Relatório Aula Prática Biologia Molecular - Extração de DNA da Cebola

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RELATÓRIO PRÁTICA DE LABORATÓRIO BIOLOGIA MOLECULAR
EXTRAÇÃO DE DNA DE CEBOLA
Descrição dos procedimentos
Foi efetuado o corte de meia cebola com auxílio de um triturador elétrico, após isso foi disposto este material obtido em um copo béquer de 250 ml.
Com o auxílio de uma proveta graduada foi medida 10 mL de detergente e meia colher de sopa de sal (NaCl) juntamente com 40 ml de água (solução de extração), misturando devagar para não formar muita espuma, sendo adicionado posteriormente no copo béquer com a cebola ralada, misturando bem.
Foi disposto o copo béquer em banho maria na temperatura em torno de 65º (utilizado termômetro para verificação da temperatura), sendo colocado um temporizador em 10 minutos, a fim de mexer a mistura e logo após mais 10 minutos, totalizando 20 minutos.
Com uma peneira foi retirado o liquido em um copo béquer sem forçar o material contra a peneira para não haver resíduos grandes sólidos no liquido. Após foi disposto o copo béquer com o filtrado em um banho de gelo que consistia em uma bandeja com gelo e água gelada em torno de 10 minutos, também foi disposta a proveta de 100 ml que seria utilizada posteriormente para aumentar o efeito da reação.
Após o resfriamento foi transferido o liquido para a proveta bem vagarosamente através da parede em um ângulo aproximado de 40º a 45 º para evitar a formação de espuma e danificar o material de estudo (fragmentar mais o DNA), também foi disposto o álcool gelado no mesmo volume do filtrado.
Com auxilio de um palito de madeira (palito de churrasco) foi pescado na solução os ácidos nucleicos realizando movimentos circulares e enrolando-os no palito. Após isto foram dispostos dois palitos ao ar para secagem do álcool.
Logo após foi transferido o material a um microtubo e centrifugado, sendo retirado o sobrenadante e ressuspendido o DNA com auxílio de água.
Conhecimentos adquiridos
Com a extração do DNA da cebola foi possível notar que ocorrem sobretudo três etapas que consistem em:
Primeira Etapa
Quebra físico-química das paredes da membrana celulares afim de se obter a liberação de material genético, através da trituração, onde está realiza a quebra da parede celular e a ruptura da membrana.
Segunda Etapa
Desmembração dos cromossomos em suas unidades fulcrais: DNA e proteínas.
Terceira Etapa
Apartamento do DNA dos demais elementos celulares.
Funções do Materiais Utilizados:
Através do detergente é dissolvida a bicamada lipídica que constitui a membrana plasmática, tendo ainda a função de desagregar os núcleos e cromossomos, liberando o DNA e proteínas (a desnaturação das proteínas ocasionada pelo laurel sulfato de sódio, que irá dissociar as proteínas do DNA cromossômico), que iram se dispersar na solução. 
A disposição de sal colabora para a neutralização da carga negativa do DNA através dos íons positivos de Na+, permitindo ao DNA precipitar na solução aquosa.
A água e o sal juntamente com o detergente contribuem para a alteração de pH, devido as concentrações em meio externo, que acarretará na plasmólise (retração de volume de água) da célula.
O banho-maria realiza o desarranjo dos fosfolipídios das membranas, além de promover a desnaturação parcial de algumas enzimas, a exemplo a do tipo DNAse, que em suma vai evitar que o DNA seja fragmentado em pequenos pedaços.
O álcool gelado irá promover uma mistura heterogenia em duas fases, devido sua densidade ser menor do que a da água, ficando na posição superior juntamente ente com as proteínas. Devido o ambiente salino, o DNA começa a se aglutinar, surgindo uma massa filamentosa de cor esbranquiçada entre a solução de álcool e de detergente, sal e água.
Com isso é possível verificar que a informações genéticas encontram-se bem protegidas sendo necessárias várias etapas para chegar até elas.
Utilização de micropipetadores
Descrição dos procedimentos
Foram disponibilizados 4 micropipetadores para a realização das atividades, sendo demonstrado pelo professor orientador seus componentes e mecânica de uso.
Inicialmente para manuseio foi evidenciado que a faixa de volume, ou seja, a medida mínima e máxima que a pipeta fica no botão de pipetagem ou no corpo próximo ao display de medida. Também foi explicitado que ao manusear a pipeta sempre deve estar na posição vertical, sempre segurando com o auxilio da alça. 
Ao realizar a sucção da substância também de haver cuidado para que a mesma não entre no interior do equipamento, somente na ponteira, afim de haver material cristalizado dentro da micropipeta que pode descalibrar o equipamento.
A partir destas informações foi possível realizar a atividade 1 de identificação das micropipetas através de suas medidas, sendo obtidos os seguintes resultados:
Tabela 1 - Identificação medidas das micropipetas
	Identificação da pipeta
	Intervalo de volume
	P200
	20 – 200 μL
	P20
	2 – 20 μL
	P10
	0,5 – 10 μL
	P1000
	100 – 1000 μL
Com os conhecimentos de identificação das micropipetas foi realizado a coleta dos volumes listados abaixo para execução da atividade, apresentando os resultados ao lado:
1,5 μL – P10
12 μL – P20
576 μL – P1000
0,001 mL – P10
0,02 mL – P20
1000 μL – P1000
200 μL – P200 ou P1000
1 mL – P1000
0,5 mL – P1000
1,2 μL – P10
Nesta atividade também foi realizado o calculo de transformação de ml em μl.
Na atividade três foi utilizada as micropipetas identificadas na atividade 2 para dispor cada volume em um tubo eppendorf, a quesito de comparação entre quantidades.
A partir da atividade 4 foram utilizadas as micropipetas de volume entre 2 – 20 μL (P20) e 0,5 – 10 μL (P10) (quantidades reduzidas) para realizar a transferência de 4 soluções aquosas diferentes (conforme tabela a seguir), para 3 tubos eppendorf identificados com A, B e C.
Tabela 2-Soluções a serem dispostas nos tubos eppendorf A, B e C
	Tubo
	Solução 1
	Solução 2
	Solução 3
	Solução 4
	A
	10 μL
	5 μL
	4 μL
	1 μL
	B
	10 μL
	3 μL
	-
	7 μL
	C
	10 μL
	-
	2 μL
	8 μL
Após a execução da pipetagem foi ajustado a micropipeta P20 para 20 μL afim de verificar-se se as quantidades nos tubos eppendorf estavam de acordo com 20 μL.
Na atividade 5 foi utilizada a micropipeta de volume entre 100 – 1000 μL (P1000) (maiores quantidades) para realizar a transferência de 3 soluções aquosas diferentes (conforme tabela a seguir), para 3 tubos eppendorf identificados com D, E e F.
Tabela 3-Soluções a serem dispostas nos tubos eppendorf D, E e F
	Tubo
	Solução 1
	Solução 2
	Solução 3
	A
	100 μL
	400 μL
	500 μL
	B
	150 μL
	250 μL
	600 μL
	C
	200 μL
	350 μL
	450 μL
Após a execução da pipetagem foi ajustado a micropipeta P1000 para 1000 μL afim de verificar-se se as quantidades nos tubos eppendorf estavam de acordo com 20 μL.
Conhecimentos adquiridos
As micropipetas são instrumentos fundamentais para medida e transferência de materiais com aferições exatas de volume, sendo essencial a escolha correta da mesma em relação a sua escala e ponteira, afim de não danificar componentes internos e não contaminar o material a ser manipulado.
Nas atividades 4 e 5 foi possível verificar a importância da calibração e limpeza das micropipetas, pois verificou-se que em alguns tubos houve diferença mínima em razão da quantidade exata a ser transferida, mesmo com a repetição da atividade.
É essencial durante a manipulação da micropipeta manter a posição vertical, afim do material coletado não adentrar nos componentes internos da mesma e não cristalizar, podendo ocorrer precipitação ou descalibração da micropipeta, interferindo nas medidas a serem transferidas.
Foi explicitado que ao fazer a transferência sempre dispor o material na parede do tubo eppendorf afim de não se espalhar e ficar homogeneizada em uma só localidade. Também foi dito a importância de se evitar a formação de bolas nas ponteiras e de material sobressalente para não alterar a medida de outras transferências, além de manter uma profundidade correta, ficando sobre a superfície do material parasucção, pois podem aumentar a precisão em 5%, também mantendo um ritmo constante, velocidade e pressão continua.