Eletroforese em Gel: Separando Moléculas

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ELETROFORESE (pag 551)
-A eletroforese em gel é uma ferramenta útil para a separação de macromoléculas de diferentes tamanhos e cargas elétricas. O termo eletroforese provém da palavra grega para “carregar”. É usado porque uma força elétrica carreia as moléculas através de um material semissólido, o gel. As moléculas de DNA têm uma carga elétrica praticamente constante por unidade de massa; assim, elas se separam em géis de agarose (um carboidrato derivado de algas) ou de acrilamida (um polímero sintético) de acordo com o tamanho ou a conformação
-Os géis de agarose são peneiras melhores para moléculas grandes (maiores que algumas centenas de nucleotídios); os géis de acrilamida são melhores para separar pequenas moléculas de DNA
• Usada para separar, identificar e purificar fragmentos de DNA; 
• Bastante sensível, capaz de detectar até 20 pg de DNA;
• Permite a recuperação dos fragmentos após a separação.
APLICAÇÕES DA ELETROFORESE
·para comparar o DNA encontrado no local do crime com o de possíveis suspeitos. 
·teste de paternidade, diferenciação de espécies ou linhagens e engenharia genética. 
·detecção de diferentes patógenos como vírus, bactérias e fungos.
·detecção da expressão de proteínas. 
* Os ácidos nucleicos apresentam uma carga líquida negativa. Com aplicação de uma corrente elétrica eles migram em direção ao polo positivo
ELETROFORESE EM PAPEL 
amostras são aplicadas sob uma tira de papel filtro ou acetato de celulose umedecida em solução tampão.
As extremidades de papel devem ser colocadas em reservatórios separados contendo solução tampão na qual os eletrodos estão imersos. 
Em seguida, uma corrente contínua é aplicada, permitindo que os íons da amostra migrem em direção ao eletrodo de polaridade contrária. A velocidade da migração é influenciada pela carga do íon e em menor grau, pela interação do íon com a matriz do suporte.
ELETROFORESE CAPILAR
realização da eletroforese em capilares muitos finos, que podem variar de 10 a 100 μm de
diâmetro interno, geralmente feitos de sílica, vidro ou plástico. Por serem muito estreitos, esses capilares são capazes de dissipar rapidamente o calor, o que permite a utilização de um
alto campo elétrico, capaz assim de reduzir o tempo de separação da sua amostra. Além disso, devido a alta velocidade de separação, a resolução torna-se mais nítida, visto que o
alargamento das zonas de separação que pode ser causado pela difusão é reduzido.
Os capilares podem ser preenchidos tanto com tampão como também com gel
SDS-poliacrilamida ou até mesmo anfólitos. Essas técnicas possuem um alto poder de resolução.
 Esse tipo de eletroforese se caracteriza como uma técnica analítica visto que é capaz de separar apenas pequenas quantidades de amostra.
ELETROFORESE EM GEL 
A eletroforese em gel é um método mais comumente utilizado na separação de macromoléculas, substituindo a eletroforese em papel. 
As macromoléculas migram em um campo elétrico, atravessando os poros do gel. 
Essa técnica pode ser empregada na separação de DNA, RNA e proteínas. A qualidade do material a ser separado vai definir a composição do gel, que pode ser basicamente de dois tipos: agarose e poliacrilamida 
*A escolha da matriz de separação usada depende principalmente do tamanho dos fragmentos analisados.
-Agarose: Separar fragmentos de tamanhos muito distantes (100 – 3.000 pb) 
polímero linear composto por resíduos de galactose unidos por ligações glicosídicas.
A agarose não é solúvel em temperatura ambiente e precisa ser aquecida e resfriada para 
formação do gel (Gelificação) 32 - 45°C 80 - 95°C
-Poliacrilamida: Maior resolução. Separa fragmentos com até 1 pb de diferença. 
-Etapas da eletroforese 
1) Preparo do Gel Agarose ou Poliacrilamida
2) Migração 
3) Visualização dos fragmentos
ELETROFORESE DE GEL DE AGAROSE
A agarose é um polissacarídeo e forma uma rede que prende as moléculas durante a migração. Dependendo da concentração de agarose, há uma diferença no gradiente de separação, isto é, quanto maior a concentração de agarose, menor o tamanho dos poros e maior a dificuldade da migração dos fragmentos de DNA e de RNA, aumentando o tempo de migração.
Para preparar um gel de agarose, faz-se a mistura entre o pó de agarose e a solução tampão TBE ou TAE. Após a solidificação do gel, coloca-se brometo de etídio, que fará o DNA e o RNA "brilhar" quando exposto ao UV. 
A menores temperaturas o gel ganha consistência. Um detalhe fundamental é a colocação do pente no gel durante o endurecimento. O pente cria poços que serão utilizados para a colocação das amostras de DNA e RNA.
Podemos ver este processo como uma corrida. Cada um é colocado numa pista e na presença de uma corrente elétrica vai deixando o seu rastro. São estes rastros que vamos comparar.
O Tamanho da molécula de DNA e a concentração de Agarose influência na migração 
GEL DE POLIACRILAMIDA
A eletroforese em gel de poliacrilamida (em inglês Polyacrylamide gel electrophoresis - PAGE) é mais comumente utilizada na separação de proteínas, mas também pode ser utilizada na separação de ácidos nucleicos pequenos.
 O gel de poliacrilamida é formado pela polimerização de monômeros de acrilamida na presença de N,N-metilenobisacrilamida, que consiste de duas moléculas de acrilamida ligadas por um grupo metileno e é utilizada como agente formador de ligações cruzadas. 
A polimerização da acrilamida é catalisada por radicais livres, iniciada pela adição de TEMED (N,N,N',N'-Tetrametiletilenodiamina), que catalisa a decomposição de íons persulfato em ânion sulfato e radical sulfato. 
A velocidade de polimerização vai depender de fatores como a concentração de monômeros e de catalisadores. O gel de poliacrilamida é definido em percentual total da acrilamida presente. O poro do gel é determinado pela concentração de acrilamida e N,N-metilenobisacrilamida.
GEL DE SDS-PAGE(eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio)
técnica muito utilizada tanto na bioquímica quanto na biologia molecular com o objetivo de separar proteínas presentes em uma amostra com base no seu peso molecular. Essa separação ocorre através da migração dessas proteínas na malha do gel que estarão sob influência de um campo elétrico. A migração de uma proteína carregada pelo campo elétrico se dá pela sua carga líquida, pelo seu raio molecular e também pelo tamanho do campo aplicado. Porém, em proteínas dobradas naturalmente, sua carga é determinada apenas a partir da soma de sua composição de aminoácidos positivos e negativos. Sendo assim, diferentes proteínas em seu estado nativo, mesmo com pesos moleculares similares, vão migrar em velocidades diferentes. 
Para separar as proteínas com base em seu peso molecular é necessário desnaturar sua estrutura terciária para que a molécula possa ficar linearizada e também camuflar sua carga, função esta realizada pelo SDS. 
PREPARO DA AMOSTRA 
Para o preparo das amostras para o gel, as mesmas devem passar por um processo de lise celular, que vai promover o rompimento de células e organelas. 
Esse tampão é composto basicamente por um detergente associado a um coquetel de inibidores de proteases, que vai evitar a degradação da sua amostra.
 Após essa etapa é feita a separação das frações solúveis e insolúveis por centrifugação e por fim é adicionado o tampão de amostra que irá possibilitar o desenovelamento das proteínas. Além disso, a amostra ainda é aquecida, o que vai favorecer a desnaturação proteica.
MATRIZ DO GEL
COMO OS FRAGMENTOS DE DNA MOVEM-SE ATRAVÉS DO GEL?
Uma vez que o gel esteja na caixa, cada uma das amostras de DNA que queremos examinar (por exemplo, cada reação de PCR ou cada plasmídeo digerido por restrição) é cuidadosamente transferida para um dos poços. Um poço é reservado para uma escada de DNA, um padrão de referência que contém fragmentos de DNA de comprimentos conhecidos. 
A seguir, a caixa é ligada e a corrente começa a fluir através do gel. As moléculas de DNA têm carga negativa devido aos grupos fosfato em seus esqueletos de açúcar-fosfato,assim elas começam a se mover através da matriz de gel, para o polo positivo.
Quando a energia é ligada e a corrente passa através do gel, diz-se que o gel está correndo. 
A voltagem típica para o gel de agarose e DNA correr é na faixa de 808080 - 120 \text{ V}120 V120, space, V.
Uma voltagem maior faz o gel correr mais rápido, mas também pode derretê-lo se a corrida levar um longo período de tempo. 
Uma voltagem mais baixa faz o gel ocorrer mais lentamente (que pode ser conveniente quando se deseja programar a hora de conclusão, por exemplo, para depois do almoço).
Visualização dos fragmentos de DNA
Uma vez que os fragmentos tenham sido separados, podemos examinar o gel e ver quais tamanhos de faixas são encontrados. Quando um gel é pigmentado com um corante que se liga ao DNA e depois colocado sob luz UV, os fragmentos de DNA brilham, o que nos permite visualizar o DNA presente em diferentes locais ao longo da extensão do gel. 
-O bp ao lado de cada número na escada indica quantos pares de base tem no comprimento do fragmento de DNA.
-Uma "linha" bem definida de DNA em um gel é chamada de banda. Cada banda contém um grande número de fragmentos de DNA do mesmo tamanho e todos os que viajaram, como um grupo, para a mesma posição. 
Um fragmento único de DNA (ou até mesmo um pequeno grupo de fragmentos de DNA) não seria visível por si só em um gel. Ao comparar as bandas em uma amostra à escada de DNA, podemos determinar os tamanhos aproximados. 
Faixa 1: banda de 5000 bp. Faixa 2: banda de 100 bp. Faixa 3: bandas de 1500 bp e 2000 bp. 
Faixa 4: banda de 500 bp.
 Quatro faixas são numeradas 
 (A faixa é um corredor através do qual o DNA passa assim que sai de um poço.)
Em um gel de DNA, os fragmentos de DNA mais longos migram mais lentamente através do gel e ficam mais próximos dos poços (onde o gel foi carregado inicialmente). Os fragmentos de DNA menores migram mais rapidamente através do gel e ficam mais próximos da outra extremidade (longe dos poços). No exemplo acima: banda 1 fragmento maior e banda 2 é o fragmento menor
EQUIPAMENTO E REAGENTES USADOS NA ELETROFORESE 
· Agarose
·Cuba e fonte de eletroforese 
·Tampão de eletroforese 
·Marcador de peso molecular 
·Corante fluorescente – corante safer ou brometo de etídio 
·Transiluminador UV ou LED 
EXERCICIOS
Pai 1 pois tem 4 bandas compatíveis com a criança 
Pai 1, herda cromossomos tanto à mãe como do pai 
P-II pode ser o pai da criança, pois há maior quantidade de faixas coincidentes com o padrão da criança;
as faixas de números 3, 9, 10, 14, e 17 correspondem ao DNA que a criança recebeu da mãe;
Outro homem é pai do filho 1 e 3 
Suspeito = S3
Justificativa: Porque os Padrões de VNTR presentes no Suspeito e na Prova devem corresponder (coincidir, serem idênticos).
-O que é uma molécula de DNA recombinante? Uma molécula de DNA recombinante é criada in vitro a partir de partes de duas diferentes moléculas de DNA, frequentemente de duas espécies diferentes. 
-O que são endonucleases de restrição? As endonucleases de restrição são enzimas que clivam moléculas de DNA de maneira sequência específica de tal modo que todos os fragmentos produzidos tenham as mesmas sequências nucleotídicas em suas extremidades. Muitas enzimas de restrição fazem cortes escalonados nas sequências palindrômicas de DNA, produzindo fragmentos com terminações monofilamentares complementares, como é mostrado aqui.
-Como as endonucleases de restrição são usadas para criar moléculas de DNA recombinantes in vitro? Se as moléculas de DNA de duas origens diferentes (talvez espécies diferentes) forem digeridas por uma endonuclease de restrição que reconhece uma sequência de DNA palindrômica e faz cortes escalonados nos dois filamentos, os fragmentos resultantes terão extremidades monofilamentares complementares. A mistura desses fragmentos de DNA ocasiona o pareamento das extremidades complementares, e o acréscimo de DNA ligase produz moléculas de DNA recombinantes, como mostra a ilustração.
-Por que a reação da cadeia de polimerase (PCR) é uma ferramenta útil nas análises de DNA? Como a PCR amplifica as sequências de DNA geometricamente, é possível obter muitas sequências específicas a partir de apenas uma ou algumas moléculas. Ao começar com uma só molécula de DNA, 10 ciclos de replicação produzem 1.024 duplas­hélices de DNA, e 20 ciclos produzem 1.048.576. 
-Como os trifosfatos de 2′,3′­didesoxi ribonucleosídeo são usados nos protocolos de sequenciamento de DNA? Os trifosfatos de 2′,3′­didesoxi ribonucleosídeo atuam como finalizadores específicos da síntese de DNA. Quando se acrescenta um monofosfato de 2′,3′­didesoxi ribonucleosídeo à extremidade de uma cadeia nascente de 1. 2. DNA, essa cadeia não pode mais ser alongada por causa da ausência de 3′­OH necessário para o alongamento. Usando as razões apropriadas de trifosfatos de 2′­desoxirribonucleotídeo:trifosfatos de 2′,3′­ didesoxi ribonucleosídeos nas reações de síntese de DNA in vitro, são produzidas cadeias de DNA que terminam em todas as posições de nucleotídeos possíveis. A separação dessas cadeias de DNA nascentes por eletroforese em gel e a detecção de suas posições no gel com corantes fluorescentes são usadas para identificar as sequências nucleotídicas