Relogio Molecular

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Relógio Molecular
Histórico
„ Zuckerkandl & Pauling (1965) 
estudaram hemoglobina em 
mamíferos
„ Perceberam que o número de 
substituições em aminoácidos 
era aproximadamente 
constante em relação ao 
tempo
A controvérsia
„ Taxas de substituição controladas por 
mudanças ambientais e seleção natural 
(para evolucionistas clássicos)
„ Taxas de substituição constantes por 
geração e não pelo tempo cronológico (para 
geneticistas)
„ Tempos de divergência inferidos por 
datações paleontológicas duvidáveis, 
aumentando os erros das estimativas 
O “fim” do debate
„ Utilização de substituições sinônimas 
para testes de constância nas taxas 
de substituição, mostraram a 
constância estocástica do relógio 
molecular
„ Quais processos controlam as taxas 
de mutação?
Mutação × substituição
„ Taxa de mutação → espontânea
„ Taxa de substituição → mutação 
depois da seleção natural purificadora
Conclusão...
„ A heterogeneidade entre as taxas de 
substituição das ordens estudadas é 
pequena o suficiente para assumir o 
relógio molecular 
Citocromo c
Humano Porco Sapo Atum Mosca Trigo Levedura Bacteria
Humano 0 10 17 20 27 38 41 65
Porco 0 11 16 22 40 43 64
Sapo 0 14 20 43 43 65
Atum 0 23 44 43 65
Mosca 0 42 42 65
Trigo 0 42 66
Levedura 0 69
Bacteria 0
Citocromo c
Teoria do relógio Molecular
„ A taxa de substituição de aminoácidos 
(ou nucleotídeos) é aproximadamente 
constante ao longo do tempo 
cronológico
„ Embora o número real de substituições 
varie de forma estocástica
Mas...
„ A taxa varia entre as proteínas (ou 
genes)
„ Proteínas (genes) diferentes →
diferentes relógios para diferentes 
problemas
Taxas diferem entre proteínas
„ Porque proteínas possuem diferentes 
papéis na células
„ Proteínas com papel importante são muito 
vistas pela seleção = baixa variabilidade
„ Proteínas sem papel importante são pouco 
vistas pela seleção = alta variabilidade
Citocromo c
„ Atua na oxidação de alimento para 
produção de energia para metabolismo 
„ Papel importante
„ Conservadas, humano x cavalo = 12% 
de diferenças
Histonas
„ Papel fundamental
„ Proteínas que atuam na compactação 
do DNA em cromossomos
„ Extremamente conservadas: boi ×
ervilha = substituição de 1 aminoácido
Fibrinopeptídeos
„ Segmento do fibrinogênio, atua na 
coagulação do sangue como espaçadores
Humano e cavalo 
diferem em 86%!!
Relógios
Então....
„ Isso não é bom, isso é ótimo
„ Pois proteínas conservadas são usadas 
para resolver problemas antigos
„ Proteínas variáveis são usadas para 
resolver problemas recentes
3as posições evoluem mais 
rápido
Aythya CCA ATC TTC GGG GCA GCT GCC GCC CTG CTC ACA ACC TCA GGA CTA ATC
Gallus ... ... ... ..C ... ..C ..A ..A ..A ..A ..C ... ..T ..C ... ...
Piaya ..C ... ..T ..A ... ATC ..T ... ... ... ..T ..A ..C ... ... ...
Chalcites ... ... ..T ..A ..C ... ... ... ..A ... ..C ..A ... ... T.. ...
Cacomantis ... ... ... ..A ..C A.A ... ... ..A ... ..C ..A ... ... T.. ...
Guira ..C ... ... ..C ... A.C ... ... ..C ... ..T ..A ..C ..C ... ...
Crotophaga ..C ... ... ..A ... A.. ..T ..T ... ... ..T ..A ..T ..C ... ..T
Neomorphus ..C ... ... ..A ... A.A ..T ... ..A ..T ..C ..A ... ..C T.G ...
Corythaixoides ..T ... ... ..A ... ..C ..T ..T ..C ..A ..C ..A ..C ... ... .C.
Corythaeola ..C ... ... ..A ... A.C ... ... ..C ..A ..C ..A ..C ... ... G.T
Musophaga ... ... ... ... ... A.A ... ... ..A ..A ... ... ..T ... ... G.T
Tauraco ... ... ... ..A ... A.A ... ... ..A ..T ... ... ..C ..G ... G.T
Opisthocomus ... ... ... ... ... ..A ... ... ..A ..A ..T ... ... ..G ... ..T
Rhea ... ... ..T ..C ..T ... ... ... ..T T.A ..G ... ..C ..G ..G ...
Mas isso não é tudo...
Se variabilidade = tempo
„ A e B divergiram há 
10 milhões de anos, e 
a distância entre eles 
é de 0,10
„ A distância entre 
A/B e C é 0,20, logo 
A/B divergiram de C 
há 20 Ma
A B C
10 Ma
?
0,10,1
0,1 0,2
Tá bom demais para ser verdade!
„ Realmente, nem sempre o relógio 
funciona
„ Alguns fatores que podem influenciar 
a taxa de mutação:
„ Tempo de geração
„ Mecanismo de reparo
„ Taxa metabólica
O que nos resta???
„ Testar as taxas de substituição das 
linhagens analisadas
„ Como diferenciar a variação estocástica 
de diferenças nas taxas de substituição?
Sarich & Wilson, 1967
„ C é o grupo externo
„ Distâncias entre DAC e DBC são 
calculados utilizando-se modelos 
específicos
„ D = DAC – DBC 
„ Onde:
„ DAC = x1 + x3
„ DBC = x2 + x3
A B C
x2x1
x3
„Teste Z para verificar se D≠0
„Sim = sem relógio
Tajima, 1993
„ C é o grupo externo
„ Nabc número de sítios que 
onde as seqüências A, B e C 
possuem os nucleotídeos a, b 
e c respectivamente
A B C
NjijNijj
„Teste X2 para verificar se Nijj≠Njij
„Sim = sem relógio
Takezaki et al., 1995
„ Desenvolveram dois testes que podem 
ser utilizados em na comparação de 
mais de duas seqüências
„ Two-cluster test
„ Branch-length test
„ A utilização de mais seqüências torna 
o teste mais rigoroso 
Two-cluster test
„ Por exemplo:
„ Lab=(d13 + d23)/(2x1)
„ Lac=(d14 + d15 + d24 + d25)/(2x2)
„ ba=(Lab + Lac - Lbc)/2
„ bb=(Lab + Lbc - Lac)/2
„ Y= ba- bb
„ Teste Z para verificar se Y≠0
„ Sim = sem relógio
1 2
3
4
5
a
b c
„Mede a diferença entre os tamanhos de ramo de dois 
grupos
Branch length test
„ Avalia a diferença da distância de cada seqüência 
até a raiz para a média de todas as seqüências
„Por exemplo:
„X1= bA + bD + bE
„X2= bB + bD + bE
„X3= bC + bE
„X= (bA + bD + bE)+(bB + bD + bE)+(bC + bE)/3
„Teste de desvio normal para Xi-X≠0
„Sim = sem relógio
1 2
3 5
bA bB
bC
bD
bE
4
Construção de árvores 
linearizadas
„ Topologia conhecida
„ Teste de constância das taxas de 
substituição
„ Escolha das seqüências para construção 
da árvore linearizada
„ Calibração do relógio quando possível
Calibração do relógio
„ Eventos biogeográficos
„ Registro fóssil com datação radioativa
Calibrações mais usadas
„ Istmo do Panamá
„ Ilhas Havaianas
„ Separação da África e da América do Sul
A cigana
„ Ave endêmica da Amazônia
„ Grupo irmão composto por aves 
endêmicas da África
„ Ponto de Calibração:
„ Separação da Nova Zelândia da 
Austrália/Antártica
„ Divergência Emeus-Struthio há 82-85ma, 
que isolou a linhagem dos Moas das 
demais aves existentes na região
A cigana
Topologia assumida:
A cigana
„ Resultados
„ Divergência da cigana p o grupo irmão
„ 73 (59 - 89)Ma
„ Divergência entre Ordens de Aves
„ 89 (74 - 106)Ma
„ Divergência entre Super-Ordens
„ 107 (96 - 121)Ma
A cigana
„ Conclusões
„ O tempo de divergência encontrado (73Ma) é 
menor do que a estimativa do período de 
separação da América do Sul e África (90Ma)
„ Alguns pressupostos devem ser assumidos para 
justificar o surgimento dessas linhagens através 
da divergência continental.
Conclusões
„ A taxa de substituição de aminoácidos é 
estocasticamente constante no tempo
„ Cada proteína tem uma taxa diferente, i.e., 
cada proteína é um relógio
„ Proteínas diferentes devem ser usadas 
para problemas diferentes
„ Antes de assumirmos o relógio molecular 
devemos usar testes de linearidade
Estudo de Caso
„ Quatro populações de camarões habitam as lagoas 
da região dos Lagos no Rio de Janeiro
„ Sabe-se que duas delas, espécies 1 e 2, divergiram 
devido à diminuição dos níveis das águas, e 
conseqüente separação das lagoas, há 
aproximadamente 10Ma
1
2
4
3
Pede-se...
„ Sabendo-se que as freqüências do gene A nas 
espécies é:
„ Na sp 1: f(a)=0,9
„ Na sp 2: f(a)=0,6
„ Na sp 2: f(a)=0,2
„ Na sp 2:f(a)=0,8
„ Faça uma matriz de distância par-a-par e 
construa uma árvore de UPGMA para essas 
espécies
„ Calcule os tempos de divergência entre as 
demais espécies