Amostras Biológicas - Tiipos, concentração e diluição -Testes sorologicos 2014-2

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A t Bi ló i Obt ãAmostras Biológicas : Obtenção,  
D i l u i ç ã o E Concentração 
Prof. Paulo Miranda
UFPE
à ÕCLASSIFICAÇÃO DAS SOLUÇÕES
QUANTO AO ESTADO FÍSICOQUANTO AO ESTADO FÍSICO: 
∙ sólidas 
líquidas∙ líquidas 
∙ gasosas 
QUANTO À CONDUTIVIDADE ELÉTRICA:QUANTO À CONDUTIVIDADE ELÉTRICA: 
∙ eletrolíticas ou iônicas 
∙ não‐eletrolíticas ou moleculares 
QUANTO À PROPORÇÃO SOLUTO/SOLVENTE: 
∙ diluída 
∙ concentrada 
∙ não‐saturada 
saturada∙ saturada 
∙ supersaturada 
SOLUÇÕESSOLUÇÕES
Soluções = Misturas homogêneas
∙ Soluto = aquele que está sendo dissolvido. 
∙ Solvente = dissolve o soluto.
∙ Massa solução = massa soluto + massa solvente.
∙ Volume solução = volume soluto + volume solvente.
∙ Coeficiente de solubilidade = quantidade máxima de soluto que pode ser 
dissolvida em 100g de solvente, depende da temperatura do sistema.
f d l b l d d d b â é l ( dEx.: a 25oC o coeficiente de solubilidade da substância X é igual a 35 (35g de X são 
dissolvidos em 100g).
ClassificaçãoClassificação
∙ Saturada = quantidade de soluto igual ao coeficiente de solubilidade.
∙ Insaturada = quantidade de soluto inferior ao coeficiente.
S t d tid d d l t i fi i t∙ Supersaturada = quantidade de soluto superior ao coeficiente.
Ex.: solução contendo 35g de X em 100g de solvente a 25oC ‐‐‐‐SATURADA 
Solução contendo 50g de X em 200g de solvente a 25oC ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐INSATURADA.
Solução contendo 25g de soluto em 50g de solvente a 25oC ‐‐‐‐SUPERSATURADA
DILUIÇÃOÇ
 Definição 1: Diminuição da concentração de uma Solução Definição 1: Diminuição da concentração de uma Solução 
, adicionando mais Liquido;
 Definição 2: Volume de concentrado no Volume total da 
SoluçãoSolução ;
 Definição 3:  Quantidade relativa de uma Substância em 
uma Solução.
DILUIÇÃO
Diluentes Aplicação de uso
Ç
Diluentes Aplicação de  uso
 
PBS Imuno/Hemat./BioqPBS Imuno/Hemat./Bioq
 
Salina Bioq./Imuno/Hematq / /
 
PBS‐Tween Bioquímica‐Imuno.q
 
Água destilada Uso geral 
 
 
DILUIÇÃODILUIÇÃO
Fórmula :
Vi Ci Vf CfVi x Ci =  Vf x Cf
 Vi = Volume  inicial
 Ci = Concentração inicialCi  Concentração inicial
 Vf = Volume final
 Cf = Concentração final Cf = Concentração final
CONCENTRAÇÃOCONCENTRAÇÃO
 Quantidade relativa de uma Substância em uma 
S l ãSolução.
 Concentrar é tornar mais densa uma Solução.ç
 Pode ser medida de três maneiras:
/ Unidade de Massa / Unidade de Massa.
 Unidade de Massa / Unidade de Volume.
 Unidade de Volume / Unidade de Volume.
CONCENTRAÇÃOÇ
 Métodos de Concentração  :
 Osmose Reversa
 Filtração
 Centrifugaçãog ç
 Evaporação
 Liofilização Liofilização
 Cromatografia
TIPOS DE CONCENTRAÇÃOTIPOS DE CONCENTRAÇÃOTIPOS DE CONCENTRAÇÃOTIPOS DE CONCENTRAÇÃO
∙ % EM MASSA:      massa de soluto_ x 100 / massa de solução
∙ % EM VOLUME:   volume de soluto_ x 100 / volume de solução 
(só é usada quando soluto e solvente são ambos líquidos ou (só é usada qua do so uto e so e te são a bos qu dos ou
ambos gasosos) 
∙ CONCENTRAÇÃO EM g/L: massa de soluto em gramas/volume de∙ CONCENTRAÇÃO EM g/L:  massa de soluto em gramas/volume de 
solução em litros
CONCENTRAÇÃO EMmol/L: quantidade de soluto (mol)/volume∙ CONCENTRAÇÃO EM mol/L:   quantidade de soluto (mol)/volume 
de solução em litros
à d d d l∙ CONCENTRAÇÃO EM MOLALIDADE:    quantidade de soluto 
(mol)/massa do solvente em kg
∙ CONCENTRAÇÃO EM FRAÇÃO MOLAR DE SOLUTO:   quantidade 
de soluto (mol)/quantidade de solução (mol)
TITULAÇÃOÇ
 Concentração de uma Solução Expressa por  Títulos.
 Menor quantidade de uma Substância que produzirá um 
d f i i ló iProduto ou Efeito Biológico.
 Inversamente proporcional a Diluição. 
Amostras utilizadas em imunoensaiosAmostras utilizadas em imunoensaios
AMOSTRAS MAIS UTILIZADAS: SANGUE TOTAL 
(fenotipagem), PLASMA, SORO E POR VEZES PBMCs
(Citometria de fluxo) OU TECIDOS (Reações de 
i fl ê i /i it í i )imunofluorescência/imunocitoquímica).
Fatores como: idade, sexo, gravidez, etnia, uso deFatores como: idade, sexo, gravidez, etnia, uso de
medicamentos, período menstrual, gravidez,
exercícios e janela imunológica podem interferir no
resultado do exame.
J j d d d 4 8 h il iJejum recomendado de 4‐8 h: quilomicrons, amostras
hiperlipêmicas podem interferir no resultado; não
beber café sucos ou chás (aumenta o cortisolbeber café, sucos ou chás (aumenta o cortisol
plasmático); pode beber água.
Composição do sangue
Obtenção de soro ou plasmaObtenção de soro ou plasma
FatoresFatores queque interfereminterferem comcom aa qualidadequalidade dada amostraamostra::
T t l t t if ã ( d‐ Tempo entre coleta e centrifugação (no caso de soro,
esperar a retração do coágulo, 30‐60 min)
‐ Centrífuga: velocidade de rotação, temperatura e
tempo de centrifugação
‐ Separar o soro ou plasma obtido após centrifugação
das células sanguíneas.
* Para obtenção de plasma, utilizar tubos com
anticoagulante (Heparina, EDTA...)
Armazenamento e transporteArmazenamento e transporte
‐As amostras biológicas devem ser
conservadas a ‐20° C ou – 80° C ou 2‐4° C porconservadas a ‐20 C ou 80 C ou 2‐4 C por
1 semana.
‐Alíquotas com pequenos volumes
‐ Ao transportar amostras biológicas os tubosAo transportar amostras biológicas, os tubos
devem ser mantidos fechados (risco de
contaminação) e refrigerados casocontaminação) e refrigerados, caso
necessário.
Outros espécimes biológicos utilizados:Outros espécimes biológicos utilizados:
1)1) UrinaUrina (determinações(determinações hormonais/drogas/hormonais/drogas/AgsAgs//AcsAcs
2)2) LCRLCR (pesquisa(pesquisa dede AgsAgs ee AcsAcs bacterianos,bacterianos, viraisvirais ee parasitáriosparasitários2)2) LCRLCR (pesquisa(pesquisa dede AgsAgs ee AcsAcs bacterianos,bacterianos, viraisvirais ee parasitáriosparasitários
ee doençasdoenças crônicocrônico‐‐degenerativasdegenerativas dodo SNC)SNC)
3)3) LíquidoLíquido amnióticoamniótico (estudo(estudo dede infecçõesinfecções congênitas)congênitas)3)3) LíquidoLíquido amnióticoamniótico (estudo(estudo dede infecçõesinfecções congênitas)congênitas)
4)4) LíquidoLíquido sinovialsinovial (artrites(artrites dede etiologiaetiologia autoauto‐‐imuneimune))
5)5) FezesFezes (pesquisa(pesquisa dede AgsAgs atravésatravés dede AcsAcs monoclonaismonoclonais::
rotavirusrotavirus,, EntamoebaEntamoeba histolyticahistolytica;; EnsaiosEnsaios dede aglutinação,aglutinação,
DOTDOT ELISA)ELISA)DOTDOT‐‐ELISA)ELISA)
6)6) SalivaSaliva (pesquisa(pesquisa dede hormônioshormônios ,, drogas,drogas, AgsAgs ee AcsAcs))
7)7) SêmenSêmen (suspeita(suspeita dede AcsAcs antianti‐‐espermatozóideespermatozóide))
Biossegurança e descarteBiossegurança e descarteBiossegurança e descarteBiossegurança e descarte
 A Biossegurança aborda todos os grupos: paciente,
pessoal do laboratório, meio ambiente, comunidade
externa.
 D t fi l d t i i íd f it d f Descarte final dos materiais e resíduos feito de forma
correta é essencial para segurança individual e pública.
 N B il ti d 1995 CNTBi (C i ã No Brasil, a partir de 1995, a CNTBio (Comissão
Nacional Técnica de Biossegurança) estabeleceu regras
de controle e descarte de materiais biológicos queg q
devem ser seguidos pelos laboratórios clínicos e de
pesquisa, além de suas próprias regras de
biossegurançabiossegurança.
RDC 306/2004 ‐ Dispõe sobre o Regulamento Técnico
para o gerenciamento de resíduos de serviços de saúdepara o gerenciamento de resíduos de serviços de saúde.
Cálculo de concentração de amostra biológica Cálculo de concentração de amostra biológica 
(Unidade/Volume)(Unidade/Volume)
=
Questões:
1 Q l tid d d= 
parasita
4ml
1. Qual a quantidade de
parasitas em 3 ml?
2 ã i á i4ml
3ml
2. Dessa suspensão parasitária,
2 parasitas devem ser
submetidos a eletroforese Como
2ml
1mlsubmetidos a eletroforese. Como
devo proceder?
10 parasitas 1ml (1000 l)1ml 10 parasitas 1ml (1000l)
2 parasitas X
10 parasitas/ml X = 0,2 ml (200 l)
Dil i ã i d tili d tit l õDiluição seriada: utilizada em titulações 
de amostras e reagentes
Ex: diluição seriada, fator 2 (1:2), volume final 200l.Ex: diluição seriada, fator 2 (1:2), volume final 200l.
200 l 200 l 200 l 200 l200 l       200 l     200 l   200 l     
200 l      200 l 
200 l
Soro
200 µl
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128

(PBS)200 200 ll
(PBS)(PBS)
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128
Obtenção de solução menos concentrada a Obtenção de solução menos concentrada a 
partir de uma solução mais concentrada.partir de uma solução mais concentrada.
Informações importantes: Volume e concentração desejada.
S l ã A Exemplo:Solução A
(200 g/ml)
Exemplo:
Volume = 26 ml (26000 l)
Concentração = 3 g/ml( g )
2 ml Volume
Concentração 3 g/ml
C1 x V1 = C2 x V2
200g x ? = 3g x 26ml
(2000l
)
3 x 26 = 0,390 ml ou 390 µl da solução A
200
)
Tenho 2ml da solução A a 200 µg/ml.
Q bt 26 l d l ã B
Para preparar a solução B a 3µg/ml, com
vol. final 26 ml.
25610 l d PBS 0 390 l dQuero obter 26 ml da solução B, com
concentração de 3 g/ml, a partir da A. 25610 l de PBS + 0,390ml da solução A
Diluição de amostras
Exemplo: 1:100, volume final 50 µl (poço de ELISA)
1 ----- 1001 100
X ----- 50 µl = 0,5 µl de amostra + 49,5 µl de tampão.
Soluçõesç
8g de8g de Completar para 1 28g de 8g de 
BSABSA
Completar  para 
100ml do diluente.
Solução de BSA      70
ml
100ml
Substância líquida. Ex: Álcool a Substância líquida. Ex: Álcool a 
70% ( / )70% ( / )
Substância em pó.  Ex: BSA a Substância em pó.  Ex: BSA a 
8% (p/v)8% (p/v)
1 2
a  8% (p/v).                 ml
70% (v/v)70% (v/v)8%. (p/v)8%. (p/v)
Formas de fazer uma diluição de 1/2Formas de fazer uma diluição de 1/2
1
2
1
4
1
8
1
16
1
322 4 8 16 32
1
2
1
10
1
50
1
250
1
12502 10 50 250 1250
1
2
1
20
1
200
1
2000
1
20.0002000
ÍVÍDEO
Testes de imunodiagnóstico naTestes de imunodiagnóstico na 
patologia clínica e seus parâmetros
Prof. Paulo Miranda
Diagnóstico de certeza de um processo Diagnóstico de certeza de um processo 
patológico:
Demonstração do patógeno ou de seus produtos 
nos tecidos ou fluidos biológicos.
Nem sempre é possível:
-Ausência do agente infecciosog
-Falta de sensibilidade dos métodos utilizados
-Falhas técnicasFalhas técnicas
-Demora do resultado (cultura)
MÉTODOS IMUNOLÓGICOS DIRETOS OU INDIRETOS 
têm sido utilizados para suprirem a deficiência dos 
métodos parasitológicos ou microbiológicos.
Vantagens da utilização dos métodos de Vantagens da utilização dos métodos de 
imunodiagnóstico:
-Rapidez
-Simplicidade de execução
-Automação
-Baixo custo operacional
Como?
P i d A A i lPesquisa de Acs, Ags e imunocomplexos.
Interpretação correta dos resultados + investigaçãoInterpretação correta dos resultados + investigação
clínica + epidemiologia compatível = Diagnóstico da
patologia.
Emprego dos testes de Emprego dos testes de 
imunodiagnóstico:
) i d i di ó i1)Pesquisa de anticorpos no diagnóstico
individual
2)Pesquisa de anticorpos em inquéritos
soroepidemiológicos
3)Pesquisa de antígenos
1) Pesquisa de Acs no diagnóstico individual:
- Elucidar processos patológicos com sinais e
sintomas clínicos confundíveissintomas clínicos confundíveis.
Ex.: Toxoplasmose e Mononucleose infecciosa
Diferenciar a fase da doença- Diferenciar a fase da doença.
Ex.: IgM (fase aguda); IgG (fase crônica)
Di ti d ê it- Diagnosticar a doença congênita
Ex.: Presença de IgM no cordão umbilical contra T. pallidum
1) Pesquisa de Acs no diagnóstico individual:
- Selecionar doadores de sangue
Ex : Triagem sorológica para sífilis hepatites B e C HIV Chagas HTLVEx.: Triagem sorológica para sífilis, hepatites B e C, HIV, Chagas, HTLV
e malária.
- Selecionar doadores e receptores de órgãos
para transplantes.
Ex.: Acs específicos para determinantes estruturais que caracterizam 
Ags do HLA (Human Leukocyte Antigens)g ( y g )
- Avaliar o prognóstico da doença
Ex.: Presença de Acs anti-HBe na hepatite BEx.: Presença de Acs anti HBe na hepatite B
1) Pesquisa de Acs no diagnóstico individual:
- Avaliar a eficácia da terapêutica.
Ex : queda gradual dos níveis de AcsEx.: queda gradual dos níveis de Acs
- Avaliar a imunidade específica naturalmente
adquirida ou artificialmente induzidaadquirida ou artificialmente induzida
Ex.: Acs produzidos pós vacinação
- Verificar o agravamento da patologia- Verificar o agravamento da patologia
Ex.: Presença de auto-anticorpos
2)P i d ti i é it 2)Pesquisa de anticorpos em inquéritos 
soroepidemiológicos:
- Estabelecer a prevalência da doença
Ex : Prevalência sorológicaEx.: Prevalência sorológica
- Verificar a erradicação da doença
Ex : Ausência de Acs nos testes sorológicos em indivíduos moradoresEx.: Ausência de Acs nos testes sorológicos em indivíduos moradores
de área endêmica (acompanhamento sorológico)
- Verificar a reintrodução de novos casos emç
áreas consolidadas
Ex.: Presença de Acs IgM ou aumento dos níveis de IgG
3) I tâ i d t t ló i 3) Importância dos testes sorológicos na 
pesquisa de antígenos
- Como critério de cura
Ex : Teste de pesquisa de Ags negativo para determinada patologiaEx.: Teste de pesquisa de Ags negativo para determinada patologia
- Na definição da etiologia da doença
Ex : Presença de Ags específicosEx.: Presença de Ags específicos
- Na seleção de doadores de sangue
E P i d A i l t d t i t d j l i ló iEx.: Pesquisa de Ag circulante em detrimento da janela imunológica.
- Em inquéritos epidemiológicos
Utilização de Anticorpos Monoclonais
Parâmetros para validação de 
um teste sorológico
Conceitos:
DOENÇA
Presente Ausente 
FP
T
E
Presente Ausente 
+ VP a b
VN T
E
S
T
- FN c d
VP = Verdadeiro Positivo
FP = Falso Positivo
FN = Falso Negativo
VN = Verdadeiro Negativo
Conceitos:
11)) S ibilid dS ibilid d11)) SensibilidadeSensibilidade
Porcentagem de pacientes com teste + detectados numa
população de doentes.p p ç
S = A/(A + C)
22)) EspecificidadeEspecificidade
Porcentagem de indivíduos com teste – em uma população
sabidamente não infectada.
E = D/ (B + D)
Quanto maior a E, menos FP (reações cruzadas)
Conceitos:
Sensibilidade e especificidade
Doentes Normais
Teste +
Teste -
Teste +
Teste -
Sensibilidade
(90%)
Especificidade
(80%)( ) ( )
Conceitos:
33)) Eficiência,Eficiência, acuráciaacurácia ouou precisãoprecisão
Refere-se à relação entre o nº de resultados corretos (VP + VN) e o total
de indivíduos testados.
Eficiência = A + D/(A + B + C + D)
44)) PrevalênciaPrevalência
RefereRefere--sese aoao nºnº de casos de uma doença (VP + FN) numa determinada
população.população.
P = A + C/(A + B + C + D)
DOENÇA
E
Presente Ausente 
Conceitos:
FP
VN
T
E
S
T
E
+
FN
VP aa bb
dd
55)) P lê iP lê i ló iló i
VN - FN c dc d
55)) PrevalênciaPrevalência sorológicasorológica
Refere-se a porcentagem de casos positivos pelo teste (VP + FP) numa
população.
Ps = A + B/(A + B + C + D)
66)) ValorValor PreditivoPreditivo PositivoPositivo))
Refere-se à probabilidade de doença quando o resultado do teste é + (VP
+ FP).
VPP = A/(A + B)VPP = A/(A + B)
DOENÇA
Presente Ausente Conceitos:
FP
VNT
E
S
T
E +
FN
VP a       ba       b
c dc d
6) Valor Preditivo Negativo
VN - FNc       dc       d
) g
Refere-se à probabilidade de não ocorrência de doença quando o resultado do
teste é – (VN + FN).
VPN = D/(C + D)VPN = D/(C + D)
7) Limiar de reatividade ou “cut-off”
Ponto a partir do qual o teste será considerado positivo.
Pode variar de acordo com o objetivo do teste:
- Triagem de doadores de sangue (alta sensib.)g g ( )
- Certeza diagnóstica (alta espec.)
C itConceitos:
7) Limiar de reatividade ou “cut-off”
 
L im ia r de rea tiv idade 
(cu t o ff)
Ferreira & Á vila , 2001 .
Corte em :
 = m áx im a sens ib ilidade
 = m áx im as sens ib ilidade e 
espec ific idade
 = m áx im a espec ific idade
q
u
ê
n
c
i
a
 
 
 
 
 
 
 
 
ê
n
c
i
a
 
 
 
 
 
  
F
r
e
F
r
e
q
u
1 4 /27
C itConceitos:
7) Limiar de reatividade ou “cut-off”
CURVA ROC (Receiver Operating Characteristic)CURVA ROC (Receiver Operating Characteristic)
Curva ROC – A probabilidade de
resultados positivos está no
i A b bilid d deixo y. As probabilidades de
teste positivo na ausência de
doença estão no x. O ponto
mais acima e à esquerdamais acima e à esquerda
corresponde ao melhor ponto
de corte para o teste.
Maior sensibilidade (s) e menos
f l iti (1 E) ifalso-positivos (1-E) = maior
acurácia.
AUC = 0,7 – 0,8 = RazoávelAUC 0,7 0,8 Razoável
= 0,8 – 0,9 = Bom
< 0,9 = Excelente
Conceitos:Conceitos:
8) Reprodutibilidade
Conceitos:Conceitos:
8) Reprodutibilidade
É definida como a obtenção de resultados iguais em testes do mesmo
formato realizados com a mesma amostra biológica por diferentesformato realizados com a mesma amostra biológica por diferentes
técnicos em diferentes locais.
Reprodutibilidade INTRATESTE e INTERTESTEReprodutibilidade INTRATESTE e INTERTESTE
Fatores que influenciam na concordância:
Q lid d d‐ Qualidade dos reagentes
‐ Condições técnicas e operacionais
‐Manutenção dos equipamentos‐Manutenção dos equipamentos
Certificação ISO de qualidade; introdução de soros referência
Conceitos:Conceitos:
9) Índice Kappa (κ)
Conceitos:Conceitos:
Mede o grau de concordância entre dois ou mais
observadores sobre o resultado de um
determinado ensaio. A análise de concordância é
baseada no indicador kappa (k).
Nenhuma<0 00
ConcordânciaKappa
Κ = (PO – PE)/(1-PE)
PO = concordância observada Sofrível0,21-0,40
Fraco0,00-0,20
Nenhuma<0,00
PE = concordância esperada
Óti0 81 0 99
Boa0,61-0,80
Regular0,41-0,60
, ,
Perfeita1,00
Ótima0,81-0,99
FimFim