05.04 Genetica e Evolução Viral

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05/04/2018
Genética e Evolução Viral
O sucesso dos procedimentos que visam curar ou prevenir infecções virais dependem da evolução dos vírus, tanto quanto o surgimento de novas doenças. Uma das bases biológicas/bioquímicas mais significantes para esse processo de evolução consiste no estudo da genética dos vírus.
Classificação dos vírus
Diversidade bioquímica dos genomas virais. Todo processo genético dos vírus precisa ser entendido a partir dessa diferença bioquímica entre eles.
	Os vírus apresentam genoma ADN ou ARN. Do ponto de vista da estratégia bioquímica de replicação, uma questão precisa ser apresentada: Aqueles com genoma ADN precisam de uma enzima ADN polimerase. Os de genoma ARN precisam de uma enzima ARN polimerase. Essas enzimas elas diferenciam-se não só pelo fato de terem capacidade de produção de um tipo ou de outro tipo de ácido nucleico e sim pela presença ou ausência de sua ATIVIDADE REVISORA, que possui grande impacto biológico.
ADN polimerase: com atividade revisora, ou seja, é a capacidade de remover um nucleotídeo logo após sua adição na molécula de ácido nucleico desde que o pareamento entre as bases nitrogenadas não seja perfeito, desfazendo a ligação covalente recém feita que permitiu a introdução daquele nucleotídeo novo, removendo-o. Isso aumenta probabilisticamente a chance de adicionar um nucleotídeo em que haja um pareamento perfeito entre bases nitrogenadas, fazendo com que a ocorrência de erros aleatórios nesse pareamento diminua muito.
Desequilíbrio na concentração dos nucleotídeos: pode ter um favorecimento do nucleotídeo que possui base nitrogenada mais abundante em detrimento daquele que possui base nitrogenada menos abundante. Essa é uma das características mais abundantes que podem justificar esses erros de nucleotídeos na nova fita que está sendo montada. Pode haver também um defeito no reconhecimento de algum nucleotídeo. 
	A configuração espacial que o nucleotídeo novo terá pareado com a fita molde, indicará para a enzima que aquele nucleotídeo novo está no lugar certo ou não. Só as ADN polimerases conseguem fazer essa distinção, porém não conseguem identificar TODO pareamento anormal ao longo do processo de polimerização do ADN, existe a probabilidade do erro permanecer (MUTAÇÃO ESPONTÂNEA). Porém a proporção que isso ocorre na produção de ADN é muito menor do que a proporção de ocorrência na produção de ARN.
	Polimerases de células ou vírus diferentes, há uma grande diferença, além de diferenças que essa mesma enzima pode apresentar em diversos parâmetros em função de variações de ambiente físico-químico onde a reação de polimerização de ácidos nucleicos esteja se processando. 
Numericamente, a cada 10 elevado a 10 nucleotídeos adicionadas, 1 deve estar com pareamento anormal. Frequência de erro: 10 elevado a -10. Muito nucleotídeos para ocorrer um erro.
ARN polimerase: sem atividade revisora. Possuem frequência de erros de 10 elevado a -4. Ou seja, um nucleotídeo errado a cada 10 elevado a 4 nucleotídeos acrescentados.
	Conclui-se então que cada genoma nucleado pode ter uma modificação em relação a fita molde. Em vírus de genoma ARN, dependendo da taxa de erro e do tamanho do genoma, podemos ter um genoma diferente do molde em pelo menos um nucleotídeo. Isso acontecendo aleatoriamente do longo do genoma.
	Baseado nisso, podemos dizer que a evolução dos vírus de genoma ADN é mais lenta que os de genoma ARN? Sim! Porém, os vírus ARN estão muito mais “no fio da navalha” que os ADN, porém conseguem se manter no meio justamente por conta da diversificação, já que a mutação pode ser de três tipos: neutra, benéfica ou deletéria, comprometendo a atividade biológica do produto gênico, ocasionando na morte do vírus. Esse seria o fio da navalha. Essa inviabilidade do vírus geralmente é decorrente de um acúmulo de mutações: em cada célula que esse vírus infecta, ocorre uma mutação diferente, acumulando-as em pontos diferentes do genomas. Isso pode progressivamente ir melhorando ou piorando a performance/depuração/fitness desse vírus.
	Essa classificação da mutação ser benéfica, neutra ou deletéria depende do local em que esse vírus habita, existindo também mutações que são deletérias em todos os casos.
Fitness: em termos evolutivos, se refere a capacidade de gerar descendentes. Vírus mais fitness geram progênies mais numerosas. Não significa que é mais ou menos adaptado. Quanto maior o número de descendentes na progênie viral, maior a probabilidade de ter um desses descendentes infectado na célula. Ou seja, esse conceito de fitness é mais relevante que o conceito de adaptação.
	As enzimas são classificadas em ADN/ARN polimerases, mas essa classificação pode e deve ser mais burilada. Uma ADN polimerase celular convencional ela é ADN dependente, ou seja, precisa usar o ADN como molde para produzir outro ADN. Já uma ARN polimerases celulares são todas ADN dependes, ou seja, produzir ARN copiando do ADN na célula adjacente. Mas os vírus, para replicação do seu genoma, não precisam dessa atividade. Precisam de uma atividade ARN polimerase ARN dependente. Isso é uma exigência que a maioria dos vírus de genoma ARN tem e que faz com que a célula animais não tenham condições de suprir essa necessidade. Então, o vírus tem que ter essa enzima ou na sua estrutura ou em seu capsídeo ou no cerne (meio, miolo). Mas há casos específicos de vírus com genoma ARN que ele não chega com essa enzima pronta na célula. Isso acontece quando o genoma funciona como ARN mensageiro (responsável pela transferência de informações do ADN até citoplasma). No Sistema de Baltimore, o grupo IV e VI são compostos por uma fita simples de RNA com polaridade positiva, essa positividade quer dizer que esse genoma possui a organização de um ARN mensageiro. Portanto, a célula irá produzir as proteínas virais codificadas no genoma, dentre elas a ARN polimerase ARN dependente, atendendo a necessidade viral. Todos os outros tipos virais precisam chegar com a ARN polimerase ARN dependente pronta, pois seus genomas não podem atuar dentro da célula como ARN mensageiro.
	2 grupos:
ADN fita dupla
ARN fita simples com polaridade positiva: Grupo IV e VI. São diferentes dos demais grupos: presença da enzima transcriptase reversa, que é uma ADN polimerase ARN dependente. Ou seja, é uma enzima que faz o processo de transcrição às avessas: produz ADN usando como molde o ARN. Uma característica peculiar da enzima é que são ADN polimerases sem atividade revisora.
Essa diversidade de estruturas genômicas presentes nos vírus acarretam em estratégias bioquímicas diferentes de replicação desse genoma.
ESTRATÉGIAS DE REPLICAÇÃO DE ADN
Ex: ADENOVÍRUS
Parâmetro celular: As duas fitas duplas de ADN são replicadas concomitantemente. 
Adenovírus: A replicação de uma fita começa e depois da replicação da outra. Genoma do vírus: fita dupla de ADN, na imagem uma está em azul e a outra em azul claro. A fita azul claro está como molde e a ADN polimerase viral começa a produzir a fita nova, que seria a azul escura. Quando essa replicação termina, ai começa a replicação daquela fita que ficou em “stand by”, que ficou revestida de proteínas que impediram que essa fita se enovelasse sobre ela mesma, ficando circularizada. A partir dai, temos a replicação de primeiro uma fita e depois da outra.
Outra estratégia de replicação de ADN: Só existe em células procariotes. Replicação pela estratégica do círculo rolante. Isso acontece com moléculas de ADN que estão em duplas circulares. Há uma molécula de ADN com uma das fitas sofrendo um corte em um ponto.
A partir da extremidade 3’ da fita molde, a ADN polimerase começa a produzir uma fita nova, que parece em vermelho na imagem a partir da fita interna que não sofreu corte nenhum (fita molde). A fita molde, como possui estrutura circular, vai ficar girando em torno desse molde, até que produz uma copia dessa fita e, com isso, ela vai empurrando aquela fita original que sofreu o corte. Paralelo a isso, outra ADN polimerase começa a geraroutra replicação, formando uma molécula de fita dupla linear, costuma ser bastante comprida, formada pela repetição de cópias do genoma. Posteriormente, nucleases irão originar as diversas cópias do genoma.
	Nos vírus, nem sempre a replicação é semiconservativa. Nesse caso não é. Podemos dizer que essa primeira cópia do genoma é semiconservativa, pois tem uma fita que se desenvolve e outra previamente presente no molde. Mas, as outras cópias não são, ambas as fitas são de síntese recente. (DIFERENÇA BIOQUIMICA DE REPLICAÇÃO DE GENOMA CELULAR E VIRAL).
	É um processo de replicação unidirecional do acido nucleico que pode rapidamente sintetizar múltiplas copias de moléculas circulares de ADN.
	Alguns vírus de células eucariotas replicam seu DNA em células hospedeiras através dessa replicação.
ESTRATÉGIAS DE REPLICAÇÃO DE ARN
Nessa imagem, está mostrando um ARN de fita simples com polaridade negativa. Esse é o genoma que entrou na célula e é replicado a partir da ARN polimerase e ARN integrante viral, produzindo uma cópia sempre de polaridade inversa a da fita líder. Ou seja, nesse caso, como o genoma possuía polaridade negativa, a fita cópia será positiva. Podemos concluir então que essa cópia positiva seria equivalente ao RNAm do vírus. Mas, por outro lado, essa mesma cópia de polaridade positiva constitui um intermediário replicativo fundamental para o vírus. É através dela que o vírus será capaz de produzir cópias genômicas, que não são produzidas diretamente como o ADN, precisa haver esse intermediário que permitirá a produção dessas cópias, agindo como molde para a ARN polimerase viral produzir outra fita de ARN fita simples de polaridade negativa. 
Transcrição reversa no modelo retrovírus
Processo bioquímico que usa enzima ADN polimerase ARN dependente. Essa enzima a princípio não tem nas células hospedeiras animais, tendo o vírus que leva-la junto consigo.
Nesse esquema, representado de verde a molécula genômica de ARN fita simples de polaridade positiva, mostra a transcrição reversa pela ação de ADN polimerase representada em roxo, que produz um ARN a partir da sequencias de bases presentes no ARN molde. 
Ocorre nessa enzima transcriptase reversa outras atividades enzimáticas além da citada acima, é também uma exonuclease, que é uma atividade que se manifesta quando a enzima se depara com essa fita dupla hibrida ADN-ARN resultante da sua própria ação, ai se ativa a atividade RNase: o ARN é degradado pela enzima a partir das extremidades. 
Existe outra categoria de enzima chamada endonuclease, que reconhecem sequencias de bases nitrogenadas e também reconhecem regiões dentro da sequencia específicos, tendo capacidade de quebrar ligações covalentes.
Portanto a transcriptase reversa além de atuar como ADN polimerase ARN dependente, age também na degradação do ARN tanto com atividade endonuclease quanto exonuclease. A sua terceira atividade enzimática é ADN polimerase ADN dependente. Isso pode parecer confuso (realmente professor). Ou seja, possui capacidade de produzir ADN utilizando-se de ADN. No final do processo da transcriptase reversa, teremos a informação genética viral que inicialmente estava codificada como ARN de fita simples agora codificada em ADN de fita dupla. 
	A estabilidade da informação genética viral pode ser perturbada com os seguintes mecanismos básicos:
Mutação espontânea
Recombinação (junta-se pedaços de moléculas de ácidos nucleicos)
Recombinação Intramolecular (interação genética entre vírus)
Vai ligar trechos de moléculas de ácidos nucleicos diferentes por ligações fosfodiester internas das cadeias dos nucleotídeos. Só acontece se estiver em uma situação de interação entre vírus. Anteriormente, só falou-se do contato do vírus com a célula, que levaria a seu ciclo de replicação. Nesse caso é diferente, não se pode pensar em virions interagindo entre si, já que são totalmente inertes, sendo uma interação impossível. O que acontece é uma relação entre vírus que estão infectando a mesma célula, criando a possibilidade de interação genética. Ou seja, os genomas de ambos os vírus irão interagir na etapa de replicação desses genomas.
	Para que essa interação ocorra, esses vírus precisam ser filogeneticamente próximos, ou seja, precisam ser duas cepas virais diferentes pertencentes a mesma espécies para que haja compatibilidade bioquímica máxima.
Nesse esquema ao lado, observamos dois genomas virais de dois vírus que o genoma é composto por gene A e gene B (possuem mesmo tipo de formação). São de cepas diferentes pois o gene A no vírus 1 é mutante, enquanto no vírus 2 é wt, ou seja, não-mutante. No gene B ocorre ao contrário, no vírus 1 é normal/sem mutação e no 2 é mutante.
	Quando há a interação entre esses dois genomas, há uma recombinação Intramolecular na qual um trecho de um genoma é produzido em continuidade com o trecho correspondente do outro genoma. O resultado dessa interação é um novo genoma onde o gene A e B não possuem mutação. Se essa mutação fosse deletéria, após essa interação o genoma da espécie viral seria restituído de forma benéfica ou não, se encarar essa perda da mutação como uma perda da capacidade evolutiva do vírus.
	No final, terão três cepas diferentes: uma igual ao vírus 1, uma igual vírus 2 e outra resultante da recombinação. Permite maior diversidade genética entre os vírus: amplifica capacidade evolutiva da Mutação Espontânea.
Outro tipo de interação genética entre vírus: Recombinação intermolecular
Só acontecem em vírus cujo genoma seja segmentado, ou seja, formado por mais de um segmento de ácido nucleico. Nesse exemplo, temos o vírus da gripe, que é o mais clássico mas não o único. 
	A interação entre esses vírus se dá na etapa da montagem das partículas virais e não na etapa de replicação do genoma como na recombinação Intramolecular. Temos os dois sítios replicativo dos dois vírus, de cepas diferentes mas da mesma espécie viral, acontecendo dentro da célula, que está, portanto, cheia de cópias de genoma. De acordo com a imagem, há copias de genoma vermelho e verde. Pode-se ter uma mistura desses segmentos genomicos no momento da montagem de algumas das partículas virais firmes. Cada segmento codifica uma proteína, inclusive proteínas de superfície. Então, se muda o genoma muda totalmente o padrão antigênico de uma geração para outra, trazendo consequências diretas para a profilaxia via vacinação.
	Não há formação de ligação covalente intracadeias dos segmentos genomicos. 
Existe a possibilidade de uma interação não-genética: entre produtos gênicos (proteínas). Ocorre sempre na fase de montagem, onde as células recombinam proteínas de vírus A com vírus B, mas o genoma permanece intacto sem sofrer nenhuma modificação. Portanto, é uma mudança transitória, pois se esse vírus infectar uma célula e sofrer multiplicação de seu genoma, retornará a sua forma inicial, já que o genoma é o mesmo. Porém, na relação com o hospedeiro, essa mudança trará consequências. Será uma mistura fenotípica.
Caso particular da mistura fenotípica (pseudotipo): poderemos ter um capsídeo de um vírus eventualmente se misturando com genoma do outro.
	Um vírus que sofreu mistura fenotípica, não há alteração no genoma. Há alteração só do capsídeo e, quando o vírus infecta uma célula, sua progênie será correspondente a sua carga genômica.
	
Mutação do tipo drift: não interfere no reconhecimento do padrão antigênico do vírus pela resposta de memória, resposta continua a mesma no vírus mutante. Ou seja, essa mudança no determinante antigênico não é grande o bastante para impedir o reconhecimento. Já houve uma rotificação, mas não de tamanho suficiente.
Mutação do tipo shift: Grande mutação. Padrão de anticorpos que reconheciam vírus selvagem não reconhece mais vírus mutado. Portanto, existe um maior tempo para adquirir uma nova resposta eficiente contra o agente.
Conceito que tem a ver com a geração de mutantes, especificamente no contexto de vírus de genoma ARN: essa população é uma “quasisespécie”, estrutura base deARN é a mesma, se diferem em detalhes, o que não os torna clones. 
Nesse gráfico está relacionando essa diferentes possibilidade de sequencias com “fitness”, que seria a capacidade de gerar descendentes até o valor máximo (hipotético), que seria o máximo de descendentes que poderia se encontrar. Observa-se que temos algumas sequencias que são viáveis e outras inviáveis. As compreendidas dentro da curva são as viáveis e variam de acordo com o fitness. Esse gráfico diz a respeito do ARN.
	Se fosse um gráfico em relação ao ADN, a quantidade de variação de espécie não seria tão grande, seriam muito menos possibilidades de genomas. Isso não quer dizer que vírus de genoma ADN não tenham cepas diferentes, a enzima que faz a sua replicação não exclui a zero essa possibilidade (por ter atividade revisora, mas pode falhar). Leva mais tempo ao vírus ADN do que ao ARN.
	Toda vez que o ARN é replicado ele pode sofrer uma mutação, tendo em vista a taxa de erro da ARN polimerase ARN dependente.
	Efeito gargalo da transmissão: quando nem todas as quasisespécies conseguem efetivamente infectar outro hospedeiro.
	Quem conseguir se infectar, irá carregar sua particularidade genômica para sofrer replicação.