DNA e Eletroforese e outros

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DNA e Eletroforese 
 
Você já aprendeu sobre as enzimas de restrição e como elas clivam o DNA em 
fragmentos. Você também deve ter notado que, em alguns mapas de restrição, uma 
enzima pode produzir muitos fragmentos de DNA. Para realizar a digestão com enzimas 
de restrição, basta acrescentar ao DNA a enzima desejada e deixa-la agir num tempo e 
temperatura apropriados. Antes de a reação começar, a mistura no tubo parece um fluido 
claro. Ao término da reação, a mistura continua clara! Olhando apenas para o tubo, 
como você pode dizer que aconteceu alguma coisa? 
Para verificar o produto de uma reação de digestão com enzimas de restrição, você deve 
ser capaz de visualizar os diferentes fragmentos produzidos. Existem corantes químicos 
que coram o DNA, mas obviamente não é bom adicionar estes corantes à mistura no 
tubo. No laboratório, os cientistas utilizam um processo chamado eletroforese em gel 
para separar os fragmentos de DNA de modo que eles podem visualizar o resultado de 
uma digestão (além de outros procedimentos). 
A eletroforese em gel utiliza a natureza química do DNA para separar os fragmentos. Sob 
circunstâncias normais, os grupos fosfato na cadeia do DNA são carregados 
negativamente. Então, as moléculas de DNA são muito mais atraídas pelo que é 
carregado positivamente. No gel de eletroforese, as moléculas de DNA são colocadas em 
um campo elétrico (o qual tem um pólo positivo e um pólo negativo) e vão migrar para o 
pólo positivo. 
O campo elétrico faz com que as moléculas de DNA se movam, mas para que elas se 
separem e sejam distinguidas umas das outras, todo o processo ocorre em um gel (daí 
vem o nome eletroforese em gel). Para separar o DNA, são utilizados diferentes tipos de 
gel. O gel mais freqüentemente utilizado na eletroforese de DNA é chamado de agarose 
e se comporta como uma gelatina comestível, porém sem açúcar e sem cor. Para fazer 
um gel para DNA (ou para moldar um gel), você deve dissolver a agarose em pó em um 
tampão fervente, colocar em um recipiente apropriado e deixar resfriar. Enquanto isto 
esfria, solidifica. 
Para aplicar o DNA no gel de agarose, utiliza-se um pente apropriado na agarose ainda 
líquida e já disposta no recipiente. Quando a agarose se solidifica e o pente é retirado, 
 2 
permanece uma fila de pequenos orifícios no gel. As amostras de DNA são colocadas 
nos poços antes do início da eletroforese. 
Para a eletroforese, todo o gel é colocado em uma cuba de eletroforese com um tampão 
(água + sal). É aplicada uma corrente elétrica, a qual vai fluir através do tampão e do gel. 
Quando a corrente é aplicada, as moléculas de DNA começam a migrar para o pólo 
positivo do campo elétrico (Figura 2). 
 
 ­ 
 
 
 
 
 
 + 
 
 
Figura 2. Na eletroforese, o gel é colocado em uma cuba com solução salina e é aplicada 
uma corrente elétrica. O DNA carregado negativamente migra para o pólo positivo. 
 
Todo o DNA migra para o pólo positivo, mas o material do gel torna a migração mais difícil 
para as moléculas de DNA maiores do que para as menores. Então, em um mesmo 
período de tempo, um fragmento pequeno de DNA pode migrar muito mais longe do que 
um fragmento grande. Você pode pensar no gel de eletroforese como uma pista de 
corrida onde os “corredores” (as moléculas a serem separadas) se separam como atletas 
em uma corrida real (Figura 3). As moléculas menores correm mais rápidas. Duas 
moléculas do mesmo tamanho vão correr exatamente juntas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cuba de eletroforese com 
solução salina 
      
 
 
 DNA Fonte de energia 
 3 
+ 
+ 
+ 
 
Figura 3. Na eletroforese, os “DNAs pequenos” sempre ganham. 
 
 
Após algum tempo, a corrente elétrica é cortada e o gel é colocado em uma solução 
corante. Após a coloração, o DNA pode ser visualizado. O método mais utilizado pelos 
pesquisadores é a coloração com brometo de etídio. Quando o brometo de etídio se liga 
ao DNA, este fluoresce sob luz ultravioleta (UV). (Obs: O brometo de etídio é mutagênico 
e requer extrema cautela durante a sua utilização e recipientes adequados para descarte). 
O padrão observado é uma série de riscos (bandas) no gel; cada banda é composta por 
moléculas de DNA de um tamanho. Na verdade, existem milhões de moléculas de DNA 
em uma mesma banda, mas elas são do mesmo tamanho (ou de tamanhos muito 
próximos). Após a digestão com enzimas de restrição, o gel deve apresentar uma banda 
para cada fragmento de tamanho diferente produzido na digestão. O fragmento menor 
será aquele que migrou mais longe do poço onde foi colocado a amostra e o fragmento 
maior será aquele que migrou menos (Figura 4). 
 
 
 
 
 
 
 4 
 
A B 
 Amostras 
 
 9.000 (Não há amostras 
 8.000 no restante do gel) 
 
 
 
 4.000 
 3.000 
 
 2.000 
 
 
Figura 4. Uma das finalidades da eletroforese em gel é separar produtos de 
digestão com enzimas de restrição. (A) Mapa de restrição com o tamanho 
dos fragmentos em pares de base. (B) Esquema de um gel após a 
eletroforese. 
 
 
Atividade 
Nas próximas páginas, você tem três representações de uma molécula de DNA (Apêndice 
1) e o esquema de um gel de eletroforese (Apêndice 2). No Apêndice 1 estão 
representados os sítios de três enzimas de restrição diferentes na mesma molécula de 
DNA. Você vai simular a digestão deste DNA com cada uma das três enzimas e então vai 
simular a eletroforese dos fragmentos de restrição em um gel de agarose. 
1. Corte as três figuras da molécula de DNA. 
2. Simule a atividade da enzima de restrição EcoRI na molécula de DNA que mostra os 
sítios da EcoRI, cortando a faixa nas linhas verticais que representam os sítios da 
EcoRI. Após ter “digerido a molécula com a EcoRI” mantenha os seus fragmentos de 
restrição. 
8.000 2.000 3.000 4.000 9.000 
1. Digestão com enzima de restrição 
2. Eletroforese 
3. Visualização e análise do gel 
 5 
3. Agora você vai digerir a segunda molécula de DNA com a BamHI. Preserve os 
fragmentos de restrição obtidos. 
4. Faça o mesmo com a última molécula de DNA, utilizando a enzima HindIII. 
5. Em seu gel de eletroforese imaginário, você vai separar os fragmentos da EcoRI, 
BamHI e HindIII como se você tivesse aplicado estas amostras em poços diferentes e 
adjacentes no gel. Arrume os seus fragmentos como se eles estivessem sido 
separados através de eletroforese em gel de agarose. (Os fragmentos maiores 
devem ficar mais próximos dos poços onde as amostras foram aplicadas). 
6. Agora, separe os fragmentos BamHI e coloque-os adjacente aos fragmentos EcoRI. 
Certifique-se de ter ordenado cada fragmento EcoRI corretamente pelo tamanho com 
relação aos fragmentos BamHI que você já havia disposto. 
7. Repita o mesmo procedimento para os fragmentos HindIII. Agora você deve ter três 
grupos de fragmentos dispostos na sua frente. 
8. Agora olhe para o esquema de um gel de eletroforese dado no Apêndice 2. Note que 
ele tem uma escala de tamanho dado em pares de bases disposta à esquerda dos 
poços do gel. Utilizando esta escala como um guia, desenhe o padrão obtido com a 
digestão que você realizou. Utilize um poço para a digestão com EcoRI, outro para a 
digestão com BamHI e um terceiro para a digestão com HindIII. 
9. Utilize as informações obtidas nas fitas de papel que você recortou para desenhar as 
bandas representando os fragmentos de restrição em pares de bases. 
Todos os fragmentos menores no gel estão na frente dos fragmentos maiores? Você 
notou que o tamanho da escala parece não ter intervalos regulares? Isto ocorre porque 
os fragmentosde tamanhos diferentes se comportam de forma diferente no gel de 
agarose. 
 
 6 
Apêndice 1 
 
Você tem a representação de três moléculas de DNA com 15.000 pares de bases. Cada 
representação mostra a localização de diferentes sítios de restrição (linhas verticais). Os 
números entre os sítios de restrição mostram os tamanhos (em pares de bases) dos 
fragmentos que serão gerados após a digestão do DNA com as respectivas enzimas. 
 
Sítios de restrição da EcoRI 
 
 
 
 
Sítios de restrição da BamHI 
 
 
 
 
Sítios de restrição da HindIII 
 
 
 
 4.000 3.500 2.500 5.000 
 6.000 4.000 3.000 2.000 
 8.000 4.500 2.500 
 7 
Apêndice 2 
 
Esquema de um gel de agarose. 
 EcoRI BamHI HindIII 
 
Escala de tamanho 
em pares de bases 
 
 8.000  
 
 6.000  
 
 
 
 4.000  
 
 3.000  
 
 
 2.000  
 
 
Amostras  
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Plasmídios Recombinantes 
 
Algumas das técnicas mais importantes em Biotecnologia utilizadas hoje envolvem a 
construção de moléculas de DNA recombinantes. O material recombinante é a reunião de 
fragmentos com origens diferentes. Você pode construir uma bicicleta recombinante 
através da união de duas bicicletas diferentes: por exemplo, você pode colocar os pneus 
de uma bicicleta na estrutura de outra. O seu genoma é recombinante porque uma parte 
veio de sua mãe e outra de seu pai. As moléculas de DNA recombinantes são pedaços 
de DNA de fontes diferentes que foram reunidos. Em Biotecnologia, geralmente, uma das 
fontes de DNA é um plasmídio. 
Os plasmídios são pequenas moléculas de DNA circulares. Os plasmídios são copiados 
pelas enzimas de duplicação de DNA da célula porque eles contêm uma seqüência 
especial de bases chamada de “origem de duplicação”. As enzimas de duplicação 
reconhecem esta seqüência especial e começam a sintetizar uma nova molécula de DNA. 
Como você deve imaginar, o cromossomo da bactéria e outros cromossomos também 
apresentam “origem de duplicação”. As origens de duplicação são essenciais para a 
hereditariedade; se a molécula de DNA não tivesse uma origem de duplicação, ela não 
poderia ser copiada pela célula e não seria transmitida às gerações futuras. 
Os plasmídios freqüentemente contêm genes para resistência a antibióticos. Os 
antibióticos são substâncias naturais produzidas pela maioria dos microrganismos para 
matar outros microrganismos quando em competição. A resistência a antibióticos 
também é um fenômeno natural; os microorganismos que produzem antibióticos devem 
ser resistentes pelo menos ao antibiótico que produzem! Nós vamos trabalhar com os 
genes para resistência aos antibióticos ampicilina e canamicina. 
Nesta atividade, você vai reunir plasmídios que carregam genes para resistência à 
ampicilina e à canamicina e então recombinar os dois plasmídios. Nós chamamos o 
plasmídio com resistência a ampicilina de pAMP, o plasmídio com resitência à canamicina 
de pKAN e o plasmídio recombinante de pAMP/KAN. Nós vamos utilizar um modelo de 
plasmídios de papel para mimetizar o processo realizado quando da construção de um 
DNA recombinante. A tesoura vai substituir as enzimas de restrição. A enzima DNA 
ligase, a qual forma as pontes de fosfodiéster entre os pedaços de DNA, será 
 9 
representada pela fita adesiva (ou cola). Nosso resultado será uma molécula de DNA 
recombinante. Os cientistas colocam os plasmídios recombinantes reais em bactérias, 
onde eles vão se multiplicar. As bactérias também se multiplicam, fazendo milhões de 
cópias de moléculas de DNA recombinante e das proteínas que elas codificam. 
 
A construção dos plasmídios pAMP e pKAN 
Localize as fitas de DNA nos Apêndices “Modelo de papel do plasmídio pAMP” e “Modelo 
de papel do plasmídio pKAN”. Em cada faixa, as seqüências de letras indicam as bases 
e as linhas horizontais indicam a cadeia de açúcar e fosfato da molécula de DNA. As 
pontes de hidrogênio entre os pares de base estão localizadas no espaço em branco 
entre as linhas formadas pelas seqüências de letras. 
1. Corte ao longo das linhas sólidas. Retire cada faixa, deixando as linhas sólidas 
intactas. Faça um corte vertical para unir o final aberto de cada faixa formada pelas 
linhas sólidas. Este corte vai remover as marcações 5’ e 3’ de cada fita. 
2. Após ter recortado as três faixas, cole com fita adesiva o final “1” com a área “cole 1”, 
cobrindo as linhas verticais. Cole o final “2” ao “cole 2” e o “3” ao “cole 3” até que 
você complete o modelo circular do plasmídio pAMP. 
3. Utilizando o Apêndice “Modelo de papel do plasmídio pKAN” faça o mesmo 
procedimento descrito acima, montando agora o modelo circular do plasmídio que 
contém o gene de resistência para a canamicina. 
 
Construindo o plamídio recombinante pAMP/KAN 
Agora você tem os plasmídios pAMP e pKAN preparados. Você vai usa-los agora como 
materiais iniciais para construir um plasmídio recombinante. Corte o pAMP e o pKAN com 
as enzimas BamHI e HindIII. Você vai unir os fragmentos de cada plasmídio, criando um 
plamídio pAMP/KAN. 
1. Primeiro, simule a atividade da enzima de restrição BamHI. Lendo da posição 5’ para 
a 3’ (esquerda para a direita) ao longo da fita superior do seu plasmídio pAMP, 
encontre a seqüência de bases GGATCC (sítio de restrição da BamHI). Note que 
esta é uma seqüência palindrômica. Corte através da cadeia de açúcar e fosfato 
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entre as duas G; pare no centro da área em branco que contém as pontes de 
hidrogênio (não corte através de todo o papel). Faça o mesmo com a fita oposta. 
Agora corte através das pontes de hidrogênio entre os dois cortes anteriores e abra o 
plasmídio em uma tira. Cada final da tira deve ter uma pequena seqüência de fita 
simples 3’ CTAG 5’. Marque no final de cada faixa ‘BamHI’. 
2. Agora, simule a atividade da enzima de restrição HindIII. Lendo da posição 5’ para a 
3’ (esquerda para a direita) ao longo da fita superior do seu plasmídio pAMP, encontre 
a seqüência de bases AAGCTT (sítio de restrição da HindIII). Note que esta é 
também uma seqüência palindrômica. Corte através da cadeia de açúcar e fosfato 
entre as duas A; pare no centro da área em branco que contém as pontes de 
hidrogênio (não corte através de todo o papel). Faça o mesmo cortando entre as 
duas A do sítio de restrição da fita oposta. Agora corte através das pontes de 
hidrogênio entre os dois cortes anteriores e abra o plasmídio em uma tira. Cada final 
da tira deve ter uma pequena seqüência de fita simples; uma é o final BamHI e a 
outra é a seqüência 3’ TCGA 5’. Agora você tem dois pedaços de DNA do pAMP. 
Reserve-os. 
3. Utilizando o modelo de plasmídio pKAN, repita os passos 1 e 2. O plasmídio pKAN 
deve resultar em duas partes com os finais marcados. 
4. Pegue o pedaço de plasmídio que contém o gene de resistência à ampicilina e reúna 
ao pedaço contendo o gene de resistência à canamicina utilizando a ‘DNA ligase’ (fita 
adesiva). Certifique-se da complementaridade de bases quando você fizer a ligação. 
Note que o final BamHI não vai parear com o final HindIII, mas vai parear com o outro 
final BamHI. Da mesma forma, o final HindIII deve parear com o outro final HindIII. 
 
Lembre-se de que o DNA é tridimensional. Em nosso modelo, as letras representando as 
bases podem parecer uma em cima da outra, mas no DNA real isto não acontece. Então, 
nesta simulação no papel, as letras representandoas bases não precisam 
necessariamente estar logo acima umas das outras. Certifique-se da direção 5’  3’ da 
fita e que os pares de base estejam corretos. 
Agora você criou um plamídio recombinante pAMP/KAN. 
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Transformação 
É possível introduzir os plasmídios em bactérias utilizando o processo de transformação. 
As bactérias que podem ser transformadas (podem receber DNA exógeno) são chamadas 
de células competentes. Algumas bactérias são competentes naturalmente. Outras 
podem se tornar competentes por meio de um tratamento químico ou físico. Quando a 
bactéria incorpora o plasmídio, ela passa a expressar a resistência ao antibiótico que 
estiver "instruído" no DNA recém adquirido. As bactérias que expressam proteínas novas 
desta forma são chamadas de transformadas. As enzimas de duplicação de DNA da 
célula sintetizam cópias novas do plasmídio, que será, então, transmitido às células-filhas 
quando a bactéria se multiplicar. Neste processo são geradas muitas cópias idênticas de 
genes novos, então, dizemos que estes são genes clonados. 
Após a transformação por plasmídios contendo genes de resistência a antibióticos, as 
bactérias transformadas podem ser detectadas quando são cultivadas em placas 
contendo o(s) antibiótico(s). No meio de cultura contendo antibiótico, apenas as bactérias 
que expressarem o novo gene de resistência ao antibiótico vão formar colônias (as 
bactérias transformadas). Este método de selecionar transformantes (porque eles não 
são os únicos que podem crescem em meio de cultura) é vantajoso porque, normalmente, 
a transformação é um processo bastante ineficiente. Em um experimento típico, apenas 1 
célula em cada 1.000 será transformada. 
 
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Questões 
1. Um sítio de corte feito pela BamHI vai se ligar apenas a um corte que tenha sido feito 
por BamHI. O mesmo é verdade para cortes feitos pela HindIII e pela maioria dos 
sítios de corte das enzimas de restrição. Se você usa dois fragmentos de uma vez, 
quais combinações diferentes poderiam ser formadas a partir dos quatro fragmentos 
que você obteve no exercício 3? Quais destes poderiam ser detectados em colônias 
de transformantes em meio de cultura contendo antibiótico? 
2. Supondo que você fez a atividade com DNA real e pretende transformar bactérias 
com o seu plasmídio pAMP/KAN. Descreva um experimento para crescer as 
bactérias transformadas em placas e selecionar aquelas que tenham sido 
transformadas por pAMP/KAN. Inclua os controles que poderão lhe dizer quais 
bactérias formarão colônias e se o antibiótico está ativo. 
3. Com relação à questão 2, descreva um procedimento para distinguir as bactérias que 
foram transformadas por outras moléculas de DNA que se formaram durante o 
processo de ligação (você descreveu estas moléculas na questão 1). 
4. Freqüentemente, os cientistas combinam um gene de resistência a um antibiótico com 
seja qual for o gene que eles estão tentando clonar. Este gene é então associado a 
um gene de resistência a um antibiótico. Qualquer bactéria que contenha o gene de 
interesse será, portanto, resistente ao antibiótico. Na maioria dos casos, os cientistas 
não têm interesse na proteína que destrói o antibiótico. Porque então os cientistas 
combinam os genes desta forma? 
 
 
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Modelo de papel do plasmídio pAMP 
 
 
1 Gene de resistência à ampicilina 
5' AATTCGATGAATTCXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGAATTCTGAAGGTTCGAAGCGCTAT 
3' TTAAGCTACTTAAGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCTTAAGACTTCCAAGCTTCGCGATA 
 
 
 2 
5' GTCGGATCCAGATCCGAAGTCTCTCTAGGACCTTGCGAAGCCACGTAGTTCAGATTAATGCCTGAT 
3' CAGCCTAGGTCTAGGCTTCAGAGAGATCCTGGAACGCTTCGGTGCATCAAGTCTAATTACGGACTA 
 
 
 3 Origem de duplicação 
5' CGCTACAAGCTTATAGCGGCCXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXAATATTGCGCAGTCTTAGCACTCC 
3' GCGATGTTCGAATATCGCCGGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXTTATAACGCGTCAGAATCGTGAGG 
 20 
Modelo de papel do plasmídio pKAN 
 
 1 Origem de duplicação 
5' TACTCGATGAAATCXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXAGCTATGTTCTGAAGGATCCATATAGCGC 
3' ATGAGCTACTTTAGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXTCGATACAAGACTTCCTAGGTATATCGCG 
 
 
 
 2 Gene de resistência à kanamicina 
5' ATGACCGTCAGATCCGATGCTTCXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXTCGAACGTACGGTCCGA 
3' TACTGGCAGTCTAGGCTACGAAGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXAGCTTGCATGCCAGGCT 
 
 
 3 
5' GATCACATGCTTATAAATATTGCGAAGCTTCAGTCAGCGCGTAGCACTCCTTAACGCGATGCATTAA 
3' CTAGTGTACGAATATTTATAACGCTTCGAAGTCAGTCGCGCATCGTGAGGAATTGCGCTACGTAATT 
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Análise de Restrição 
 
A combinação da digestão com enzimas de restrição e a eletroforese em gel 
freqüentemente é chamada de análise de restrição, pois a informação obtida destes 
procedimentos pode ser utilizada para analisar a estrutura da molécula de DNA. A 
análise de restrição é importante especialmente para verificar a estrutura de moléculas 
de DNA recombinante e na análise de DNA desconhecido. Os exemplos a seguir 
mostram alguns problemas típicos de análise de restrição encontrados pelos 
pesquisadores. 
 
Desafio de análise de restrição I 
Você deseja inserir um fragmento de restrição EcoRI de 1.500 pares de bases em um 
plasmídio (Figura 1). Você digere o plasmídio com EcoRI, pára a digestão, adiciona o 
fragmento de 1.500 pares de bases e liga. Você sabe que este procedimento vai gerar 
uma mistura de plasmídios originais e plasmídios recombinantes. Delineie um 
procedimento de análise de restrição que você poderia utilizar para distinguir entre o 
vetor regenerado e o vetor recombinante. Estabeleça o tamanho dos fragmentos 
esperados. Utilize o esquema de gel fornecido para mostrar os produtos esperados na 
sua análise (um produto por poço). Marque cada poço com o tipo de molécula de 
DNA (plasmídio ou plasmídio recombinante) e os tamanhos dos fragmentos 
esperados. 
 
Desafio de análise de restrição II 
Você deseja remover o fragmento de restrição EcoRI do plasmídio e substituí-lo por 
um fragmento EcoRI diferente mas também de 1.500pb. Você digere o plasmídio com 
EcoRI, pára a digestão, adiciona o fragmento de 1.500 pares de bases e liga (Figura 
2). 
 
 22 
 Vetor incial Esquema do Gel 
A distância entre os sítios de restrição é dada em pares de bases. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fragmento a ser inserido no vetor 
 EcoRI EcoRI 
 
Figura 1. Informação e esquema do gel de eletroforese para o desafio de análise de restrição I. 
 
 Vetor incial Fragmento EcoRI a ser inserido 
A distância entre os sítios de restrição é dada em pares de bases. 
 EcoRI BamHI EcoRI 
 
 
 
 
Figura 2. Informação e esquema do gel de eletroforese para o desafio de análise de restrição II. 
 
Atividade 
A. Desenhe os produtos que você poderia gerar que apresente uma origem de 
duplicação e menos de 7.000pb. (Sugestão: o que são todos os fragmentos 
presentes na reação de ligação?). Marque os produtos A, B, etc. e indique as 
distancias entre os sítios de restrição. 
1.500 pb 
2.000 pb 
EcoRI 
BamHI 
3.000 pb 
1.000 pb 500 pb 
2.000 pb 
EcoRI 
BamHI 
3.000 pb 
EcoRI 
1.500 pb 
Origem 
 23 
B. Descreva um procedimento de análise de restrição que levará você a identificar o 
maior número de produtos possível após uma única digestão. Você pode usar 
mais de uma enzima de restrição na digestão. Estabeleça o tamanho dos 
fragmentos esperadospara cada um dos seus produtos de IIA. 
C. Use o esquema de gel de eletroforese da figura 3 para desenhar o padrão de gel 
esperado de sua proposta de análise para cada um dos produtos mostrados em 
IIA. Marque os poços do gel com o produto (A, B, etc). Marque as bandas com o 
tamanho dos fragmentos (com base na escala fornecida). 
 
Tamanho do 
Fragmento (pb) 
 
7.000 
 
 
4.000 
 
 
2.000 
 
 
1.000 
 
 
Figura 3. Esquema de um gel de eletroforese para o desafio de análise de restrição IIC. 
 
Desafio de análise de restrição III 
Quando os pesquisadores estudam um fragmento de DNA desconhecido, 
freqüentemente, a primeira coisa a se fazer é colocar junto a um mapa de restrição. O 
mapa é então utilizado como um guia quando eles vão estudar os genes codificados 
por este segmento. Como o fragmento é colocado junto ao mapa de restrição? Deve-
se digerir o DNA com enzimas únicas e com combinações de enzimas. Observando-
se os tamanhos dos fragmentos produzidos, os pesquisadores determinam as 
localizações dos sítios de restrição que poderiam resultar no padrão de bandas obtido. 
Agora você vai montar um mapa de restrição (como um quebra-cabeça). Um 
fragmento de DNA linear é digerido com a enzima de restrição EcoRI e resulta em três 
 24 
segmentos: um com 3.000, outro com 3.600 e outro com 3.400 pb. Quando digerida 
com a BamHI, a molécula de DNA gera fragmentos de 4.500, 3.000 e 2.500pb. Um 
digestão dupla com EcoRI e BamHI resulta em fragmentos de 2.500, 500, 3.600, 3.000 
e 400 pb. 
Desenhe um mapa de restrição do fragmento de DNA desconhecido, mostrando as 
localizações dos sítios de restrição EcoRI e BamHI. Indique as distâncias entre os 
sítios de restrição em pares de bases. Indique também a distância e a posição de 
cada um destes sítios com o respectivo nome da enzima.