De onde eles vieram

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De onde eles vieram?
 Diversidade genética e investigação forense da espécie de palmeira ameaçada Butia eriospatha
Alison Gonçalves Nazareno • Maurício Sedrez dos Reis
Laianne Lopes
Thyago Caetano
Introdução
Caça de elefantes para marfim (Wasser et al. 2004, 2010) 
Rinocerontes para o chifre (Graham -Rowe 2011) 
No Brasil, a arara-azul (Cyanopsitta spixii) está extinta na natureza (Foldenauer et al. 2007)
Felinos para a sua pele e ossos (Kenney et al. 1995; Check 2006)
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Introdução
No Brasil, 40 milhões de exemplares de animais são capturados na natureza anualmente.
Representando um valor total de varejo de US$ 2,5 bilhões por ano.
Essa quantia não considera o comércio ilegal de plantas, já que os dados sobre a caça ilegal de plantas são raros. 
Embora algumas espécies estejam protegidas por leis ambientais, é preciso abordar o tráfico de espécies a fim de informar e apoiar os planos de conservação e reduzir essa séria ameaça à diversidade biológica.
Identificar e proteger espécies que são ameaçadas pelo comércio ilegal, como a espécie de palmeira vulnerável Butia eriospatha, pode atuar como uma apólice de seguro para preservar o futuro da espécie.
"Pau Brasil" (Caesalpinia echinata) foi colhida e enviada para Portugal em grandes quantidades que a espécie quase se extinguiu (Bueno 2006)
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Introdução
No Brasil, os indivíduos de B. eriospatha têm um alto valor ornamental: 
US$ 3.000.
Na Europa e na América do Norte seu preço varia dependendo do tamanho do caule.
Todos os indivíduos de B. eriospatha vendidos no exterior e no Brasil são caçados ilegalmente, pois não poderiam ser o resultado de várias gerações de sub-cultivo.
Embora a B. eriospatha seja protegida pela lei brasileira, informações sobre as consequências genéticas da extração ilegal ainda são necessárias para apoiar efetivamente os programas de conservação
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Objetivos
(i) quantificar e comparar a diversidade genética de populações selvagens de B. eriospatha com um grupo de indivíduos que foram comercializados ilegalmente e agora são plantados em áreas urbanas;
(ii) estimar a diferenciação genética entre populações selvagens estudadas;
(iii) determinar a população originária dos indivíduos de B. eriospatha urbanos plantados. 
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Foram utilizados nove locos microssatélites polimórficos e avaliada a provável população originária dos indivíduos de B. eriospatha comercializados ilegalmente, utilizando testes de atribuição bayesiana.
Sua distribuição irregular na Mata Atlântica permitiu testar as hipóteses:
Os indivíduos de B. eriospatha comercializados ilegalmente vêm de populações de fontes múltiplas, uma vez que a atual distribuição de plantas nativas é tão fragmentada.
Devido essa origem possuem uma maior diversidade genética.
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Material e Métodos
Espécies de estudo: Butia-da-serra, endêmica da Mata Atlântica.
Fig. 1 – A: Indivíduos de Butia eriospatha em uma população silvestre agrupada (butiazais). 
 B: em uma horta pública na cidade de Florianópolis.
A população selvagem (A) é cercada por estradas (seta) facilitando o acesso a essas áreas para a extração ilegal.
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Material e Métodos
Amostragem e área de estudo:
Foram amostradas oito das 14 populações selvagens de B. eriospatha localizadas no Estado de Santa Catarina.
Amostragem concentrada em populações localizadas nas proximidades de rodovias.
Um total de 360 indivíduos reprodutivos de B. eriospatha, acima de cinco metros de altura, foram amostrados.
O número de indivíduos de B. eriospatha amostrados por população foi de 29 para a população D, 41 para a população C e 50 para A, B, E, F e H. 
Um grupo de 50 indivíduos de B. eriospatha foram amostrados de uma área urbana não nativa, X.
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Fig. 2: Terras altas (áreas cinza-escuro) na Mata Atlântica, onde Butia eriospatha pode ocorrer no Sul do Brasil. Os círculos pretos indicam as oito populações naturais (A – H) e uma área urbana (X) das quais amostras genéticas foram obtidas.
Material e Métodos
Análise de dados de microssatélites:
Verificar o nível de diversidade genética em populações selvagens em comparação com um grupo de indivíduos de B. eriospatha comercializados ilegalmente.
Verificar a homogeneidade genética de cada população silvestre usando um modelo Bayesiano a fim de identificar a população originária dos indivíduos comercializados ilegalmente.
Para investigações forenses, conduziu-se um método de simulação de exclusão de atribuição, com base em dados de genótipos multilocus.
Genotipagem e análises genéticas:
A extração do DNA genômico das folhas foi realizada utilizando o kit NucleoSpin®.
Desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg e do desequilíbrio de ligação foram testados para cada população de B. eriospatha.
Foram calculados: frequências alélicas, riqueza alélica (AR), número de alelos privados (AP) e raros (R; definidos como aqueles com uma frequência menor que 5%), heterozigosidade observada (HO), heterozigose esperada (HE) e índice de endogamia (FIS).
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Material e Métodos
A diferenciação genética foi estimada usando um estimador não-viesado de FST com o FSTAT 2.9.3.
Valores usados para investigar o isolamento pelo padrão de distância.
Identificação de unidades genéticas e análise forense:
Para testar se as populações de B. eriospatha eram geneticamente diferenciadas sem uma classificação a priori dos indivíduos, um modelo Bayesiano foi executado em MCMC, conforme implementado no Structure Program.
O número de populações, K, foi definido de 2 a 8.
Com base na configuração espacial e distribuição das populações de B. eriospatha (FST = 0.36), realizou-se uma análise sob a suposição de que as frequências alélicas em diferentes populações não estão correlacionadas entre si e que alelos transportados em um locus particular por um indivíduo particular originaram-se em alguma população conhecida.
Para identificar uma possível população fonte para os indivíduos de B. eriospatha negociados ilegalmente, os testes individuais foram realizados usando uma abordagem Bayesiana multilocus.
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Resultados
Total de indivíduos: 440;
57 alelos foram identificados em nove locos microssatélites. 
A riqueza alélica (AR) e a heterozigosidade esperada (HE) nos indivíduos de B. eriospatha comercializados ilegalmente diferiram significativamente dos valores calculados em populações selvagens.
Plantas de B. eriospatha que ocorrem na área urbana de Florianópolis apresentam um valor esperado de heterozigosidade um pouco mais alto que os indivíduos de B. eriospatha em populações selvagens. 
A heterozigosidade observada não diferiu significativamente entre os indivíduos de B. eriospatha comercializados ilegalmente e aqueles em populações selvagens.
A heterozigosidade média observada (HO) dentro das populações selvagens foi de 0,36.
Estes valores são consideravelmente menores do que a heterozigosidade esperada, assumindo o equilíbrio de Hardy-Weinberg, com uma média de 0,48.
Dos 13 alelos privados observados, 9 (70%) foram encontrados na área urbana. Observamos um maior número de alelos raros nesse grupo de indivíduos.
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Resultados
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Tabela 1: Estimativas da genética populacional de oito populações de Butia eriospatha (Martius ex Drude) Beccari amostradas no Estado de Santa Catarina, sul do Brasil. Estimativas para um grupo de 50 indivíduos de B. eriospatha amostrados em área urbana, em Florianópolis, Santa Catarina, também são apresentados.
N: estimativa do tamanho da população, n: tamanho da amostra, K: número de alelos, AP: número de alelos privados, R: número de alelos raros, AR: riqueza alélica por rarefação baseada no mínimo tamanho da amostra de 29 indivíduos, HE e HO: heterozigosidades esperadas e observadas, FIS: índice de endogamia, FIS 1: índice de endogamia excluindo os locos segregando para alelos nulos, IC95% 95% erro padrão calculado pelo método jackknife. * Significativo em p < 0,05. nc: não calculado.
Resultados
Nenhum dos pares de locus foi encontrado em desequilíbrio
genotípico significativo após a correção de Bonferroni (p < 0,001).
Como o FIS foi positivo para todas as populações, o excesso de homozigose observado pode ser devido ao efeitos combinados de alelos nulos e endogamia. 
Quando locos com alelos nulos significativos foram omitidos da análise, os valores do FIS1 permaneceram positivos.
Este resultado indica que estas seis populações provavelmente perdem riqueza alélica por endogamia.
A estimativa global da diferenciação genética foi significativa entre as populações de B. eriospatha (FST = 0,23, p <0,05). 
No entanto, a distância geográfica entre as populações de B. eriospatha não explicou o padrão de diferenciação genética observado (isto é, falta de isolamento por distância) indicando que existe um desequilíbrio entre deriva e migração.
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Resultados
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Fig. 3: Gráfico de dispersão da distância genética pareada [FST / (1- FST)] versus distância geográfica (Km) para oito populações de Butia eriospatha (Martius ex Drude) amostradas em Santa Catarina, sul do Brasil. A distância geográfica entre as populações não explicou o padrão de diferenciação genética quantificado pela presença (A) e ausência de alelos nulos (B).
Os alelos nulos inflaram as estimativas de distância genética.
Não foi observado isolamento por distância para as populações de B. eriospatha. 
A matriz de distância geográfica e os valores de FST pareados quantificando a diferenciação genética entre as populações de B. eriospatha são apresentados:
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Tabela 2: Matriz das distâncias geográficas (km; acima da diagonal) e da diferenciação genética (FST; abaixo da diagonal) entre oito populações de B. eriospatha do Estado de Santa Catarina, sul do Brasil, com base em nove locos microssatélites. Em negrito estão os valores FST pareados usando o método de correção ENA (corrige a presença de alelos nulos). Os asteriscos denotam valores que são significativos no nível 0,05.
Discussão
Análise de dados alélicos de microssatélites revelou:
o grupo de indivíduos de B. eriospatha que foram negociados ilegalmente tinha mais variação genética do que todas as populações selvagens estudadas
sugerindo que não há população-alvo preferencial.
A diminuição contínua do tamanho da população de B. eriospatha devido ao comércio ilegal pode comprometer a variação genética que permanece.
A riqueza alélica é altamente afetada pela redução populacional devido à rápida eliminação de alelos raros.
Nas populações selvagens estudadas de B. eriospatha, as consequências genéticas das atividades humanas podem ter levado a uma perda de alelos.
Deriva genética pode contribuir para a perda e fixação de alelos, principalmente se as populações de B. eriospatha diminuem de tamanho e se tornam isoladas espacialmente. 
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Discussão
Teste de exclusão de atribuição multilocus:
corrobora a hipótese de que os indivíduos de B. eriospatha comercializados ilegalmente tinham origens variadas.
Conseguiram identificar a origem da maioria dos indivíduos (n = 27/50 - 54%).
O conjunto de microssatélites utilizados contribuiu para o número de indivíduos (n = 23) que tiveram mais de uma população designada como origem. 
A análise forense para esta espécie de palmeira pode ser melhor esclarecida se os marcadores citoplasmáticos (cloroplasto e mitocondrial) forem usados juntamente com marcadores nucleares para desenvolver perfis específicos de DNA. 
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Discussão
Esse estudou aplicou marcadores moleculares para rastrear a origem geográfica de uma espécie de planta.
Com a novidade de estar tentando identificar uma população específica em vez de uma região geográfica. 
A falta de correlação entre diferenciação genética e distância geográfica sugere que um modelo de ilha pode descrever melhor a estrutura populacional dessa espécie de palmeira.
Ao invés de isolamento por modelo de distância.
A diversidade genética pode ser perdida em apenas algumas gerações devido à endogamia.
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Perspectivas de Conservação
Estratégias mais eficazes de conservação se a mitigação compensatória for direcionada aos compradores de plantas comercializadas ilegalmente:
Coleta de sementes para restauração genética;
Criação de bancos de germoplasma;
Venda de indivíduos adultos B. eriospatha que não são mais reprodutivos podem ser permitidas.
Aspiram desenvolver um banco de dados genético com amostragem geográfica e genética para fornecer aos funcionários responsáveis pela fiscalização da vida selvagem uma poderosa ferramenta de conservação.
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