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7/3/2012
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SINOPSE
* Assunto: Técnicas de Biologia Molecular.
* Pré-requisito: Conhecimento de Enzimologia, Bioquímica e 
Biofísica dos ácidos nucléicos.
* Objetivo: Reconhecer a aplicação da enzimologia dos ácidos 
nucléicos e técnicas correlatas.
* Bibliografia:
1 – MYR. Genômica.
2 – PIERCE. Genética. Um enfoque conceitual.
3 – WATSON. Biologia Molecular do gene.
4 – STRYER. Bioquímica.
Técnicas básicas de Biologia 
Molecular
Paulo Roberto Queiroz
PhD. Biologia Animal
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PCR
Polymerase Chain Reaction
Reação em Cadeia de Polimerase
Mullis, K. B. and Faloona, F. A. (1987).
Specific synthesis of DNA in vitro via a 
polymerase-catalyzed chain reaction. 
Methods in Enzymology, 155, 335-350.
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Vantagens da PCR
Permite analisar um nº elevado de
organismos ao mesmo tempo.
* Facilidade;
* Versatilidade;
* Rapidez;
* Sensibilidade
* Usar quantidades reduzidas de 
DNA.
INTRODUÇÃO
•Técnica desenvolvida na década de 80.
Mullis & Faloona (1987), Methods in Enzimology,
155: 335-350.
* Função = permite o enriquecimento de um fragmento
específico de DNA.
A cada ciclo o conteúdo de DNA é duplicado de
forma exponencial: f(n) = 2n (n = no. de ciclos).
Na prática � há limitações!!!!
Reação de PCR
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* Utiliza a Taq DNA pol � termoestável.
1 - Especificidade e sensibilidade da reação;
2 - Maior rendimento do produto amplificado;
3 - Possibilidade de amplificação de fragmentos maiores
de DNA.
* A técnica é tão sensível que uma única molécula de DNA pode
em teoria servir como molde para a amplificação.
Etapas de uma reação clássica de PCR
1 – Desnaturação (térmica)� 94 ºC;
2 – Anelamento (os primers se anelam a cada uma das fitas
de DNA molde, onde o fragmento a ser amplificado
encontra-se flanqueado pelos primers)� 35 ºC a 65 ºC;
3 – Extensão (ação da Taq DNA pol a partir da ponta 3’-
OH dos primers)� 72 ºC.
Etapas de uma reação clássica de PCR
1 – Desnaturação (térmica);
Etapas de uma reação clássica de PCR
2 – Anelamento (os primers se anelam a cada uma das fitas
de DNA molde, onde o fragmento a ser amplificado
encontra-se flanqueado pelos primers);
Etapas de uma reação clássica de PCR
3 – Extensão (ação da Taq DNA pol a partir da ponta 3’-
OH dos primers).
Reação de PCR
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APLICAÇÕES
1 – Screening� fragmentos a partir de fago ou bactéria;
2 – Sequenciamento;
3 – Expressão qualitativa e quantitativa de genes
específicos;
4 – Clonagem;
5 – Síntese química de genes;
6 – Diagnóstico;
7 – Exame de vínculo genético (exclusão de paternidade).
CUIDADOS
Em função da sensibilidade da técnica, todas as
manipulações, reagentes, soluções e materiais devem estar
livres de contaminantes. Observar:
1 – Uso de luvas;
2 – Reagentes, soluções e água de boa qualidade e de uso
restrito;
3 – Vidraria preparada adequadamente;
4 – Ponteiras e eppendorfs novos;
5 – Micropipetas de uso exclusivo;
6 – Local de trabalho específico e limpo.
PROTOCOLO PADRÃO
Componentes de uma reação de PCR:
1 – Enzima Taq DNA pol;
2 – dNTP’s (dATP, dTTP, dCTP e dGTP);
3 – Dois iniciadores de DNA;
4 – Magnésio (MgCl2);
5 – Tampão da enzima;
6 – DNA molde.
FUNÇÃO DOS REAGENTES EM UM PCR
1 – Enzima Taq DNA pol;
Realiza a reação de síntese das novas cadeias de
DNA;
Enzima termoéstavel = suporta extremos de
temperatura;
Começa a polimerização a partir da extremidade 3’-
OH do primer.
2 – dNTP’s (dATP, dTTP, dCTP e dGTP);
São incorporados às novas cadeias produzidas pela
ação da Taq DNA pol.
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FUNÇÃO DOS REAGENTES EM UM PCR
3 – Iniciadores de DNA;
Fornece a ponta 3’-OH para a enzima;
Determina o ponto de amplificação na molécula de
DNA.
4 – Magnésio (MgCl2);
Cofator para a atividade de polimerase da enzima;
5 – Tampão da enzima.
Mantém o pH estável ao longo da reação.
Outras informações importantes para o PCR
* Tempo de atividade da Taq DNA pol � 30 min a 95 ºC
� n° máximo de ciclos = 30;
* Tempo de desnaturação de 30 s a 1 min a 94 ºC;
* Tm � ⇑⇑⇑⇑ tamanho do primer e ⇑⇑⇑⇑ conteúdo GC � ⇑⇑⇑⇑ Tm
Tm = 4(G + C) + 2(A + T)ºC
* Tempo de anelamento � 30 s a 1 min
Outras informações importantes para o PCR
* Tamanho do iniciador � a partir de 17-mer.
Ex: iniciador de 16-mer: chance de 416 bases
(4.294.967.296, ou 4 bilhões) de encontrar uma região no
genoma exatamente complementar.
* Ideal: de 19 a 21 nt
* Com primers com ⇑⇑⇑⇑ GC � usar desestabilizadores de hélice
até 10 % � diminuem o Tm:
DMSO (dimetilsulfóxido);
DMF (dimetilformamida);
Uréia ou formamida.
PCR – Usa dois iniciadores de composições diferentes.
Iniciador direto (forward): forma a fita sense. Liga-se na fita 
no sentido 3’�5’.
Ex: 2.128 (5´GGG TCA CCA TAT TCT TGG3´) 
Iniciador reverso (reverse): forma a fita antisense. Liga-se na 
fita de sentido oposto.
Ex: 783 (5´CTC ACG ATG CTG TAC AGA3´).
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Seqüenciamento de DNA
(Método didesoxi de Sanger)
Reagentes:
1 – DNA molde;
2 – Um iniciador (Universal);
3 – dNTP (dATP / dTTP / dCTP / dGTP) = desoxi-NTP;
4 – ddNTP (ddATP / ddTTP / ddCTP / ddGTP) = didesoxi-NTP;
5 – DNA polimerase (fragmento Klenow);
6 – Magnésio (MgCl2);
7 – Tampão de reação.
Princípio do método
São feitas reações para:
Reação A: 4 dNTP e ddATP.
Reação T: 4 dNTP e ddTTP.
Reação C: 4 dNTP e ddCTP.
Reação G: 4 dNTP e ddGTP.
Resumindo...
Os ddNTP’s não possuem a extremidade 3’-OH.
Uma vez incorporados na cadeia de DNA sintetizada,
os ddNTP’s impedem a adição de outro nucleotídeo,
terminando o alongamento da cadeia de DNA.
Por reação, são gerados fragmentos de vários
tamanhos que são separados por eletroforese.
PRINCÍPIO DO MÉTODO
Importante: usar a relação correta do dNTP e ddNTP.
Resultado: obter uma população de cadeias nascentes
terminando em todas as posições de nucleotídeos possíveis.
Ideal: a relação de 100 dNTP para 1 ddNTP normalmente
dá a freqüência de terminação desejada em cada sítio potencial
de terminação.
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Uso de ddNTP’s fluorescentes:
Marcador verde = Adenina
Marcador vermelho = Timina
Marcador preto = Guanina
Marcador azul = Citosina.
Com isso, método automatizado. Uma leitora de
emissão fluorescente detecta o tipo de marcador e fornece
a seqüência do ácido nucléico à medida que os fragmentos
são separados por eletroforese.
O método é feito por PCR.
FRAGMENTO KLENOW
Corresponde a 2/3 do fragmento da DNA polimerase I de
E. coli e é produzido pela clivagem com tripsina.
Características
O fragmento possui as atividades polimerásica 5‘�3' e
exonucleásica 3‘�5' da DNA polimerase I;
Não possui atividade exonucleásica 5‘�3'.
Esta atividade exonucleásica 5‘�3' é crítica para a
técnica, pois se esta atividade estiver presente, ela irá remover o
iniciador a partir da extremidade 5'.
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Perito – Polícia Federal – 2004 - Acerca das propriedades dos ácidos nucléicos e das
técnicas de biologia molecular, julgue os seguintes itens.
a) Uma das estratégias usadas para seqüenciamento de DNA utiliza
didesoxinucleotídios.
b) Seqüenciamento de DNA e PCR são técnicas excludentes utilizadas em biologia
molecular.
c) O processo de seqüenciamento de ácidos nucléicos se vale da massa molecular de
oligômeros.
d) Se o DNA for desnaturado, a técnica de PCR não pode ser realizada.
e) Para o uso da técnica de PCR com a finalidade de amplificar determinada região de
DNA, são indispensáveis dois oligonucleotídios sintéticos.
f) Durante o processo de amplificação de uma seqüência de DNA in vitro, as soluções
utilizadas não devem conter magnésio, cujo íon é um inibidor da polimerase.
g) Na técnica de PCR, as etapas de separação das fitas, anelamento com os primers e
sínteseda fita complementar são realizadas em temperaturas distintas.
h) A amplificação de um fragmento de DNA por PCR é muito eficiente, pois, ao serem
realizados 30 ciclos de reações, são obtidas pouco menos de 1.000 cópias da região
de interesse
C
E
C
E
E
E
C
E