AULA 2 MEIO CULTURA_ TÉCNICAS DE SEMEADURA

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MICROBIOLOGIA LABORATORIAL
Profa. Thaisy Pacheco
thaisy.santos@usf.edu.br
Meio de Cultura: Tipos e Preparo
Profa. Thaisy Pacheco
thaisy.santos@usf.edu.br
• Cultivar: Promover o crescimento controlado para facilitar o estudo
Fornecer condições favoráveis:
• Temperatura
• Ph
• Umidade
• Oxigênio (presença ou ausência)
• Nutrientes
Estudar um micro-organismo
• Cultivar: Promover o crescimento controlado para facilitar o estudo
Fornecer condições favoráveis:
• Temperatura
• Ph
• Umidade
• Oxigênio (presença ou ausência)
• Nutrientes
MEIO DE CULTURA
Estudar um micro-organismo
Composições de substâncias que fornecem nutrientes necessários para o 
desenvolvimento de microrganismos fora do seu ambiente natural.
São utilizados em diversas áreas: 
• Microbiologia de alimentos,
• Análises microbiológica da água, 
• Microbiologia de cosméticos 
• Microbiologia laboratorial.
Meio de Cultura
Devido à diversidade dos microrganismos, existem vários meios de cultura específicos
que atendem às exigências para o desenvolvimento de cada um.
✓ Quimicamente definidos
✓ Complexos
✓ Sólidos
✓ Semi-sólidos
✓ Líquidos
✓ Enriquecidos
✓ Seletivos
✓ Diferenciais
Meio de Cultura
Quimicamente definido
❖ Aquele no qual todos os constituintes são conhecidos, pois são preparados no
laboratório pela adição de determinada quantidade de cada um dos componentes
(carboidratos, aminoácidos, sais...)
Meio de Cultura
Complexo
❖ Aquele no qual a exata constituição não é conhecida. Os meios complexos contêm
extratos moídos ou digeridos de órgãos animais (corações, fígados, cérebros), peixes,
leveduras, e vegetais. Fornecem os nutrientes, as vitaminas e os minerais
necessários.
Sólidos
❖ Os meios sólidos são preparados adicionando-se ágar ao meio líquido e posterior
colocação em tubos de ensaio ou placas de Petri, onde o meio se solidifica. As
bactérias crescem na superfície do meio sólido.
❖ O ágar é um polissacarídeo complexo obtido de alga marinha vermelha.
Meio de Cultura
Semi-sólido
❖ Quando a consistência de ágar é intermediária.
❖ Muito utilizado para testes de motilidade -
Meio de Cultura
Se a bactéria possuir flagelos o meio ficará turvo
A B A B
+ - + -
❖ Líquidos
Os meios de cultura líquidos, ou caldos, sem agentes solidificantes, são também
conhecidos como caldos e seu acondicionamento é feito em tubos de ensaio. São
utilizados para ativação das culturas, repiques de microrganismos, provas bioquímicas,
dentre outros.
Meio de Cultura
Meios Enriquecidos
❖ Contém um grande suprimento de nutrientes que promove o crescimento dos
microrganismos fastidiosos. É geralmente preparado pela adição de nutrientes extras
a um meio denominado ágar nutriente.
Exigências nutritivas específicas
Meio de Cultura
Meios Seletivos
❖ Contém inibidores adicionados que tornam inviável o crescimento de certos
microrganismos, sem inibir o crescimento do microrganismo que está sendo
pesquisado.
Meio de Cultura
Meios Diferenciais
❖ Permite a distinção dos microrganismos que crescem no referido meio.
Meio de Cultura
➢ Ágar sangue - É um meio de uso geral – Bacilos Gram-negativos, Gram-positivos e 
Leveduras
➢ Indicado para micro-organismos fastidiosos tais como: Estreptococos, Pneumococos
e Meningococos.
➢ Enriquecido - Não seletivo - Diferencial
Meio de Cultura - Principais
➢ O ágar-chocolate - ágar nutriente adicionado de hemoglobina em pó.
➢ Permite o crescimento de (Gram (+); (-) e levedura).
➢ Recomendado para isolar e cultivar meningococos e Haemophilus spp.
➢ Meio enriquecido e
Meio de Cultura - Principais
➢ O ágar-Thayer Martin - destinados ao isolamento de Neisseria gonorrhoeae e
Neisseria meningitidis. Inibem o crescimento (antibióticos) de bactérias do gênero Neisseria
saprófitas e outras bactérias, quando em amostras colhidas de sítios contaminados.
https://www.laborclin.com.br/wp-content/uploads/2019/05/BULA_THAYER_MARTIN_AGAR_11022019-1.pdf
Meio de Cultura - Principais
➢ Meio de Lowenstein-Jensen 
➢ A base do meio é constituída por ovos integrais, o que permite amplo crescimento 
das micobactérias e o crescimento é satisfatório para o teste de niacina (que é 
positivo para Mycobacterium tuberculosis).
➢ O isolamento de micobactérias na prática é um processo demorado – Até 8 dias.
Meio de Cultura - Principais
https://www.laborclin.com.br/wp-content/uploads/2019/05/meio_de_lowenstein_jensen_bula_25012019.pdf
Cor original do meio: verde claro. Cultura negativa: ausência de
crescimento de colônias. Cultura positiva para BAAR: Crescimento de
colônias amarelas, quando for confirmado BAAR no esfregaço em lâmina.
Cultura contaminada: crescimento de outras bactérias que não
micobactérias.
➢ O ágar CLED é utilizado na urocultura para isolamento e quantificação de bactérias 
na urina. (Gram (+); (-) e levedura). Não seletivo e diferencial.
https://www.laborclin.com.br/wp-content/uploads/2019/06/BIPLACA-CLED.pdf
Meio de Cultura - Principais
➢ Ágar MacConkey - Bacilos Gram negativos;
➢ Permite visualizar se a bactéria é lactose positiva ou lactose negativa (lac+/lac-);
➢ Inibe o crescimento da bactérias Gram positivas.
➢ Meio Seletivo e diferencial;
Meio de Cultura - Principais
A cor vermelha é devida à produção de ácido pela degradação da 
lactose, absorção do vermelho neutro e uma subsequente mudança 
na coloração quando o pH do meio cai abaixo de 6,8. 
➢ O Ágar manitol salgado é utilizado para caracterizar o Staphylococcus aureus. O S.
aureus não apenas cresce neste meio, mas também converte a cor do meio em
amarelo, em razão da sua capacidade de fermentar o manitol. Ágar seletivo e
Diferencial.
Meio de Cultura - Principais
➢ Ágar SS
➢ Utilizado para o crescimento de Salmonella e Shigella
➢ Utilizado para o exame de coprocultura, exame cultural de fezes
Meio de Cultura - Principais
Meio de Cultura - Principais
➢ Ágar Cromogênico (Cromo)
➢ Princípio está relacionado à utilização de substratos cromogênicos (reação de cor) 
característicos para cada patógeno, que são liberados após a hidrólise.
➢ Bacilos Gram-negativos e Cocos Gram-positivos.
➢ Facilita a identificação – cor da bactéria (Bula do Fabricante).
Os vários tipos de meios 
(enriquecido, seletivo, diferencial) 
não são mutuamente exclusivos. 
Meio de Cultura - Principais
Meio de Cultura - Principais
➢ Ágar Mueller Hinton
➢ Utilizado para a realização de antibiogramas.
➢ Bacilos Gram-negativos e Cocos Gram-positivos.
➢ Não é ideal para micro-organismos fastidiosos – (Ágar-sangue)
➢ MEIOS DE IDENTIFICAÇÃO 
➢ São meios utilizados para auxiliar no processo de identificação das bactérias Gram-
positivas e Gram- negativas. 
➢ Ex: Citrato, Rugai, Sorbitol (Enterobactérias) e Manitol, DNAase, Bile esculina (para 
Gram-positivos)
Meio de Cultura - Principais
Vamos falar de forma mais detalhada na aula de provas bioquímicas.
➢ MEIOS DE TRANSPORTE
➢ São meios utilizados para o transporte e manutenção de amostras biológicas como 
fezes e secreções. 
➢ São meios inertes, pois, permitem a viabilidade da maioria dos patógenos sem 
alterar a sua concentração.
Meio de Cultura - Principais
➢ MEIOS DE TRANSPORTE
➢ Meio de Stuart ou Amies: Usado para coleta de secreções em geral (vaginal, ferida, 
anal, orofaringe...) e o transporte com swabs. 
Cary-Blair
Stuart
Meio de Cultura - Principais
➢ Meio Cary-Blair e salina glicerinada tamponada útil no transporte de fezes para o 
isolamento de Shigella e Salmonella. 
MEIOS DE MANUTENÇÃO 
❖ São meios utilizados para a preservação das bactérias para a realização de exames 
complementares para estudos futuros como pesquisa clínica, epidemiológica ou 
educacional. 
➢ Ex: Caldo TSB, TSB+Glicerol e caldo nutriente
Cary-Blair
Stuart
Conservação: 
• Temperaturas de 2 a 8 ºC ou de 4 à 10ºC 
(refrigerador): duração por semanas.
• Temperaturas de -70 à -196ºC: Longo período de 
tempo: Duração por anos (1 até 10 anos). 
Meio de Cultura - Principais
Necessário para preparo:• Meio de Cultura
• Espátula
• Medidor de pH
• Erlenmeyer
• Balança Semi-analítica
• Autoclave / Filtro
• Água Destilada
Meios de cultura são:
• Altamente higroscópicos
• Fotossensíveis
• Tóxicos
Meio de Cultura - Preparo
Como devo prepara o meio de cultura? Seguir as instruções do fabricante, a 
bula do meio de cultura deve vir junto com o produto, caso não venha, no site 
do fabricante deve estar disponível para consulta. 
AGAR MUELLER HINTON. FRASCO 100 G
Aplicação:
É utilizado em testes de suscetibilidade antimicrobiana de microrganismos aeróbicos de rápido crescimento
pela técnica de difusão em disco. O teste de suscetibilidade é um método que se baseia na difusão através do
ágar com substâncias antimicrobianas que saturam os discos de papel: o crescimento de microrganismos é
demonstrado por um halo de inibição ao redor do disco e o diâmetro do halo é correlacionado com a
Concentração Inibitória Mínima (MIC).
Preparação:
Suspender 36.0g de pó em 1 litro de água destilada ou deionizada. Aquecer até ferver e misture até dissolver
completamente. Esterilizar em autoclave a 121°C por 15 minutos. Distribuir em placas de Petri.
Fonte: https://kasvi.com.br/produtos/?ref=K25-620033
Meio de Cultura - Preparo
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Você precisa preparar 200 mL de meio de cultura.
Modelo de Instruções de Uso de um fabricante de meio de cultura
Exemplo:
36 g -------------------- 1000 mL
X -------------------- 200 mL
36 g 1000 mL
X 200 mL
7200 . 1000 x
X = 7200/1000
X = 7,2 g
7,2 g + 200 mL água destilada
Meio de Cultura - Preparo
• Água destilada para dissolver
• Meios com ágar devem ser hidratados
• Não pode encher o frasco de meio de cultura 
• Esterilizar na Autoclave? (ler rótulo)
• Quando não esterilizar (espátula estéril, frasco estéril, água destilada, banho maria)
• Os suplementos não são autoclavados, devem ser filtrados
• Estufa (com ou sem jarra de anaerobiose)
Meio de Cultura - Preparo
• 3 meses na geladeira, fechar bem para não perder umidade (ágar resseca, desidrata)
• Meio suplementado (no máximo 1 semana)
• Controle de eficiência de esterilização - bioindicador 
• Incubar um lote novo de meio de cultura para confirmar se realmente está estéril
Jarra de anaerobiose
Técnicas de Isolamento de microrganismos 
• As técnicas de semeadura são o método pelo qual se transfere inóculos bacterianos de um meio
de cultura ou material a ser analisado (secreções, alimentos) para um outro meio de cultura.
Deve ser realizada de forma asséptica para não contaminar o material.
Isolamento de micro-organismos em cultura
FONTE: Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica, ANVISA
Isolamento de micro-organismos em cultura
Dentre as técnicas conhecidas para o isolamento de microrganismos em cultura pura, as mais 
comumente utilizadas são:
➢ Técnica Quantitativa.
➢ Técnica do Esgotamento (qualitativa);
➢ Técnica de semeadura em Estriar;
➢ Técnica de Semeadura em Picada;
FONTE: Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica, ANVISA
TÉCNICA QUANTITATIVA 
❖ Consiste em distribuir o material coletado por toda placa, estriando continuamente
até o final da placa a fim de realizar a contagem das colônias;
❖ A alça utilizada deve ser calibrada (mais comum utilizar de 1uL), ou seja, o volume
da alça deve ser conhecido, assim será possível quantificar a cultura.
❖ Cultura que devem ser quantificadas: Urina, Secreção Traqueal.
FONTE: Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica, ANVISA
Isolamento de micro-organismos em cultura
TÉCNICA QUANTITATIVA 
Alça calibrada de 
1 uL
COMO LIBERAR O 
RESULTADO 
QUANTITATIVO?
FONTE: Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica, ANVISA
Isolamento de micro-organismos em cultura
Alça calibrada de 
1 uL
Após semear essa 
amostra deve ser 
incubada a 37º por 
18 a 24 horas
CONTAGEM 6 
UFL por 1 µL
É protocolo liberar UFC/mL, então temos que fazer o cálculo para transformar:
LEMBRANDO QUE:
1 mL = 1000 µL
X= 6000 
UFC/mL
FONTE: Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica, ANVISA
1 µL -------------------- 6 UFC
1000 µL -------------------- x
1x . 6000
X = 6000/1
X = 6000
1 µL 6 UFC
1000 µL x
Isolamento de micro-organismos em cultura
TÉCNICA QUANTITATIVA 
FONTE: Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica, ANVISA
É PARA ESSA 
PLACA, É 
POSSÍVEL 
CONTAR?
Acima de 100 UFC, 
pode liberar no 
laudo: 
> 100.000 UFC/mL
Isolamento de micro-organismos em cultura
TÉCNICA QUANTITATIVA 
FONTE: Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica, ANVISA
Mas o que é 
UFC?
❖ Em microbiologia, a Unidade Formadora de Colónias (UFC; em inglês, colony forming unit, CFU) é uma unidade de
medida usada para estimar o número de bactérias ou fungos viáveis - isto é, capazes de se multiplicar
mediante fissão binária sob condições controladas - de uma amostra. Portanto, na contagem UFC de uma cultura
de micróbios somente as células viáveis são consideradas, enquanto que, no exame microscópico só são contadas
células vivas e mortas.
Isolamento de micro-organismos em cultura
TÉCNICA QUANTITATIVA 
TÉCNICA DO ESGOTAMENTO (QUALITATIVA)
❖ A técnica de esgotamento em placa consiste em depositar o material coletado sobre
uma parte da placa e depois espalhá-lo com a alça em campos diferentes de modo a
obter colônias isoladas.
FONTE: VERMELHO,2019
Urina deve 
ser semeada, 
quali e quanti
Colônias mais 
isoladas
IMPORTANTE: 
TRABALHAR 
SEMPRE COM 
COLÔNIAS 
ISOLADAS
Isolamento de micro-organismos em cultura
TÉCNICA DO ESGOTAMENTO (QUALITATIVA)
❖ A técnica de esgotamento em placa consiste em depositar o material coletado sobre
uma parte da placa e depois espalhá-lo com a alça em campos diferentes de modo a
obter colônias isoladas.
FONTE: VERMELHO,2019
Urina deve 
ser semeada, 
quali e quanti
Colônias mais 
isoladas
IMPORTANTE: 
TRABALHAR 
SEMPRE COM 
COLÔNIAS 
ISOLADAS
Isolamento de micro-organismos em cultura
TÉCNICA DO ESGOTAMENTO (QUALITATIVA)
❖ Outra forma de esgotamento:
FONTE: VERMELHO,2019
3ª
IMPORTANTE: 
TRABALHAR 
SEMPRE COM 
COLÔNIAS 
ISOLADAS
COLÔNIAS 
ISOLADAS
Isolamento de micro-organismos em cultura
TÉCNICA DE SEMEADURA EM ESTRIAS
❖ Estocar a bactéria – provas bioquímicas.
❖ Semeia o micro-organismo com auxílio de alça (meio inclinado), fazendo estrias na
superfície (ápice).
FONTE: VERMELHO,2019
Isolamento de micro-organismos em cultura
TÉCNICA DE SEMEADURA EM PICADA
❖ Verificar motilidade em ágar semi-sólido.
❖ Semeia o micro-organismo com auxílio de uma agulha de níquel cromo, fazendo
uma picada no centro do meio de cultura penetrando até a metade da sua altura, do
meio
FONTE: VERMELHO,2019
Isolamento de micro-organismos em cultura
URINA: CLED-MacConkey
CLED: SEMEAR QUANTITATIVO
MacConkey: SEMEAR POR ESGOTAMENTO
No meio Cled é 
possível o crescimento 
de: Gram positivos, 
Gram negativos e 
leveduras.
No meio MacConkey
Gram negativos
Em qual meio devo semear as amostras?
➢ Supondo que semeou uma amostra de urina em CLED-MacConkey, após 24 horas 
incubado a 37º C, analisou o resultado
➢ NÃO FOI OBSERVADO
NENHUMA COLÔNIA TANTO
NO MEIO CLED, QUANTO EM
MacConkey.
LIBERAR O 
RESUTALDO: 
NÃO HOUVE 
CRESCIMENTO DE 
MICRORGANISMO
Em qual meio devo semear as amostras?
➢ Supondo que semeou uma amostra de urina em CLED-MacConkey, após 24 horas 
incubado a 37º C, analisou o resultado
❖ CLED: POSITIVO
❖ MACCONKEY: POSITIVO
➢ Isso significa que houve crescimento de Bacilo Gram negativo, fazer o
Gram para confirmar e dar andamento para de identificação (próximas
aulas)
Em qual meio devo semear as amostras?
➢ Suponde que semeou uma amostra de urina em CLED-MacConkey, após 24 horas 
incubado a 37º C, analisou o resultado
❖ CLED: POSITIVO
❖ MACCONKEY: Negativo?
QUAL É POSSIBILIDADE DE MICRORGANISMO?
Em qual meio devo semear as amostras?
➢ Suponde quesemeou uma amostra de urina em CLED-MacConkey, após 24 horas 
incubado a 37º C, analisou o resultado
❖ CLED: POSITIVO
❖ MACCONKEY: Negativo?
QUAL É POSSIBILIDADE DE MICRORGANISMO?
➢ COCOS GRAM POSITIVOS/ LEVEDURA: fazer o Gram para confirmar e dar
andamento para de identificação (próximas aulas)
Em qual meio devo semear as amostras?
Secreções (vaginal, traqueal, escarro, ferida.....): Ágar Sangue, Chocolate e 
MAcConkey
Ágar Sangue: SEMEAR QUANTITATIVO (isso se for necessário, caso seja de secreção 
traqueal)
MacConkey: SEMEAR POR ESGOTAMENTO
Chocolate: SEMEAR POR ESGOTAMENTO
Em qual meio devo semear as amostras?
https://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_4_2004.pdf
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
1. MURRAY, Patrick R.; ROSENTHAL, Ken S.; PFALLER, Michael A. Microbiologia médica. 8. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2017. Acervo Virtual.
2. KONEMAN, Elmer W.; ALLEN, Stephen D.; CURY, Arlete Emily; JANDA, William M. Diagnóstico microbiológico: texto e atlas colorido. 5. 
ed. Rio de Janeiro: Medsi, 2001.
3. PROCOP, Gary .W. et al.. Diagnóstico Microbiológico - Texto e Atlas, 7ª edição. Rio de janeiro; Grupo GEN. Acervo Virtual. 
4. VERMELHO, Alane Beatriz, et al. Práticas de Microbiologia. 2ª ed. Editora Guanabara Koogan, 2019. Acervo digital
5- ASSOCIAÇÃO PAULISTA DE ESTUDOS E CONTROLE DE INFECÇÃO HOSPITALAR (APECIH). Esterilização de Artigos em Unidades de Saúde. 
São Paulo, 1998.
6- COSTA, A.O.; CRUZ, M.S.S.; MASSA, N.G. Esterilização e desinfecção: Fundamentos básicos, processos e controles. São Paulo. Cortez, 
1990.
7-Rochon-Edouard S, Pons JL, Veber B, Larkin M, Vassal S, Lemeland JF. Comparative in vitro and in vivo study of nine alcohol-based
handrubs. Am J Infect Control 2004; 32: 200-4.