Aula 11 Crescimento Microbiano Técnicas Laboratoriais

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Profª. Drª. Cristiane Mengue Feniman Moritz
AULA 11
 Crescimento Microbiano
Técnicas Laboratoriais
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Meios de cultura
Material nutriente preparado para o crescimento de micro-organismos em um laboratório
Inóculo: micro-organismos introduzidos em um meio de cultura para iniciar o crescimento
Cultura: micro-organismos que crescem e se multiplicam dentro ou sobre um meio de cultura
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Meios de cultura
O que um meio de cultura deve apresentar?
Nutrientes adequados para o micro-organismo específico que se quer cultivar
Quantidade de água adequada
pH apropriado
Nível conveniente de oxigênio ou ausência
Deve ser estéril
Incubação em temperatura adequada
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Meios de cultura - Procedência
Naturais
Não sofrem alteração na sua composição original. Ex. batata, leite e suco de laranja
Artificiais
Preparados pela mistura de diversas substâncias
Grande variedade de meios de cultura comerciais
Componentes pré-misturados e requer somente a adição de água e esterilização
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Meios de cultura - Consistência
Ágar: agente solidificante adicionado ao meio de cultura 
Polissacarídeo complexo derivado de uma alga marinha
Poucos micro-organismos podem degradar o ágar, o que permite que ele permaneça sólido
Se liquefaz ~100ºC e permanece líquido até ~40ºC
Mantido a ~50ºC para a utilização
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Meios de cultura - Consistência
Líquidos: não contém ágar
Leite e Tripticase Soy Broth (TSB)
Fluídos: inferior a 0,1% de ágar
Meio de tioglicolato
Semi-sólidos: 0,3 a 0,5% de ágar
SIM e Cary & Blair
Solidificados: 1,5 a 2,0% de ágar
Plate Count Agar (PCA)
Sólidos: naturalmente no estado sólido
Fatias de batata
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Meios de cultura - Composição
Extratos
Extratos aquosos concentrados
Extrato de carne e levedura: isentos de carboidratos fermentáveis
Extrato de malte: alto teor de maltose (indicado para bolores e leveduras)
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Meios de cultura - Composição
Peptonas
Substâncias de origem protéica, fragmentos hidrossolúveis e não coaguláveis
Peptonas: obtidas por via enzimática
Peptona de carne e peptona de caseína
Hidrolisados: mistura de diversos peptídeos e aminoácidos livres
Caseína hidrolisada
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Meios de cultura - Composição
Simples
Destinados ao cultivo de micro-organismos poucos exigentes nutricionalmente
Servem de base para outros meios de cultura
Água peptonada e caldo simples
Enriquecidos
Composição simples, mas adicionados de substâncias que melhoram o valor nutritivo
Ágar sangue e ágar chocolate
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Meios de cultura - Composição
Complexos
A composição química pode variar de acordo com o lote
Ágar simples, ágar sangue e extrato de levedura
Quimicamente definidos
Composição exata é conhecida e deve conter fatores de crescimento
Micro-organismos fastidiosos
Meio de Rogosa
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Meios de cultura - Finalidade
Conservadores
Quando não é possível fazer a semeadura da amostra imediatamente após a coleta.
Mantêm estável a população microbiana presente, preservando sua viabilidade e inibindo sua multiplicação
Salina glicerinada, meio de Stuart e meio de Cary & Blair
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Meios de cultura - Finalidade
Enriquecimento
O meio de cultura é adicionado de substâncias que favorecem o crescimento de um micro-organismo específico e não de outros
Amplifica até níveis detectáveis um número muito pequeno do micro-organismo de interesse
Caldo lactosado
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Meios de cultura - Finalidade
Contagem
São tipos específicos de meios de cultura destinado a contagem de grupos de micro-organismos
Plate Count Agar (PCA)
Identificação
Destinados à identificação bioquímica dos micro-organismos
Urease e meio de Citrato de Simmons
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Meios de cultura - Finalidade
Diferenciais
Facilitam a diferenciação das colônias de um micro-organismo desejado em relação a outras colônias crescendo na mesma placa
Ágar sangue
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Meios de cultura - Finalidade
Seletivos
Impedem o crescimento de bactérias indesejadas e favorecem o crescimento do micro-organismo de interesse
Baixa impedância: ágar MacConkey
Média impedância: ágar Salmonella-Shigella e ágar Hektoen
Alta impedância: ágar Sulfito de Bismuto e ágar Verde Brilhante
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Meios de cultura - Finalidade
Seletivos diferenciais
Combinam as duas finalidades
Ágar Eosina Azul de Metileno e ágar Hipertônico Manitol
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Medidas diretas do crescimento microbiano
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Contagem em placas
Mede o número de células viáveis
Considera que cada bactéria viva cresce e se divide para produzir uma colônia
No entanto, as bactérias podem estar agregadas ou em cadeias, sendo consideradas Unidade Formadora de Colônia (UFC)
A unidade utilizada é UFC/g ou mL
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Contagem em placas
Food and Drug Administration (FDA) recomenda a contagem de 25 a 250 colônias por placa, mas muitos microbiologistas preferem 30 a 300 colônias por placa
Para isso torna-se necessário fazer diluições seriadas na amostra 
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Contagem em placas
Devem ser seguidas as condições de incubação (tempo, temperatura e meio de cultura) que propiciam o melhor desenvolvimento das colônias
Tempo insuficiente de incubação pode acarretar em colônias com tamanhos variáveis
Colônias muito pequenas poderão ser omitidas durante a contagem
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Contagem em placas
Semeadura em profundidade
1,0mL de inóculo é pipetado em uma placa de Petri estéril
Adiciona-se o meio de cultura ainda fundido, promovendo a sua homogeneização com a amostra
As colônias crescem na superfície e dento do meio solidificado
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Contagem em placas
Desvantagens da semeadura em profundidade
Os micro-organismos a serem contados devem resistir a temperatura de 50ºC (ágar fundido)
Não se aplica para meios diferenciais, pois a aparência das colônias que crescem dentro do meio pode ser diferente das que crescem na superfície
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Contagem em placas
Semeadura em superfície ou por espalhamento
1,0mL de inóculo é pipetado em uma placa de Petri estéril contendo ágar previamente solidificado
O inóculo é espalhado com a alça de Drigalski
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Contagem em placas
Desvantagens da semeadura em superfície
Inóculos maiores que 0,1mL são raramente utilizados porque o excesso de líquido pode não ser absorvido
Dificulta a determinação de populações pequenas (abaixo de 100 UFC/g ou mL)
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Filtração
Utilizada em amostra com contaminação muito pequena
Lagos ou correntes de água relativamente puras
Pelo menos 100mL de amostra passam através de uma membrana filtrante
As bactérias ficam retidas não passam pelos poros da membrana
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Filtração
O filtro é transferido para uma placa de Petri contendo um suporte embebido em um meio líquido nutriente
As colônias se desenvolvem a partir das bactérias retidas na superfície do filtro
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Método do número mais provável
Método estatístico que se baseia no seguinte princípio:
Quanto maior o número de bactérias em uma amostra, maior será o número de diluições necessárias para reduzir a densidade até um ponto no qual mais nenhuma bactéria esteja presente nos tubos de diluição seriada
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Contagem microscópica direta
Uma alíquota de 0,01mL de amostra é espalhada em uma lâmina de vidro contendo uma grade quadriculada (grid), com área específica
As bactérias são visualizadas com objetiva de 100x e contadas em cada área do grid
É um método rápido para estimar o número de células microbianas
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Contagem microscópica direta
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Contagem microscópica direta
Desvantagens
Não é possível distinguir células mortas de células vivas
Células pequenas são de difícil visualização e podem ser omitidas
Técnica pouco precisa
A amostra deve ser corada ou utiliza-se microscópio de contraste de fase
O método não é adequado quando há baixa densidade de células
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Medidas indiretas do crescimento microbiano
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Turbidez
À medida que as bactérias se multiplicam em um meio líquido, o meio se torna turvo ou opaco
Pode ser
feita a medida em espectrofotômetro
A leitura da absorbância pode ser correlacionada com as contagens em placas da mesma cultura
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Turbidez
Em torno de 10 milhões de células por mililitro são necessários para que uma suspensão seja turva o suficiente para possibilitar uma leitura em espectrofotômetro
Não se adequa para líquidos com um número relativamente pequeno de bactérias
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Atividade metabólica
A quantidade de um produto metabólico é diretamente proporcional ao número de bactérias presentes
Medições de ácido ou dióxido de carbono
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Peso seco
Medição de fungos filamentosos (bolores)
O fungo é removido do meio de cultura, filtrado para remover outros materiais e seco em dessecador, sendo então pesado
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Técnicas especiais de cultura
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Micro-organismos intracelulares obrigatórios
Mycobacterium lepare (bacilo da lepra) cresce em tatus
Treponema pallidum (espiroqueta da sífilis) é propagado em testículo de coelhos
Riquétsias, clamídias e vírus são cultivados em culturas de células
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Atmosferas especiais
Estufas de dióxido de carbono
Micro-organismos capnofílicos (requerem altas concentrações de CO2)
Condições controladas de oxigênio e CO2 para microaerófilos (Campylobacter)
Substituição por jarra tampada com vela acessa (prática em desuso)
Embalagens comerciais com reagentes químicos fornecem concentrações definidas de CO2
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Atmosferas especiais
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Atmosferas especiais
Câmara anaeróbica
A câmara é preenchida com gases inertes (85% de N2, 10% de H2 e 5% de CO2)
Os meios de cultura também devem ser especiais
Meios redutores (contendo tioglicolato de sódio)
Os meios são aquecidos previamente para eliminar o oxigênio absorvido
Sistema OxyPlate, o meio contém oxirase (enzima que combina o oxigênio com o hidrogênio, formando água)
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Atmosferas especiais
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Sistemas de contenção
Biossegurança de nível 1
Laboratório de aula de microbiologia
Biossegurança de nível 2
Micro-organismos que apresentam risco moderado de infecção
Manuseados em bancadas abertas, com luvas apropriadas e jaleco
Se necessário, proteção para o rosto e os olhos
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Sistemas de contenção
Biossegurança de nível 3
Manuseio de patógenos do ar altamente infecciosos, como o agente da tuberculose
Gabinetes de biossegurança similares a uma câmara anaeróbica
O laboratório em si pode ter pressão negativa e ser equipado com filtros de ar para evitar a liberação do patógeno
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Sistemas de contenção
Biossegurança de nível 4
Conhecidos como “zonas quentes”
Ambiente selado dentro de um prédio grande e tem uma atmosfera com pressão negativa, de modo que aerossóis contendo patógenos não podem escapar
Entradas e saídas de ar contêm filtros Todos os materiais residuais são desinfetados
Vestimenta especial com fornecimento externo de ar
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Sistemas de contenção
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