1.Membrana plasmática ESTRUCTURA Y FUNCIÓN

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Membrana plasmática
ESTRUCTURA Y FUNCIÓN
(Capitulo 10 y 11)
Lic. María Noel Sarlabós
¿Cómo podemos observar la membrana para poder estudiarla?
Técnica que utiliza difracción de rayos X para estudiar detalles de la estructura molecular de componentes celulares.
Con esta técnica se puede determinar la posición y tipo de átomo que presenta una molécula en estado cristalino (el cristal presenta un patrón de difracción no difuso y bien definido). Los rayos X son dispersados por los electrones de la muestra, de modo que los átomos grandes con muchos electrones, como el C, el N, el O y el P, se detectan con más facilidad que los átomos pequeños, como el H. El patrón de difracción se recoge en una placa fotográfica. A partir de los resultados se pueden obtener modelos tridimensionales.
Cristalografía de rayos X 
CRIOFRACTURA
Técnica de microscopia electrónica 
Etapas para preparar la muestra: 
Congelación de la muestra (nitrógeno liquido (-195,8°C)) 
 Corte o fractura (cuchilla de diamante)
 Sombreado metálico (platino)
 Observación: microscopio electrónico de transmisión
Poros de la envoltura nuclear
Microvellosidades de célula epitelial
COMPONENTES
LIPIDOS (en mayor proporción fosfolípidos)
GLUCOLIPIDOS
COLESTEROL
PROTEINAS
GLUCOPROTEINAS
Distribución asimétrica
fosfolípidos con colina, fosfatidilcolina y esfingomielina, abundan en la monocapa externa, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina y distintos fosfatidilinositoles predominan en la monocapa citosólica
 glicolípidos como cerebrósidos y gangliósidos son los lípidos de membrana que presentan mayor asimetría ya que son propios de la monocapa externa
El colesterol al igual que las proteínas se distribuyen de forma más o menos equilibrada en las dos monocapas
FOSFOLIPIDOS 
Reorganización de fosfolípidos en medio acuoso
Energéticamente más favorable favorable comparado a la micela 
Se emplean para transportar sustancias entre el interior y el exterior de las células, tales como medicamentos, cosméticos… 
Estructura artificial
Transportan sustancias insolubles en un medio acuoso. Ej: medicamentos
Estructura química de un fosfolípido 
Instauración
1,2,3,4,5y 6 son posibles grupos variables de un fosfolípido
Movimientos de los fosfolipidos
DIFUSIÓN LATERAL
FLIP-FLOP
FLEXIÓN
ROTACIÓN
La fluidez de la membrana depende de la naturaleza de los lípidos: es favorecida por la presencia de lípidos insaturados y de cadena corta . Además la fluidez es mayor si la temperatura aumenta.
https://www.youtube.com/watch?v=jn1o5F23XnI
GLUCOLIPIDOS 
 Presentan distribución asimétrica: solo en la mono capa externa 
 Constituyen el glucocáliz
 Se sintetizan en el Retículo Endoplasmático Liso (REL) y complejo de Golgi por eso se hallan siempre del lado no citosólico de la membrana
Glucolipidos abundantes principalmente en membrana de células nerviosas
Los azúcares expuestos en la superficie celular tiene funciones importantes en las interacciones de la célula con su entorno …
Reconocimiento de superficie celular (ej: determinando el anclaje de bacterias, virus y toxinas)
 Protección frente agresiones físicas o mecánicas
 Transmisión del impulso nervioso (esfingomielinas) 
COLESTEROL
Funciones: Rigidez y estabilidad. Disminuye la movilidad de los primeros grupos CH2 de las cadenas hidrocarbonadas de los fosfolípidos.
Solo presente en membranas de células eucariotas no procariotas
PROTEINAS
 Cumplen la mayoría de las funciones de la membrana (receptores, enzimas, transporte)
 Por su ubicación se clasifican en : transmembrana/integrales o periféricas 
 La ubicación de la proteína indica su función: ej: proteínas transmembrana suelen transportar moléculas y las proteínas periféricas asociadas a la capa citosolica pueden asociarse a la señalización intracelular.
Formas en que las proteínas pueden asociarse a la bicapa:
Hélice alfa única
 Múltiples hélices alfa (mayoría)
 Hebra beta enrollada (barril beta)
 Unidas a la sup. citosólica mediante una hélice alfa que se une a la monocapa citosólica
 Uniones no covalentes con proteínas integrales de membrana
6 y 7. Unión covalente a un oligosacárido o lípido de membrana
INTEGRALES
PERIFERICAS
1
2
4
3
5
6
Uniones covalentes
Las proteinas localizadas en la superficie extracelular se sintetizan en el Retículo Endoplasmático Rugoso de allí viajan al Golgi y son secretadas al espacio extracelular por medio de vesículas. Mientras que las proteinas asociadas a la cara citosolica se sintetizan en ribosomas libres en el citosol
Uniones no covalentes
7
Detienen la traslocación. Según la cantidad de estos péptidos las proteínas pueden ser de paso único o multipaso
PROTEINAS INTEGRALES
 Son anfipáticas: extremo polar/hidrofilico hacia la superficie extracelular o citosolico y un extremo apolar/hidrofobico en la bicapa lipídica
 Para su extracción deben utilizarse procedimientos fuertes de destrucción de membrana: SDS (detergente) es una molécula anfipática que interacciona con los núcleos hidrofóbicos de las proteínas generando la desnaturalización proteica y destrucción de la membrana
PROTEINAS PERIFÉRICAS
 Se localizan hacia la sup. extracelular o citosólica
 Se emplean procedimientos de extracción suaves para extraerlas de la membrana: modificando de forma extrema el Ph, aumentando o disminuyendo la fuerza iónica. De esta forma se interfiere en las interacciones proteicas pero deja intacta la membrana plasmática
Las proteínas también se mueven …
Difusión rotacional
Difusión lateral
Técnica FRAP (recuperación de fluorescencia después de fotoblanqueamiento)
 Mide la velocidad de difusión lateral de proteínas de membrana
 Se requiere de un ligando fluorescente que se una a un anticuerpo especifico para la proteína de estudio
 Primero se decolora “blanquea” una porción de la membrana con un rayo láser que inactiva el ligando fluorescente y luego se recupera la fluorescencia y se mide la intensidad de la misma
Para su estudio
Cualquier regreso de la fluorescencia al área “blanqueada” (sin fluorescencia) se debe a la difusión o transportación de moléculas incorporando fluoróforos 
 A partir de las mediciones de intensidad de fluorescencia obtenidas se pueden calcular coeficientes de difusión de las proteínas de estudio
 Los coeficientes de las diferentes proteínas son diferentes en las diferentes células debido a que las interacciones de cada proteína con otras son distintas y por tanto la difusión de proteínas
Algunas células tienen sistemas que les permite limitar sus proteínas de membrana en dominios específicos de la bicapa lipidica:
ESPERMATOZOIDE (al menos tres dominios de membrana)
CÉLULA EPITELIAL (tres dominios de membrana)
NEURONA (dos dominios de membrana)
Células polarizadas: estructuralmente y funcionalmente
2 dominios: 
-membrana plasmática del axón y terminales nerviosas (envían señales a otras células)
-membrana plasmática del soma y dendritas (reciben señales de otras células)
Cono axónico 
“valla molecular”
2 dominios: 
dominio apical
 dominio basolateral
Unión estrecha “valla molecular”
Existen 4 mecanismos por los cuales se puede limitar la movilidad lateral de ciertas proteínas en la membrana plasmática:
Puede autoensablarse formando grandes agregados proteicos 
 Pueden estar trabadas por interacciones con agregados macromoleculares del exterior (matriz extracelular) 
Pueden estar trabadas por interacciones con agregados macromoleculares del interior de la célula (citoesqueleto).
 Pueden interactuar con proteínas de la superficie de otra célula
VER IMAGEN: pag.613
¿ A partir de qué tipo celular se ha podido profundizar el estudio de la membrana plasmática?
Glóbulo rojo (eritrocito)
¿ Por qué?
Se pueden obtener en gran número
 No tienen organelos. La única membrana que presentan es la plasmática, lo cual puede ser aislada sin contaminación de membranas internas
¿Cómo se obtienen?
Sometiendoa las células en un medio hipotónico se obtienen “fantasmas “ de eritrocitos.
Proteínas más abundantes:
ESPECTRINA: Prot. periférica que se asocia de forma no covalente a la cara citosólica
 GLUCOFORINA: Prot. Integral que se asocia a la membrana en forma de hélice única.
Algunas funciones de la membrana plasmática …
Barrera
 Protección (Glucocáliz)
 Reconocimiento celular (ej. Espermatozoide-ovulo) (Glucocáliz)
 Transporte
 Enzimática
PROPIEDADES
Autosellado: Frente a una rotura en la bicapa esta se reorganiza de modo de que no queden extremos libres (energéticamente es desfavorable).
Fluidez : Determinada por la longitud y grado de saturación de las colas hidrocarbonadas de los fosfolipidos y por el movimiento de lípidos y proteínas. 
MODELO MOSAICO-FLUIDO: modelo de la membrana plasmática
 Modelo propuesto por Singer y Nicolson en 1972 
 Fue propuesto después del estudio de la membrana por microscopia electrónica (estructura trilaminar)
 Explica la organización general de las membranas biológicas 
TRANSPORTE DE MOLÉCULAS A TRAVÉS DE LA MEMBRANA Y SUS PROPIEDADES ELÉCRICAS
 Las células han tenido que desarrollar sistemas de transporte de moléculas hidrosolubles (polares) para poder incorporar nutrientes esenciales, excretar desechos del metabolismo y regular las concentraciones intracelulares de iones.
 La velocidad a la que difunde una molécula depende de su tamaño y solubilidad. Cuanto más pequeña e hidrofobica es la molécula más rápidamente difunde. 
 El O2 y CO2 (pequeñas moléculas apolares) DIFUNDEN RÁPIDAMENTE
 El H20 y la úrea (pequeñas moléculas polares) DIFUNDEN PERO MÁS LENTAMENTE
 Iones y moléculas polares (glucosa) IMPERMEABLES (se transportan por canales o 
 transportadores) 
Dos clases de proteínas de transporte :
 Transportadores (o permeasas o carriers)
 Canales
TRANSPORTADORES
Son proteínas transmembrana multipaso
 Se unen al soluto que van a transportar y sufren una serie de cambios conformacionales que permite su transferencia (esto enlentece el transporte)
 Permiten el transporte pasivo o activo
CANALES
Son proteínas transmembrana que conforman poros. Se abren permitiendo el paso selectivo de iones específicos a través de las membranas celulares
 El transporte a través de estos es más rápido a que si ocurre a través de transportadores ya que estos no se unen al soluto 
 Están involucrados únicamente en el transporte pasivo
 Ejemplo: los canales que forman las uniones gap en las células nerviosas
 Presentan dos propiedades:
 
1. Selectividad iónica: los iones a transportar deben deshacerse de las moléculas de agua asociadas para ser transportadas
2. No están abiertos continuamente: en muchos casos se abren en respuesta a un estimulo: cambio en el voltaje de membrana, unión de un ligando (ej.neurotransmisor)
 
Tipos de transporte
TRANSPORTE PASIVO : DIFUSIÓN FACILITADA y DIFUSIÓN PASIVA
Si la molécula a transportar tiene carga
El transporte depende
Gradiente de concentración 
(diferencia de concentración a ambos lados de la membrana)
Gradiente eléctrico
(diferencia de cargas a ambos lados de la membrana)
Si la molécula a transportar NO tiene carga
El transporte depende 
Gradiente de concentración
Gradiente electroquímico
(sin gasto de energía)
GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN
Transporte pasivo: No requiere gasto de energía
TRANSPORTE ACTIVO
Se requiere de gasto energético ya que el transporte ocurre en contra del gradiente de concentración y/o eléctrico
Formas en la que célula puede realizar transporte activo:
TRANSPORTADORES : ACOPLADOS (cotransporte) y NO ACOPLADOS (uniporte)
 BOMBAS IMPULSADAS POR ATP
 BOMBAS IMPULSADAS POR LUZ
1) TRANSPORTADORES ACOPLADOS: simporte y antiporte
Transporte simporte y antiporte: se libera energía durante el desplazamiento de un ión a favor de su gradiente electroquímico y eso actúa como fuerza impulsora para transportar solutos en contra de su gradiente electroquímico. Ej: cotransporte simporte entre el sodio y la glucosa
El gradiente eléctrico favorece la entrada de iones con carga positiva y se opone al ingreso de cargas negativas
¿Por qué entonces el sodio (Na) predomina en el medio extracelular?
2) BOMBAS IMPULSADAS POR ATP
Bomba Na/K : Se halla en la membrana plasmática de todas las células animales. Actúa como antiportador, bombea 3 iones de Na (sodio) hacia el exterior y dos iones de K (potasio) hacia el interior con un costo de 1 molécula de ATP. 
A esta bomba también se la denomina ATP asa El transporte depende de la autofosforilación y desfosforilación de la bomba.
El gradiente se Sodio producido por la bomba:
Permite el transporte de la mayoría de los nutrientes hacia el interior celular
 Regula el PH citosólico
 Regula la presión osmótica 
Hidrólisis de ATP
Gasto de energía
exterior
interior
3) BOMBA IMPULSADA POR LUZ: 
Se encuentran presentes principalmente en la membrana plasmática de células bacterianas.
Muy estudiada : La bacteriorodopsina, esta es una proteína característica de las archaea. Actúa como bomba de protones, usa la energía de la luz para transportar protones en contra del gradiente al medio extracelular a través de la membrana celular. El gradiente protónico que resulta se convierte posteriormente en energía química mediante la ATPsintasa.
Practico 3. Membrana plasmática
Elodea (medio hipotónico)
El agua se precipita dentro de la célula, y la célula se hincha, pero no se rompe por la capa rígida de la pared. La presión de la célula empujando contra la pared es llamada presión de turgencia.
Los cloroplastos se orientan hacia la periferia de la célula.
Elodea (medio hipertónico)
Como consecuencia de la salida de agua se produce la plasmólisis: el protoplasma se retrae, produciéndose un espacio entre la membrana plasmática y la pared celular.
Los cloroplastos se disponen en el centro de la célula.
Medio hipotónico
Medio hipertónico
La vacuola es la responsable de mantener la rigidez y forma de la célula
Ocupa el 90% del volumen de una célula vegetal adulta 
Elodea ( medio isotónico)
No se modifica la forma de la célula y los cloroplastos se disponen aleatoriamente en el citoplasma
ERITROCITOS
Hemólisis
 (la célula animal no tiene pared celular por lo que puede explotar)
Hemólisis
Crenación 
PREGUNTAS DE EXÁMEN
Explicar el modelo de mosaico fluido de la bicapa lipídica y el movimiento lateral de sus componentes. ¿Cómo hace una célula para estabilizar a las proteínas transmembrana en un lugar fijo? (JULIO 2009)
2) Se desean analizar proteínas mayoritarias asociadas a la membrana plasmática utilizando eritrocitos de mamífero. 
¿Qué ventajas tienen estas células?
 ¿Cómo pueden obtenerse fantasmas de eritrocito?
 Una vez echa una separación electroforética de proteínas asociadas a fantasmas de eritrocito se encuentra que hay dos que son mayoritarias. Menciónalas y diga como están asociadas a la bicapa (AGOSTO 2007).
3) Diseñe un experimento que le permita demostrar la capacidad de difusión lateral de una proteína en el plano de la bicapa lipidica (MARZO 2007, FEBRERO 2016).
4) Los glicolipidos son componentes abundantes de la membrana plasmática (AGOSTO 2005).
¿ Cuáles son sus características estructurales más importantes?
 ¿Tienen alguna localización particular en la bicapa? 
 ¿Dónde se sintetizan?
5) Respecto a las proteínas integrales de membrana (FEBRERO 2010)
Mencione brevemente de qué maneras pueden encontrarse asociadas a la bicapa lipídica
 Describa el mecanismo de síntesis e inserción de un polipéptido que atraviesa varias veces la bicapa lipidica 
6. Considere una célula epitelial. ¿Qué elementos son indicativos de que se trata de una célula polarizada? Escriba una aproximación experimental quele permita demostrar si una célula determinada está polarizada.
7. “Las neuronas son células polarizadas”. Explique en que aspectos de la función, morfología y organización macromoleculares se basa esta afirmación.
Práctico 1. Microscopio
Ecuación de Abbe: Cálculo del limite de resolución de un microscopio
n= índice de refracción del medio que separa el objeto de la lente objetiva
= ángulo de incidencia de la luz en la lente
Limite de resolución: menor distancia entre dos objetos para poder ser distinguidos como entidades independientes. Para el ojo humano esta distancia es de 100 micras
¿De qué depende el limite de resolución?
1. Longitud de onda
Longitudes de onda cercanas al violeta mejoran el poder de resolución
= ángulo de incidencia de la luz sobre la muestra 
3. Índice de refracción: medio entre la lente objetiva y la muestra 
n= 1 (aire)
n= 1,33 (agua)
n= 1,55 (aceite y vidrio) 
Cuánto mayor sea n mayor es el limite de resolución del microscopio ya que los rayos de luz que atraviesan la muestra se desvían menos
2. 
Resolución y aumento (magnificación) no son lo mismo
Magnificación = tamaño de la imagen
Resolución= detalles de la imagen
Microscopio electrónico (barrido)
Microscopio óptico
TIPOS DE MICROSCOPIOS
Óptico/ luz
Electrónico
Microscopio de luz: La imagen es obtenida por una simple transmisión de luz a través del preparado
Tipos:
Microscopia de campo claro (práctico) 
Preparación de la muestra:
Fijación: conservar la estructura celular o tisular. Medios físicos (ej: congelación) o químicos (ej: alcohol). 
 Inclusión: Se incluye a la muestra en un bloque rígido para poder realizar cortes finos de la muestra (ej: resina) 
 Corte: Mediante un instrumento denominado micrótomo 
 Tinción: Ejemplos: Hematoxilina-Eosina
2) Microscopia de contraste de fase: contraste natural de la muestra
 Se emplea cuando es necesario mantener inalterada la muestra sin matarla o teñirla, por ejemplo para seguir el transcurso de un proceso biológico. Ej. División celular
3) Microscopia de contraste de fase de Nomarski
 Similar a la de contraste de fase pero su resolución es mayor. Genera un falso volumen de la muestra 
4) Microscopia de epifluorescencia
Se emplean fluorocromos para marcar ciertas estructuras celulares
 Los fluorocromos pueden estar acoplados a moléculas como anticuerpos (inmunofluorescencia) 
5) Microscopia láser confocal
 Fluorescencia con mayor resolución (elimina la señal fuera de foco)
a,c,e (microscopia de epifluorescencia)
B,d,f (microscopia de láser confocal)
Microscopía electrónica
 Emplea un haz de electrones en lugar de un haz de luz como fuente de radiación
 Mayor poder de resolución comparado a la microscopia de luz (porque la longitud de onda de los electrones es menor que la de la luz)
 No permite observar preparados in vivo
Dos tipos: de transmisión y barrido (MET y MEB)
MET: cortes ultrafinos , aumenta un objeto hasta 1 millón de veces
 Preparación de la muestra:
Fijación (glutaraldehido) 
 Corte (ultrafinos): 40-70 nm
 Tinción (metales pesados como el citrato de plomo): el metal es buen conductor de electricidad.
MEB: no es necesario cortar la muestra, puede aumentar un objeto hasta 200.000 veces o más. Permite observar en tres dimensiones !!!
MET .. Diferentes técnicas …
Técnica de rutina (uniones intercelulares, organelos)
 Técnica de inmunomarcación (localización de moléculas)
 Técnica de tinción negativa (microorganismos, complejos macromoleculares)
 Técnica de sombreado rotativo con metales (macromoléculas, microorganismos)
 Técnica de criofractura (membranas biológicas)
Técnica de criograbado profundo (elementos intercelulares no solubles: filamentos intermedios) 
MEB …
Técnica de rutina
La preparación depende del tipo de muestra y de información que busquemos obtener …
MET- técnica de rutina
MET- técnica de inmunomarcación con oro coloidal
Uniones intercelulares
Localización subcelular de receptores metabotrópicos de glutamato
MET- tinción negativa
MET- técnica de criofractura
Bacterias
Núcleo celular
MEB
¿Por qué electrón densa y electrón lúcida?
Depende del grado de afinidad de las estructuras por los metales empleados para el contraste. 
A mayor cantidad de metal depositado mayor electrodensidad. 
Electrón lucida 
Electrón densa 
Núcleo interfásico
Membrana plasmática: estructura trilaminar
Electrón densa
Electrón lúcida