Teorias e Experimentos - Biofísica das Membranas - UFS 2018

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Teorias e Experimentos – Biofísica das Membranas Excitáveis
Membrana e Circuito Elétrico Equivalente
O capacitor equivale a bicamada lipídica.
A resistência, por sua vez, equivale aos canais iônicos. 
A corrente total de membrana é dada pela soma entre a corrente iônica (associada aos canais iônicos e que obedece a lei de ohm) e a corrente capacitiva (correspondente ao dielétrico lipídico). 
A suspeita de DEAN: hipótese para a baixa concentração de sódio e alta concentração de potássio no meio intracelular
A membrana durante o repouso é permeável a diversos íons. “Some sort of pump which can pump out the sodium or pump in the potassium”. 
A bomba de sódio e potássio: HODGKIN & KEYNES
Observaram que a passagem de sódio do meio intra para o extra consumia energia metabólica. Experimento com axônios gigantes de sépia em agua do mar artificial contendo sódio radioativo. O axônio foi estimulado até que o sódio radioativo adentrou o meio intracelular. Depois o axônio foi lavado e colocado em agua do mar cujo sódio não era radioativo. Em seguida, observaram o aparecimento de radioatividade no meio extracelular, o que indicava existir um efluxo de sódio. 
Bloqueio da cadeia respiratória e adição de ATP: CALDWELL
Injetaram ATP no meio intracelular em axônios com cadeia respiratória bloqueada pelo cianeto. Quando ATP era adicionado, a concentração de Na+ bombeado para o meio extracelular aumentava. 
Para cada ATP três íons de sódio saem e dois de potássio entram.
Potencial de equilíbrio de um íon: NERNST
Chama-se potencial de equilíbrio de um íon a diferença de potencial existente entre as faces de uma membrana permeável ao íon quando o fluxo deste é nulo, isto é, quando o fluxo difusional e o fluxo elétrico anulam-se. 
Os sinais de negatividade ou de positividade do potencial de equilíbrio de um íon referem-se ao valor do potencial elétrico intracelular.
A equação que determina o valor do potencial de equilíbrio de um íon qualquer para o qual a membrana é permeável foi desenvolvido por NERNST. 
 Musculo de rã e a contribuição do potássio para formar o potencial de repouso das células musculares: HODGKIN & HOROWICZ
Experimento 1: a concentração extracelular de potássio foi mantida constante e variaram a concentração extracelular de cloreto. 
Resultado 1: com a diminuição da concentração de cloreto, o potencial transmembrana tornou-se mais positivo, entretanto, a voltagem não se sustentou, retornando ao potencial de repouso de - 100mV. Com o aumento da concentração de cloreto, o potencial transmembrana tornou-se mais negativo, entretanto, a voltagem não se sustentou, retornando ao potencial de repouso de - 100Mv.
Experimento 2: a concentração extracelular de cloreto foi mantida constante e variaram a concentração extracelular de potássio. 
Resultado 2: com o aumento da concentração de potássio, o potencial transmembrana tornou-se mais positivo e manteve-se sustentado durante a alteração da concentração. Com a diminuição da concentração de potássio, o potencial transmembrana tornou-se mais negativo e manteve-se sustentado durante a alteração da concentração. 
Conclusão: o potencial de repouso é controlado pelo gradiente de concentração de potássio e que o cloreto ajusta sua concentração nos meios intracelular e extracelular de acordo com o nível do potencial existente na membrana.
A adaptação da equação de NERNST: HODGKIN & HOROWICZ 
Para explicar o desvio da curva do potencial de membrana em concentrações de potássio extracelular mais baixas, admitiu-se haver uma pequena corrente despolarizante transportada pelo sódio e, assim, conseguiram, ajustar os resultados experimentais. 
Hipótese da permeabilidade não seletiva mediante estimulação elétrica: BERNSTEIN
A membrana celular seria permeável unicamente ao potássio no repouso e que, por isso, a diferença de potencial que se formaria através dela seria igual ao potencial de equilíbrio do potássio. Ao ser estimulada, no entanto, a membrana tornar-se-ia permeável a todos os íons presentes nos meios intra e extracelular. Ao retorno ao potencial de repouso deveria ser realizado à custa de um aumento seletivo da permeabilidade da membrana para os íons potássio.
Reversão do potencial de membrana: HODGKIN & HUXLEY e CURTIS & COLE
A técnica de registro intracelular, colocando um eletrodo de vidro no interior de axônios gigantes de lulas, mostrou que o interior celular, normalmente negativo, torna-se positivo em relação ao potencial do meio extracelular, ultrapassando o valor zero do potencial transmembrana e destruindo a teoria de Bernstein para a membrana ativa, uma vez que, para tornar-se positivo, o potencial de membrana deveria estar sendo regido nesse overshoot por íons com potenciais de equilíbrio positivos, e não por quaisquer íons.
A teoria do sódio e do potássio: HODGKIN & KATZ
Propuseram que o overshoot deveria estar associado a um aumento da permeabilidade da membrana ao sódio. Para testar essa ideia os autores reduziram progressivamente a concentração extracelular de sódio e observaram uma diminuição concomitante da amplitude do potencial de ação gerado. 
A fase de despolarização do potencial de ação era produzida por uma entrada de sódio do meio externo para o interior da célula, enquanto a repolarização ocorria como consequência de uma rápida fuga de íons potássio do meio citoplasmático para o meio extracelular.
Determinação do curso temporal das correntes transportadas pelos íons: HODGKIN, HUXLEY & KATZ
Utilizando a técnica de fixação de voltagem, observaram três correntes: (1) de saída, (2) de entrada e (3) de saída. Com o meio extracelular sem sódio e substituído por cloreto de colina (a colina é impermeável a membrana) foi notado o desaparecimento da corrente (2). A corrente de entrada estava sendo transportada pelos íons sódio e a despolarização da membrana promoveu um rápido aumento da condutância a esse íon. Quando não tinha sódio, a corrente dirigiu-se para fora, pois, a concentração desse íon existente no axoplasma, apesar de pequena, tornou-se maior do que a concentração externa, favorecendo o fluxo de sódio para fora. 
A influência dos íons em cada fase do potencial de ação: HODGKIN & HUXLEY
Eles propuseram que o potencial de ação do axônio era formado por uma corrente de entrada de sódio e uma corrente de saída de potássio. 
Para provar tal hipótese utilizaram-se da técnica de fixação de voltagem. Observaram as correntes e encontraram os valores para a condutância de cada íon através das seguintes fórmulas: R.i = Ui/G = U.
A fase de despolarização do potencial de ação se deve a um aumento da condutância da membrana ao sódio e a de repolarização, a uma maior fuga de potássio. 
Como a condutância da membrana ao potássio permanece aumentada por um tempo mais longo, a célula, além de se repolarizar, hiperpolariza-se. 
A contribuição de outros íons para formar a corrente de membrana foi reunida numa única corrente a qual chamaram de corrente de vazamento. A corrente total de membrana é dada pela soma entre a corrente iônica (associada aos canais iônicos e que obedece a lei de ohm), a corrente capacitiva (correspondente ao dielétrico lipídico) e a corrente de vazamento.
O potencial no qual se inicia a rápida entrada de sódio é chamado de potencial limiar ou limiar de excitação celular. 
Ao receber estímulos abaixo do limiar de excitabilidade, isto é, variações muito lentas da voltagem de membrana, o potencial limiar pode afastar-se do potencial de membrana e, por mais que seja despolarizada, a célula não responde ativamente. Nesse caso, diz-se que houve uma acomodação da membrana.
Mecanismo de abertura e fechamento durante o potencial de ação: ARMSTRONG E BEZANILLA
 
Partículas do tipo M (ativação-sódio), partículas do tipo H (inativação-sódio); partículas do tipo N (potássio).
A inativação do canal de sódio ocorre quando o canal aberto (ativado) é bloqueado por um plugue amarrado (mecanismo de bola e corrente), prevenindo, assim, o fechamento da comporta de ativação. 
Períodos refratáriosPeríodo refratário absoluto: é o efeito combinado do aumento transitório na condutância de potássio (acarreta a hiperpolarização) e a inativação residual dos canais de sódio.
Período refratário relativo: nesse período alguns canais de potássio ainda se fecham (GK ↓) e alguns canais de sódio se recuperam do estado de inativação.
Semelhanças e dessemelhanças entre nervo e célula cardíaca
Ambos apresentam o fenômeno da acomodação da membrana e possuem a entrada rápida de sódio como mecanismo responsável pela deflagração do potencial de ação. Nas células cardíacas, a amplitude do potencial de ação não diminui com as reduções das concentrações de sódio, apesar da despolarização diminuir. O potencial de ação cardíaco possui um longo platô de despolarização que determina sua duração, 150 a 500 ms, enquanto o potencial de ação no neurônio dura cerca de 5ms.
Fases do potencial de ação cardíaco: WEIDMANN
Fase 0 ou fase de despolarização; Fase 1 ou repolarização parcial; Fase 2 ou platô; Fase 3 ou repolarização; Fase 4 ou diástole elétrica.
Componentes do potencial de ação cardíaco: WRIGHT & OGATA e PAES DE CARVALHO, HOFFMAN & LANGAN
O componente rápido trata do fato de que a despolarização depende essencialmente da entrada rápida de sódio.
O componente lento é a resposta elétrica características das células cardíacas, onde há uma taxa de despolarização menor do que a do componente rápido e sua velocidade de propagação é pequena (platô).
Tipos de potencial de ação cardíaco: PAES DE CARVALHO
Tipo A: componente rápido bem desenvolvido. Miocárdio de trabalho e de condução ventricular.
Tipo B: componente rápido pouco desenvolvido. Nódulos sinoatriais e atrioventriculares.
Tipo C: sem componente rápido. Células nodais. 
Fases e condutância ao decorrer do potencial de ação
Na fase 0 ou fase de despolarização, o potencial de membrana aumenta devido a abertura rápida dos canais de sódio e consequentemente a membrana tende a alcançar a voltagem do potencial de equilíbrio deste íon, -60mV, entretanto, tal acontecimento é barrado através da abertura dos canais de cloreto, os quais acarretam a próxima etapa do potencial de ação cardíaco, a fase 1 ou fase de repolarização parcial, a condutância ao sódio nessa fase é baixa por conta dos canais lentos deste íon, os quais possuem um fechamento lento. Já a condutância ao cloreto é alta e a membrana tende ao potencial de equilíbrio deste íon, -83mV. Mais uma vez, a abertura de um novo canal iônico impede que a membrana alcance a voltagem de equilíbrio de um íon. Desta vez, temos a abertura dos canais de cálcio, os quais acarretam a fase 2 ou platô. Durante essa fase o potencial da membrana permanece quase que constante. Em seguida nós temos a abertura dos canais de potássio, os quais causam o fechamento dos canais de cálcio. A membrana enfim alcança a fase 4 ou fase de repouso, onde o potencial de membrana é regido pela concentração do íon potássio, e, por conta disso, temos um potencial por volta de -90mV.
Potencial de ação no marca-passo:
Apresentam três fases, uma despolarização lenta, uma despolarização rápida e uma repolarização. 
A repolarização rápida ocorre de modo habitual. Há o aumento da condutância ao íon sódio e a diminuição da condutância ao íon potássio. Já na repolarização nós temos o inverso. A grande diferença encontra-se na despolarização lenta onde há uma progressiva redução da permeabilidade da membrana ao íon potássio. Como o efluxo de potássio diminui, o influxo lento de cálcio e de sódio despolariza lentamente a célula e leva o potencial de membrana até o limiar de excitação. Essa despolarização lenta é chamada de DDL, despolarização diastólica lenta.
O porquê das células de Purkinje poderem atuar como marca-passo
O tecido possui canais rápidos de sódio que permitem a fase 0. Podem apresentar também uma redução progressiva a condutância do potássio na fase 4, desta forma, surgem uma DDL.
Fixação de voltagem
O potencial da membrana é fixado em um valor para que possamos observar as correntes que fluem através da membrana. 
Exemplo: 
1° passo - uma célula que apresenta potencial de repouso de -90mV, tem seu potencial fixado em 0mV, para tanto, a voltagem precisa ser fixada em 0mV no clampeador (clamping voltage) e, por conseguinte, o amplificador operacional (OA) injeta +90mV;
2°passo – aplica-se um estímulo supra limiar para que se deflagre o potencial de ação, que ocorrem em cerca de -70mV, e, imediatamente, o voltímetro capta que a voltagem da membrana tende ao -70Mv, voltagem essa que é diferente da do ponto do clampeador (0 mV) e, em resposta, o amplificador operacional injeta+70 mV;
3° passo – seguindo a lógica do potencial de ação, a célula tende-se a se despolarizar aproximando-se do potencial de equilíbrio do sódio, entretanto a célula só chega a + 40mV, o ponto de voltagem, por sua vez, capta essa tendência e o OA ejeta -40 mV;
4° passo – a membrana procura repolarizar-se aproximando-se do potencial de equilíbrio do potássio, -90 mV, o ponto de voltagem, por sua vez, capta essa disposição e o OA injeta +90mV.
 Observe que as correntes ejetadas ou injetadas são idênticas em módulo as correntes de entrada de sódio e as correntes de fuga de potássio. O que vemos a partir do registro feito através do amperímetro, são as correntes ejetadas ou injetadas, as quais são imagens especulares das correntes de interesse.
A corrente que observamos é não só uma corrente macroscópica, como também abrange todas as correntes que obedecem a lei de ohm. A voltagem que “injetamos ou ejetamos” (entre aspas porque o que é injetado ou ejetado é, na verdade, corrente) é chamada de força movente. A corrente que realmente é injetada ou ejetada é chamada de corrente compensatória.
Caracterização de correntes pelo método biofísico da fixação de voltagem
Fixamos o potencial transmembrana no potencial de equilíbrio de um íon. Apenas podemos realizar essa experiência fixando no potencial do sódio; ao fixarmos o potencial no equilíbrio do potássio, não conseguimos analisar o comportamento das correntes no potencial de ação pois a célula manter-se-á no repouso tendo em vista que é o gradiente das concentrações intra e extracelulares de potássio que controlam o potencial de repouso.
Quando fixamos o potencial da membrana em +60 mV, é como se a célula ficasse estagnada no pico do potencial de ação, onde os canais de sódio são inativados e a condutância da membrana ao potássio aumenta e este, por sua vez, começa a fluir pelos canais iônicos na tentativa de repolarizar a célula. Assim sendo, a corrente observada é a de potássio.
Caracterização de correntes pelo método farmacológico da fixação de voltagem
Ao submetermos a célula a um meio com tetrodotoxina (TTX), os canais iônicos de sódio dependentes de voltagem são bloqueados e podemos observar apenas correntes de potássio quando clampeamos a voltagem. 
Ao submetermos a célula a um meio com trietanolamina (TEA), os canais iônicos de potássio dependentes de voltagem são bloqueados e podemos observar apenas correntes de sódio quando clampeamos a voltagem, o que não pode ser realizado pelo método biofísico.
 Patch-clamp
 
 
Whole cell recording: após a primeira sucção da membrana você já consegue registrar a corrente unitária, se realizarmos uma segunda sucção conseguimos registrar as correntes existentes em toda a célula, em condições estáveis e sem escape de corrente.
Outside-out patch: se além de realizar uma segunda sucção, levantarmos a micropipeta, ficaremos com apenas um pedaço da membrana no eletrodo e os registros feitos são do lado de fora desta.
Inside-out patch: apenas realiza-se uma sucção e depois levanta-se a pipeta, isolando um pedaço da membrana e os registros feitos são do lado de dentro desta.
Vantagens do patch-clamp em comparação à voltagem clamp convencional
Permite o registro de canais iônicos em regiões da célula que são inacessíveis através do voltage clamp, por exemplo, canais localizados nas membranas das organelas.
Permite o estudoda influência dos lipídeos na função dos canais iônicos da membrana, por exemplo, as cargas de abertura e fechamento (capacitivas) (gating current, corrente de comporta) que promovem a abertura e o fechamento da comporta de ativação do canal iônico de sódio durante a despolarização. 
Permite a descriminação de correntes sem o uso de artifícios farmacológicos, por exemplo, correntes de cálcio T de correntes de cálcio L.
Características das correntes dos canais dependentes de voltagem: sódio, potássio e cálcio
SÓDIO
rápida; apenas abrem no início do pulso e depois sofrem inativação; negativa de entrada; ativação rápida. 
POTÁSSIO
lenta; positiva de saída; ativação lenta; não há inativação; comporta abre e fecha ao longo do pulso. 
CÁLCIO T
abrem e depois sofrem inativação, logo a comporta fecha. 
CÁLCIO L
ativação rápida; sem inativação; comporta abre e fecha ao longo do tempo. 
Estrutura molecular e função dos canais dependentes de voltagem tendo o canal de sódio como modelo
4 subunidades proteicas, as quais possuem 6 domínios cada.
Apresentam uma comporta de ativação – partícula M.*no caso do sódio, no potássio, temos apenas uma comporta N
Apresentam uma comporta de inativação – partícula H.
Sensor de voltagem que contem cargas de abertura e fechamento (capacitivas) localizadas no domínio S4. Essas cargas são provenientes de aminoácidos carregados.
O canal de sódio pode estar ativado, fechado (em repouso) ou inativado.
Apresentam um filtro de seletividade, uma constrição no canal que seleciona íons a partir dos seus raios hidratados.
Possuem moléculas de açúcar no meio extra que oferecem uma sinalização para reconhecimento com as células de defesa.
Proteínas de ancoramento.
Sítios para ligação de fármacos.
Estrutura molecular e função dos canais iônicos ativados por ligantes químicos tendo o receptor da acetilcolina como modelo
5 subunidades proteicas, as quais possuem 4 domínios.
Os sítios de ligação para a acetilcolina estão nas subunidades α.
O canal sofre uma mudança conformacional quando ligado a acetilcolina que o mantem aberto.
Para fechá-lo é necessária a degradação da acetilcolina feita através de enzimas.
Estrutura molecular e função das junções comunicantes ou GAP
Os conéxons estão nas membranas plasmáticas de cada célula. A união de dois conéxons forma a junção.
Cada conéxon possui 6 conexinas.
Em qualquer região: diminuição de pH e aumento da concentração de cálcio causam desacoplamento.
No cérebro: 
- adrenalina – cascata de sinalização da molécula sinal acarreta a ativação da PKA – acoplamento.
- noradrenalina – cascata de sinalização da molécula sinal acarreta a ativação da PKC – acoplamento.
A sinapse elétrica é feita através de junções GAP. A elétrica é mais rápida porem não conserva a força do sinal transmitido.
No coração:
- acetilcolina – cascata de sinalização da molécula sinal acarreta a ativação da PKG – desacoplamento.
As junções GAP no sistema cardiovascular possuem função de sincronização elétrica (complicação: arritmia), difusão intracelular de pequenas moléculas (complicação: isquemia), regulação do tônus vascular (complicação: hipertensão), controle do crescimento e da diferenciação celular (complicação: malformações). 
Canalopatia de sódio: paralisia periódica hipercalêmica
Paralisia de músculos esqueléticos.
As partículas H apresentam sequência de aminoácidos modificada.
A ingestão excessiva de potássio acarreta a despolarização da célula e a abertura dos canais de sódio que não conseguem inativar. Com o tempo, perde-se a excitabilidade dos canais de sódio e as células musculares não conseguem propagar o potencial de ação. 
Canalopatia de potássio: síndrome do intervalo QT prolongado
Intervalo QT compreende a sístole ventricular.
Os canais de potássio demoram a abrir e prolonga-se o tempo de abertura deles.
Canalopatia relacionada a morte súbita.
Canalopatia de cálcio: hipertermia maligna
O receptor da rianodina (canal de cálcio ativado por ligante químico) fica ativado por muito tempo causando uma alta concentração de cálcio no meio intracelular e, por conseguinte, arritmia e hipertermia.
Canalopatia de cloreto: fibrose cística
Ataca epitélios, acúmulo de muco, canal de cloreto permeia água também, assim a água tem dificuldade de sair. 
Referências:
GARCIA, Eduardo A. C. Biofísica. São Paulo: Sarvier, 2002. 387p.
PROCOPIO, Joaquim. Minicurso de Biofísica de Membranas: Aula 38 – Potencial de ação em fixação de voltagem – Parte 1. Universidade de São Paulo. Disponível em: < http://eaulas.usp.br/portal/video.action?idItem=2249 >. Acesso em: 15 maio 2018.
PROCOPIO, Joaquim. Minicurso de Biofísica de Membranas: Aula 38 – Potencial de ação em fixação de voltagem – Parte 2. Universidade de São Paulo. Disponível em: < http://eaulas.usp.br/portal/video.action?idItem=2251 >. Acesso em: 15 maio 2018.
PROCOPIO, Joaquim. Minicurso de Biofísica de Membranas: Aula 38 – Potencial de ação em fixação de voltagem – Parte 5. Universidade de São Paulo. Disponível em: < http://eaulas.usp.br/portal/video.action?idItem=2257 >. Acesso em: 15 maio 2018.
MARCHIORO, Murilo. BME Parte 2 Potencial de Ação Nervoso. Disponível em: < https://www.youtube.com/watch?v=YsHq9UkMmDE&index=1&list=PLR3h6AbzUQ-iX0UvwKoc82hTLC4fhdNs8 >. Acesso em: 15 maio 2018.
MARCHIORO, Murilo. BME Parte 4 Biologia Molecular dos Canais Iônicos. Disponível em: < https://www.youtube.com/watch?v=EjG9X7pprgQ&list=PLR3h6AbzUQ-iX0UvwKoc82hTLC4fhdNs8&index=3 >. Acesso em: 15 maio 2018.
MARCHIORO, Murilo. BME Parte 5 Acoplamento Celular. Disponível em: < https://www.youtube.com/watch?v=vd-hVDkzsy4&index=4&list=PLR3h6AbzUQ-iX0UvwKoc82hTLC4fhdNs8 >. Acesso em: 15 maio 2018.
KANDEL, Eric R. Princípios de Neurociências. Porto Alegre, RS: Air Medical Group Holdings, 2014.