo; bacilos facultativos que fermentam glicose.
Psicrotróficos 
Temperatura ótima de 28 a 30°C
pH de 4 a 10 (ótimo 7.6)
Tolera ambiente alcalino melhor do que ácido
Facilmente inativados por pasteurização (72°C por 18 s)
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Yersinia enterocolitica
Biotipos
1A, 1B, 2, 3, 4, 5
1B mais frequente nos EUA
+patogênico
2 – 5
Patogenicidade intermediária
4 o mais frequente em gastroenterite
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Reservatórios
Zoonótico (animais domésticos)
Suínos 
Cavidade oral:
Língua, amigdalas ou tonsilas e nódulos linfáticos no submaxilar; 
Intestino e fezes
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Características da Enfermidade
Dose infecciosa
Desconhecida
Estimado ser maior que 104 UFC
Período de incubação
Desconhecido
Estimado
2-11 dias
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Características da Enfermidade
Incidência baixa 
Manifestações
Diarreia (gastrenterite), especialmente em crianças
Enterocolite
Pseudoapendicite em alguns casos – inflamação aguda do íleo terminal ou dos nódulos mesentéricos linfoides
Faringite 
Sequelas em poucos casos (artrite e outros)
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Mecanismo de patogenicidade
Invasão (invasina)
Fimbrias 
Enterotoxinas 
LPS
Plasmídeo de virulência (pYV)
Yops – Yersinia outer proteins
T3SS
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Surtos
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Vibrio
Prof. Uelinton Pinto
FoRC - Food Research Center 
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
Universidade de São Paulo
uelintonpinto@usp.br
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Vibrionaceae 
Vibrio
Aeromonas
Plesiomonas 
Photobacterium 
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Gênero Vibrio
>80 espécies descritas
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cholerae
parahaemolyticus
vulnificus
alginolyticus
mimicus
fluvialis
furnisii
hollisae
metschnikovii
damsela
cincinnatiensis
carchariae
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Características do gênero
Bacilos Gram (-);
Não formadores de esporo; 
Retos ou curvos;
Móveis – único flagelo polar;
Anaeróbios facultativos;
Produtores de oxidase e catalase;
Fermentam Glicose s/ produção de gás
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Características bioquímicas 
Teste de Oxidase;
Utilização de Sacarose em agar TCBS (Tiossulfato Citrato Bile Sacarose);
Teste de halofilia em ≠ [NaCl]
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Reservatórios
São organismos aquáticos
Ambiente marinho:
Regiões costeiras;
Regiões de estuários (mais abundante); 
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Influência dos fatores físicos-químicos
Temperatura
Refrigeração: sensíveis a baixas temperaturas;
Temperaturas de refrigeração impedem a multiplicação
Pescados: protegem
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Influência dos fatores físicos-químicos
Temperatura
Aquecimento: termo-sensíveis
Recomendação FDA: Ostras, mexilhões e mariscos 
 Vapor: 4 e 9 min
Fritura de ostra sem a concha: 10m a 191oC
Assar: 10 m 232oC
Aquecimento de moluscos a T interna de 60oC por alguns mins 
Elimina vibrios patogênicos
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Influência dos fatores físicos-químicos
pH:
Altamente sensíveis a pH ácido
Crescem em pH de 4,8 a 11;
pH ótimo entre 7,5 a 8,6;
Efeito bactericida:
Ácidos orgânicos e conservantes ácidos;
Óleos essenciais;
Extratos de especiarias
Diacetil em ostras (Vibrio vulnificus);
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Influência dos fatores físicos-químicos sobre Vibrios
Depuração
Baixa eficiência para condições naturais;
Eficaz em estudos com contaminação artificial
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Influência dos fatores físicos-químicos sobre Vibrios
Irradiação:
Valores D10 oscilam entre 0,02 e 0,4 kGy;
Ostras: Dose de 2kGy (raios ) reduz a níveis não detectáveis a população de Vibrio;
Ostras: Dose de 1kGy reduz 5 log de Vibrio vulnificus sem causar mortalidade nas ostras;
Camarão: Dose de 3kGy (fonte de raios ) reduz a níveis não detectáveis a população de Vibrio;
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Influência dos fatores físicos-químicos sobre Vibrios
Alta Pressão Hidrostática
Ostras:
250 MPa/ 2min → reduz + 5 log de Vibrio vulnificus
300 MPa/3 min → reduz 5 log de V. parahaemolyticus O3:K6
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Sistema digestivo humano
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Vibrio spp. e síndromes clínicas
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Vibrio cholerae
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Vibrio cholerae
Classificação:
Sorogrupos (~200)
V. cholerae O1
biotipos
Clássico (mais severo)
EL Tor 
sorotipos
Ogawa
Inaba
Hikojima
V. cholerae O139 Bengala (1993) 
V. cholerae não-O1/não O139 – gastroenterite moderada
ctxa ctxb
TCP
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Ogawa e Inaba são mais comuns
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Vibrio cholerae
Limites de crescimento:
Temperatura:
Ótima: 37ºC
Faixa: de 10 a 44ºC;
D60ºC = 2,65 mim
pH:
Ótimo: 7,6
Faixa: de 5,0 a 9,7
NaCl:
Faixa: de 0 a 4%
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Vibrio cholerae
Reservatório
Ambiente marinho  microbiota natural;
Humanos e animais;
Água contaminada;
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Vibrio cholerae
Veículos
Água
Alimentos com pH ~neutro:
Mariscos
Peixe cru
Água
Lula
Em alguns casos arroz, frutas e vegetais
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Vibrio cholerae
Cólera:
Reconhecida em 1817;
Estudada em 1854 por John Snow  Água;
Países em desenvolvimento  água e alimentos contaminados;
Países desenvolvidos  alimentos contaminados;
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www.youtube.com/watch?v=753XHXPLrn4
https://www.youtube.com/watch?v=ne1KZYO3jp8 
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Vibrio cholerae
Casos de cólera:
Américas (1991-2001):
 + 1 milhão de casos c/ 12.700 mortes (OPAS);
No Brasil (1991-2001):
168.598 casos  2037 óbitos (OPAS);
No Brasil (2002-2004):
 21 casos  nenhuma morte (SVS-MS).
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Vibrio cholerae
Casos de cólera
Haiti (2010)
Início
Outubro de 2010 (10 meses após o terremoto)
665 mil casos – 8,183 mortes
Vibrio cholerae O1 Ogawa, El tor
Perfil genético semelhante a estirpe encontrada no Sul da Ásia e diferente da estirpe da América do Sul de 1991.
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Vibrio cholerae
Casos de cólera
México (2013)
Início
Setembro 2013
184 casos em novembro 2013 – 1 óbito
Vibrio cholerae O1 Ogawa 
Perfil genético semelhante ao do isolado circulando na República Dominicana e Haiti
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Vibrio cholerae
Maioria dos casos  sintomas suaves ou mesmo assintomáticos
Portador por longo período é raro
Não é importante na transmissão
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Vibrio cholerae
Período de incubação: 6h a 5 dias
Gastroenterite: V. cholerae não O1 e não O139
Geralmente de severidade moderada
Sintomatologia
Diarreia, as vezes com sangue
Cólicas abdominais
Febre
Náusea e vômito em alguns
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Vibrio cholerae
Período de incubação: 6h a 5 dias
Dependente em parte do tamanho do inóculo
Sintomatologia V. cholerae O1 e O139
Início repentino com diarreia aquosa 
Ou
Desconforto abdominal
Perda de apetite
Diarreia simples
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Vibrio choleraeForma severa da doença (500 a 1000 ml/h) (Cólera gravis)
Diarreia desidratante, explosiva e potencialmente fatal
Minoria dos casos com V. cholerae O1/O139 produtor de CT
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Vibrio cholerae
Forma severa da doença (500 a 1000 ml/h)
Quadro de taquicardia, hipotensão, colapso vascular

Turgor da pele afetado (mãos e pés enrugados)
 
Ausência de pulso

Óbito
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Vibrio cholerae
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Vibrio cholerae
Dose infecciosa:
Dependente de fatores do hospedeiro:
1011 UFC/mL em salina tamponada (pH 7,2) 	diarreia em voluntários
106 UFC/g (peixe ou arroz) diarreia
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Vibrio cholerae
Mecanismos de virulência:
Toxina da cólera (CT) -Exotoxina:
Secretada no lumen do ID
1 subunidade A 
5 subunidades B
TCP – pilus co-regula toxina
Fator de colonização de V. cholerae
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CT secretada no lumen do ID e se liga aos gangliosídeos GM1 nos enterócitos via subunide B. CT é endocitada e transportada ao cp. de Golgi, liberando A1 ativada. Intoxicação envolve a ribosilação de ADP do componente da proteina G da adenil-ciclase (AC) resultando no aumento da AC. O aumento correspondente do cAMP resulta no aumento da excreção de ions Cl- causando perda de fluido e a diarreia.
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Seria possível fazer uma estirpe avirulenta de V. cholerae?
Uma estirpe mutante ctx– já foi desenvolvida 
Algumas pessoas ainda desenvolveram diarreia, vômitos, dores abdominais. Sintomas mais brandos e diarreias com até 2 L diários – em contraste com 20 L da estirpe ctx+
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Por que?
Outros mecanismos de Virulência
Outras toxinas:
Toxina zonula occludens (zot)
Aumenta a permeabilidade da mucosa do intestino delgado ao afetar a estrutura da junção intercelular ou zonula occludens
Enterotoxina acessora da cólera (Ace)
Acúmulo de fluido na alça ligada de coelho
Hemolisina (citolisina ou hemolisina El Tor)
Diferença entre El Tor e o biotipo clássico (não hemolítico)
Lisa vários eritrócitos, letal para camundongos, acumulo de sangue na alça ligada de coelho
RtxA (citotoxina)
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Vibrio cholerae
Toxinas de cepas não O1 ou não O139
Geralmente não apresentam ctx mas possuem genes que codificam para hemolisina, RtxA
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Vibrio parahaemolyticus
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Vibrio parahaemolyticus
Características
3 tipos de antígenos:
Somático termoestável  O (12 grupos);
Capsular termolábil  K (65 grupos);
Flagelar  H;
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Vibrio parahaemolyticus
Características
3 tipos de antígenos
Bactéria estritamente halofílica;
Cepas patogênicas produzem hemolisina (TDH) em agar Wagatsuma (KP+)
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Vibrio parahaemolyticus
Limites de crescimento:
Temperatura:
Ótima: 35-37ºC
Faixa: de 5 a 44ºC;
pH:
Ótimo: 7,6-8,6
Faixa: de 4,8 a 11
NaCl:
Ótimo: 2-3% (halofílica)
Faixa: de 0,5 a 8%
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Vibrio parahaemolyticus
Reservatórios:
Ambiente marinho  regiões estuarinas
Sedimento, plâncton;
Frutos do mar (ostras, peixe, mariscos, etc)
Influência da temperatura da água
Influência da salinidade da água
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Vibrio parahaemolyticus
Veículos de surtos;
Frutos do mar:	
Crus;
Mal cozidos;
Recontaminação pós cozimento;
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Vibrio parahaemolyticus
Surtos
1950 (Japão)  272 casos e 20 óbitos  alimento (shirasu);
Maior surto  1978 (EUA)  1133/1700 pessoas  camarão cozido recontaminado;
2002 (Fortaleza)  26/720 pessoas  patinhas de carangueijo cruas;
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Vibrio parahaemolyticus
Característica da doença
Período de incubação:
De 3 a 76 h (média de 17h);
Duração:
De 1 a 8 dias (média de 4,6 dias);
Autolimitante
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Vibrio parahaemolyticus
Característica da doença
Dose infecciosa:
De 105 a 107 UFC células de KP+;
A ingestão de 1010 UFC células de KP- não causa doença;
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Vibrio parahaemolyticus
Característica da doença
Sintomatologia
Diarreia
Cólicas abdominais 
Fraqueza
Náuseas
Calafrios
Dor de cabeça;
Febre
Vômito
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Vibrio parahaemolyticus
Mecanismos de Virulência:
Hemolisina Termoestável Direta (TDH)  		fenômeno Kanagawa(KP+);
Hemolisina termolábil (TLH);
“Thermostable Related Hemolysin” (TRH)
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Vibrio parahaemolyticus
Mecanismos de Virulência:
Hemolisina Termoestável Direta (TDH)
Termo estável: após 30 min a 100oC
Inatividade parcial
Atividade hemolítica
Depende da temperatura;
Eritrócitos humanos e de coelho;
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Vibrio vulnificus
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Vibrio vulnificus
Características
1º relato  década 70
3 biotipos:
Biotipo 1  associado a alimentos;
Biotipo 2  associado a animais (enguia);
Biotipo 3  infecções em lesões da epiderme devido manipulação de pescado;
Altamente invasiva
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Vibrio vulnificus
Características
Estritamente halofílico
Lactose (+)
Incidência  variação sazonal
Influência da temperatura e salinidade
Mais sensível ao frio que V. parahaemolyticus e V. cholerae
Não ocorre multiplicação em temperatura < 10ºC
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Vibrio vulnificus
Limites de crescimento:
Temperatura:
Ótima: 20-35ºC
Faixa: de 13º a 44ºC;
Salinidade:
Ótimo: 0,5 a 2,5%
Faixa: de 0,5 a 6%
Tratamento térmico:
50ºC/ 5 mim  reduz 6 log 
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Vibrio vulnificus
Reservatório:
Ambiente marinho/estuarinos;
Água;
Sedimentos;
Plâncton;
Moluscos;
Crustáceos;
Peixes;
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Vibrio vulnificus
Veículos dos surtos;
Nos EUA > 90% casos  Ostras cruas
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Vibrio vulnificus
Características da doença
Vias de entrada
Oral
Lesões na epiderme
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Vibrio vulnificus
Características da doença
Septicemia primária
Gastrenterite
Infecções das lesões da epiderme
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Vibrio vulnificus
Septicemia primária: características
Período de incubação 
7h a vários dias (média de 26h)
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Vibrio vulnificus
Septicemia primária: características
Sintomas
Febre 
Calafrio
Náusea
Hipotensão
Dores abdominais
Vômito e Diarreia
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Vibrio vulnificus
Septicemia primária: Características da doença
Desenvolvimentos de lesões secundárias  amputação de membros
Casos fatais
Entre 2h a 6 semanas depois da admissão no hospital
Alta taxa de mortalidade  ~50%;
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Vibrio vulnificus
Infecção em lesões da epiderme
 Características da doença
Período de incubação  de 4h a 4dias (média de 12h)
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Vibrio vulnificus
Infecção em lesões da epiderme
Características da doença
Sintomas e evolução:
Dores extremas
Eritema
Gangrena 
Necrose
Desenvolvimento  Intervenção cirúrgica;
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Vibrio vulnificus
Gastrenterite: Características da doença
Dores abdominais
Vômito
Diarreia
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Vibrio vulnificus
Dose infecciosa
Ainda não está bem definida
Dependente da população susceptível
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Vibrio vulnificus
População susceptível
Pessoas com desordem hepática
Cirrose hepática ou alcoolismo
Imunidade baixa
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Vibrio vulnificus
População susceptível
Pessoas com desordem sanguínea
Principalmente em homens com + 50 anos
Pessoas do sexo feminino
Proteção induzida pelo estrógeno contra a endotoxina do V. vulnificus;
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Vibrio vulnificus
Mecanismos de Virulência
Mecanismo de invasão
Ainda não totalmente elucidados
Principais fatores
Cápsulas;
Nível de ferro;
Citotoxinas, hemolisinas
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Genero Vibrio
Controle e Prevenção
Cozimento adequado;
Prevenir recontaminação;
Saneamento básico (Uso de água clorada);
Evitar a ingestão de alimentos crus;
Pessoas do sexo masculino, com doenças hepáticas e férias, evitar contato com água salgada
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METODOLOGIA DE CONTAGEM
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continua
AGS: arginina
glicose
Contagem de V. parahaemolyticus e V. vulnificus
TCBS – Agar Ágar Tiossulfato Citrato Bile Sacarose
Método APHA/BAM/FDA.
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continua
Em TCBS, ambas produzem colônias grandes (2-3 mm), verdes ou azuladas, redondas e opacas.
Em celobiose, V. vulnificus tem colônias amarelas
Testar crescimento em T1N0, 3, 6, 8 e 10% de NaCl
AIA – agar arginina ferro
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continua
AGS: argininaglicose
Análise de V. cholerae
NMP pode ser feito também em APA, no lugar do enriquecimento
Em TCBS colônias típicas são:
Grandes, lisas, amarelas, centro opaco e borda translucida.
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continua
AGS: arginina
glicose
Análise de V. cholerae
Em AIA rampa alcalina (roxa), fundo ácido (amarelo) sem gas
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continua
AGS: arginina
glicose
Análise de V. cholerae
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Resumindo
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Bibliografia
Doyle et al. Food microbiology: fundamentals and frontiers. 4th ed., Washington, DC, ASM., 2013.
Franco, B. D. M.; Landgraf, M. Microbiologia de alimentos. São Paulo: Atheneu, 2007. 170p.
Silva, N. et al. Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos. 3. ed. São Paulo: Varela, 2007.
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