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Mecanismos de Ação de Antifúngicos Prof. Marcia Ribeiro Pinto da Silva MIP/Instituto Biomédico/UFF Histórico Primeiras drogas no tratamento das micoses • Violeta de Genciana – É empregada, desde 1890, como fármaco. – É considerada um dos fármacos mais antigos utilizados na terapia tópica da candidíase. Histórico • 1929 – antibiótico – Penicilina – Fleming • 1903 - Iodeto de potássio – oral – esporotricose • 1940 – Iodo, Ác. Salicílico, Ác. Benzóico - micoses superficiais • 1940 – sulfas – Paracoccidioidomicose 1957 Griseofulvina 1958 • Tratamento da esporotricose - 1903 – Solução saturada de iodeto de potássio por via oral – Iodeto de sódio a 10% por via endovenosa Histórico Primeiras drogas no tratamento das micoses • Antes do advento das sulfas, em 1940: – A maioria dos pacientes acometidos pela paracoccidioidomicose evoluíam para o óbito. Histórico Primeiras drogas no tratamento das micoses • Antes da descoberta da griseofulvina (1958) – Tinea capitis • radioterapia epilatória era a única opção. Histórico Primeiras drogas no tratamento das micoses Histórico • 1929 – antibiótico – Penicilina – Fleming • 1940 – Iodo, Ac. Salicílico, Ac. Benzóico – micoses superficiais –Iodeto de potássio – oral – esporotricose 1940 – sulfas – Paracoccidioidomicose • 1951 - Nistatina • 1956 – Anfotericina B • 1958 – Griseofulvina • 1964 – Flucitosina • 1967 – Miconazol • 1981 – Cetoconazol • 1990 – Fluconazol • 1992 – Itraconazol • 1993 - Terbinafina • 2002 – Voriconazol • Até o presente - várias novas drogas contra a parede dos fungos Mecanismo de Ação dos Antifúngicos Parede celular/Membrana • Os fungos são microrganismos eucarióticos, que possuem espessa parede celular constituída por quitina e glucanas. • Apresentam também na membrana celular, um importante constituinte: ergosterol. Célula fúngica Manoproteínas b-(1,6)-glucana b-(1,3)-glucana quitina Bicamada fosfolipídica da membrana celular Membrana e parede celular Ergosterol b-(1,3)-glucana sintetase Squalene Via de síntese Ergosterol Síntese DNA/RNA ANTIFÚNGICOS AÇÃO NA MEMBRANA CELULAR POLIENOS Os principais fármacos deste grupo: Anfotericina B Primeiro antifúngico eficaz no tratamento das micoses profundas. Nistatina Bastante ativa contra leveduras, especialmente Candida albicans. Classificação e utilização • Anfotericina B – Descoberta a partir do actinomiceto Streptomyces nodosus. • Formulações lipídicas da anfotericina B foram desenvolvidas no esforço de evitar a natureza nefrotóxica. • Anfotericina B Desoxicolato – adminstração I.V. (Fungizone®) • Novas formulações (a partir da década de 90) – Anfotericina B em vesículas lipossomais (Ambisome®) – Anfotericina em complexos lipídicos (Abelcet®) – Anfotericina B dispersão coloidal (Amphocil®) Região hidrofóbica Região hidrofílica Região hidrofóbica Anfotericina B • Toxicidade – tóxica, principalmente para os rins e coração • efeitos adversos – Mais comuns relatados incluem febres, calafrios, náuseas, vômitos, dores toráxicas, cefaléias, flebite no local de aplicação e dores abdominais Anfotericina B • A anfotericina B e as formulações lipídicas manisfetam sua ação antifúngica por dois mecanismos: – O mecanismo primário envolve a ligação da anfotericina B ao ergosterol. – Mecanismo adicional da anfotericina B envolve dano direto da membrana causado pela geração de uma cascata de reações oxidativas deflagradas pela oxidação da própria droga. • Este processo pode ser o principal contribuinte para uma atividade fungicida rápida da droga via geração de radicais livres tóxicos. Detalhe molecular Anfotericina B – Membrana celular fungo Ergosterol O H Fosfolipídeo OH HO OH OH C O NH2 OH Anfotericina B OH HO OH OH C O NH2 OH Ergosterol O H K + H+ Membrana celular Ergosterol Anfotericina B/Nistatina Liga-se ao ergosterol, Intercalando na membrana celular K+ Na+ Ca++ Ca ++ Na+ K+ Vazamento intracelular de cátions e proteínas Mecanismos de ação Polienos Ligação ao Ergosterol Mecanismos de ação da Anfotericina B Efeitos imunomoduladores da Anfotericina B Classificação e utilização • Nistatina – descoberta a partir do Streptomyces nursei. • Pouco absorvida por via tópica ou gastrointestinal e quando utilizada por via parenteral, apresenta elevada toxicidade. • Seu uso se limita às infecções cutâneas e do trato gastrointestinal Candidíase – Pele e mucosas Resistência aos polienos • Incomum – apesar da utilização extensiva por mais de 30 anos. – Suscetibilidade diminuída tem sido reportada em isolados de: • Candida lusitaniae • Candida glabrata • Candida krusei • Candida gluilliermondii • Aspergillus terreus Antifúngicos sintéticos Derivados azólicos • Imidazólicos – 1a geração – uso tópico – clotrimazol, miconazol, econazol, etc. – 2a geração – cetoconazol – v. oral – amplo espectro – micoses superficiais e sistêmicas: paracoccidiodomicose, histoplasmose e candidíase. • Triazólicos – 3a geração – amplo espectro - itraconazol, fluconazol (triazol de 1° geração) e voriconazol (triazol de 2° geração) – micoses superficiais e sistêmicas. v. oral ou intravenosa • Posaconazol e ravuconazol (triazol de 2° geração) – em avaliação pela Anvisa . • Os azóis podem ser fungistáticos ou fungicidas Derivados azólicos: N H N N N H N N N NN N N N N CH 2 O O C H 2 O Cl Cl O CHC H 2 CH 3 CH 3 N N N N N N F F OH Imidazol Triazol Itraconazol Cetoconazol Fluconazol Ação de derivados azólicos: OH OH Lanosterol 14-demetil-lanosterol Azólicos 14-demetilase Mecanismos de ação – derivados azólicos Inibição da síntese de Ergosterol Lanosterol Ergosterol Citrocromo P450 CETOCONAZOL, FLUCONAZOL, ITRACONAZOL... Síntese da membrana Ergosterol 14 alfa demetilase Membrana defeituosa Mecanismos de ação dos Azóis Inibição da síntese de Ergosterol Resistência aos azóis • Utilização ubíqua dos azóis, especialmente o fluconazol, no tratamento e prevenção de infecções fúngicas - aumento dos relatos de resistência. – Candida spp – somente a C. krusei é considerada intrinsicamente resistente ao fluconazol. • Voriconazol, posaconazol e ravuconazol são mais potentes que o fluconazol inclusive contra C. krusei. – C. neoformans – resistência secundária em pacientes com AIDS. – Aspergillus spp – resistência baixa ao itraconazol. Antes da exposição Após a exposição Efeito dos azólicos em C. albicans Alilaminas A classe alilamina dos agentes antifúngicos inclui: Terbinafina – atividade sistêmica Naftifina – agente tópico Terbinafina – alilamina sintética, utilizada via oral ou tópica no combate aos dermatófitos, candidíase cutâneo-mucosa, Malassezia spp, C. neoformans, Trichosporon spp, Aspergillus spp, S. schenckii e Penicillium marneffei. Falhas clínicas utilizando terbinafina e naftifina: Bomba de efluxo multidroga CDR1 pode utilizar a terbinafina como substrato. (Possibilidade ?) Ação de Alilamínicos: O Escaleno 2,3-oxido-escaleno Bloqueio da enzima Escaleno epoxidase Alilaminas N CH 3 NaftifinaEfeito: ruptura da membrana celular fúngica Mecanismos de ação - Alilaminas Inibição da síntese de Ergosterol Mecanismos de ação – Derivados Morfolínicos (Amorolfina) Inibição da síntese de Ergosterol Bloqueio das enzimas Δ14 – redutase e Δ7 e Δ8 - isomerase Uso tópico ANTIFÚNGICOS INIBIDORES DE ÁCIDO NUCLEICO Biossíntese de DNA e RNA: Estrutura geral dos nucleotídeos: Fosfato Ribose Base DNA Bases RNA Adenina Guanina Purinas Adenina Guanina Citosina Timina Pirimidinas Citosina Uracila Flucitosina • É o único agente antifúngico disponível que atua como um antimetabólito. • É análogo fluorado da pirimidina, que exerce atividade antifúngica pela interferência com a síntese de DNA, RNA e proteínas na célula fúngica. N N N O F H H H H N N N O H H H H H Citosina Flucitosina Flucitosina – A droga é utilizada em associação com anfotericina B e fluconazol. Monoterapia não é utilizada devido à propensão a resistência secundária. – Em terapia conjunta, a anfotericina B, apresenta sinergismo, sendo indicada para criptococose. – O espectro de ação é limitado a Candida spp, C. neoformans, Saccharomyces cerevisiae e demáceos. – Resistência primária é muito rara, porém, pode desenvolver entre espécies de Candida spp e C. neoformans. – Não é eficaz contra Aspergillus spp., zigomicetos e outros filamentosos hialinos. Atua na biossíntese de DNA ou RNA N N NH 2 H F O N N NH 2 H O N N N N H N N Purina Pirimidina Citosina 5-Fluor-citosina Mecanismo de ação da 5-Fluor-citosina: N N NH 2 H F O N N H F O O N N H O O N N H O O CH 3 N N NH 2 H O Citosina permease (deaminase) Timidilato sintase Citosina permease (deaminase) 5-fluoruracil 5-fluorodeoxiuridílico N N O NH2 F 5-Fluoruracil Convertido em Ácido 5-fluoruridílico que compete com o uracil na síntese do RNA N N O NH2 F Flucitosina Análogo da Citosina Síntese de DNA Divisão celular Permease Citosina desaminase RNA defeituoso Mecanismos de ação - Flucitosina Impede a síntese de DNA ANTIFÚNGICOS INIBIDORES DA DIVISÃO CELULAR Griseofulvina • Produzido a partir do Penicillium griseofulvum. • A griseofulvina é considerada um agente de segunda linha no tratamento de dermatofitoses. • in vitro a ação é fungistática, podendo ser letal para células fúngicas jovens. • A ação é seletiva sobre dermatófitos, não afetando outros fungos, bactérias, actinomicetos ou nocardias. O O O O O O Cl H H H H H H H H H H H H H H H H H GRISEOFULVINA A griseofulvina interage com os microtúbulos intactos, impedindo a separação dos cromossomos. Mecanismos de ação - Griseofulvina Impede a separação dos cromossomos Agentes que atuam na síntese de proteínas Sordarinas, Azasordarinas Ainda em estudos ANTIFÚNGICOS INIBIDORES DE PAREDE CELULAR EQUINOCANDINAS • São uma nova classe altamente seletiva de lipopeptídeos semi- sintéticos que inibem a síntese de β-(1,3)-glucana, importante constituinte da parede celular. • Visto que as células mamíferas não contém β-(1,3)-glucana, esta classe de agentes é seletiva em sua toxicidade aos fungos em que as glucanas desempenham um papel importante na manutenção da integridade osmótica da célula fúngica. • Glucanas são importantes na divisão e no crescimento celular. A inibição do complexo enzimático da síntese de glucana resulta na atividade fungicida, contra Candida spp e fungistático contra Aspergillus spp. – A resistência primária a esta classe de agentes parece ser rara. Agentes que atuam na parede celular: NH NO O N CH 3 NH OH OH NH 2 O COOH O OH OH OH N NH N N HCH3 OH OH OH NH NH OH O O O CH 3 H OH OH N H O O OC 5 H 11 O O OH H CH 3 OH Nicomicina Z Echinocandins, ex: LY303366 Na quitina-sintase: Na b-(1,3) glucana-sintase: Equinocandinas: Caspofungina, Micafungina, Anidolafungina Nicomicina Manoproteínas ß(1,6)-glucana ß(1,3)-glucana quitina Bicamada fosfolipídica da membrana celular ß(1,3) glucana sintetase Inibidor da glucana sintetase Inibição da ß(1,3) glucana sintetase Depleção de ß(1,3) glucana na parede celular Mecanismos de ação – Equinocandinas Interfere na síntese de parede Ação na parede celular: Equinocandinas: Caspofungina • Bloqueia a síntese do principal componente da parede celular – glucanas. • Inibição da glucana sintetase • Fungicida para Candida spp e fungistático contra Aspergillus spp. • Ação limitada para: Trichosporon spp, Fusarium spp,C. neoformans, Rhizopus. • Administração IV. Micafungina • Como a anterior, inibe a síntese do principal componente da parade celular. • Fungicida contra Candida spp e Candida spp resistentes aos azólicos. • Ação contra Aspergillus spp mas não é eficiente contra Cladosporium, Exophiala, Fonsecaea, etc. • Administração IV. • DROGA EM TESTE. Anidolafungina • Conhecida previamente como V- equinocandina. • Mesmo mecanismo de ação que os outros fármacos deste grupo. • Ativa contra algumas espécies de Candida spp. • Administração via oral e intravenosa. • DROGA EM TESTE Equinocandinas e hifas de Aspergillus spp DiBAC Bowman et al. Antimicrob Agent Chemother 2002;46:3001-12 Resistência às equinocandinas • Potente atividade antifúngica contra candida spp. • Isolados clínicos de Aspergillus spp com suscetibilidade reduzida às equinocandinas são raros. • Mecanismo de resistência em C. albicans. – Pontos de mutação no gene FKS1: codifica para uma proteína integral que é uma subunidade catalítica do complexo enzimático da síntese da glucana. • C. neoformans - Melanina Resistência clinica é multifatorial • FUNGO MIC inicial Tipo celular: hifa/levedura Estabilidade genômica Produção de biofilme Fatores de Virulência • Droga Natureza fungistática Dose Farmacocinética Interação droga-droga • Hospedeiro Status imunológico Sitio de infecção Severidade da infecção Mecanismos de resistência aos antifúngicos • Azóis – Pontos de mutação no gene ERG11 codificando a enzima-alvo, o lanosterol 14-α-desmetilase. – Superexpressão do ERG11 resulta na produção excessiva da enzima- alvo. – Aumento na expressão de genes codificadores das bombas de efluxo multidrogas. • A principal bomba de efluxo do tipo facilitador – MDR (multidrug resistance) leva a resistência ao fluconazol. • Transportadores do tipo ATP-binding cassete – CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, etc. (contact determining regions). • Há outros genes descritos, porém o mecanismos não é claro. Mecanismos de resistência aos antifúngicos • Equinocandinas – Pontos de mutação no gene FKS1, que codifica para uma proteína de membrana integral. – CDR2 – nível de resistência 30x menor do que pontos de mutação no gene FKS1. • Polienos • Alterações qualitativas e quantitativas na célula fúngica. Isolados resistentes apresentam redução no ergosterol ou substituição pelo fecosterol. • Flucitosina- Diminuição da enzima permease – Maioria dos isolados clínicos apresentam mutação no gene FUR1 (uracil fosforribosiltransferase). • Perda da atividade enzimática necessária para converter 5-FU em FUMP (5- fluoruracilmonofosfato). COMO DETECTAR IN VITRO A RESISTÊNCIA AOS ANTIFÚNGICOS? Antifungigrama Provas de sensibilidade aos antifúngicos • Diluição em caldo; • Diluição em ágar; • Difusão em ágar com disco ou fitas; • E-test – meio sólido – permite uma correlação com o MIC, • CLSI- Central Laboratory Standard Institute (ex-NCCLS) • EUCAST - European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. – NCCLS – National Committee for Clinical Laboratory Standard - USA – FORA DE USO Microdiluição (modified M27-A) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 C o n tr o le - an ti fú n gi co C o n tr o le - m ei o C o n tr o le d e cr es ci m en to A B C D E F G H Anfotericina B Fluconazol Itraconazol Cetoconazol Sensititre® YeastOne™ Test Panel • Focalizado no padrão NCCLS M27-A2. • Cada teste consiste em uma placa de microtitulação (kit colorimétrico) onde os orifícios contém um dos 6 diferentes antifúngicos diluídos e secos, – Anfotericina B, Fluconazol, Itraconazol, Cetoconazol, 5-Fluorocitosina e Voriconazol . – • Alamar Blue é um indicador colorimétrico. • A titulação é determinada pelo último orifício que ocorreu a troca de cor de rosa para azul (ausência de crescimento). Sensititre® YeastOne™ Test Panel Fungitest® • Ensaio de microtitulação modificado e relacionado ao padrão NCCLS M27-A2. • Cada placa tem 6 antifúngicos em duas concentrações – Anfotericina B (2 e 8 mg/ml) – Fluconazol (8 e 64 mg/ml), – Itraconazol (0.5 e 4 mg/ml), – Cetoconazol (0.5 e 4 mg/ml), – Miconazol (0.5 e 8 mg/ml) – 5-Fluorocitosina (2 e 32 mg/ml) • Cada orifício contém, além da droga, um indicador de cor para auxiliar na determinação do “end point” pela troca da cor azul para pink. • Permite apenas caracterizar o isolado como sensível ou resistente Etest® e Neo-Sensitabs® Etest e Neo-Sensitab test Etest mostrando trailing (crescimento residual acima do MIC) M38-A: Método para teste de suscetibilidade a antifúngicos para fungos filamentosos • Aspergillus spp, Fusarium spp, Pseudallescheria (Scedosporium) spp, zygomycetes e outros bolores patogênicos. • Inóculo de 0,4x104 - 5x104 UFC/ml • Incubar a 35o C e fazer a leitura: – 24 horas para espécies de Rhizopus; – 48 horas para as espécies de Aspergillus, Fusarium e Sporothrix; – 72 horas para fungos de crescimento lento como Pseudallescheria (Scedosporium)
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