CONTROLE DE CRESCIMENTO MICROBIANO

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CONTROLE DE CRESCIMENTO 
MICROBIANO
Como os microrganismos
e seus componentes são muito
pequenos, eles são medidos
em unidades que não são
familiares para muitos de nós
em nossa vida diária. Quando
medimos os microrganismos,
utilizamos o sistema métrico.
Microscopia óptica
Microscopia óptica refere-se ao uso de qualquer tipo de microscópio que utiliza
luz para observar amostras. Neste capítulo examinaremos vários tipos de
microscopia óptica.
Microscopia óptica composta
Um microscópio óptico composto (MO) moderno possui uma série de lentes e
utiliza a luz visível como fonte de iluminação. Podemos examinar amostras muito
pequenas, bem como parte de seus detalhes. Uma série de lentes finamente
polidas forma uma imagem claramente focada, que é muitas vezes maior que a
amostra em si.
Podemos calcular a ampliação total
de uma amostra multiplicando a
ampliação (alcance) da lente objetiva pela
ampliação (alcance) da lente ocular. A
maior parte dos microscópios utilizados
em microbiologia possui várias lentes
objetivas, incluindo 10× (baixo alcance),
40× (alto alcance) e 100× (imersão em
óleo).
Microscopia eletrônica
Objetos menores que 0,2 μm, como vírus ou estruturas internas das células, devem ser
examinados com um microscópio eletrônico. Na microscopia eletrônica, um feixe de elétrons
é usado ao invés da luz. A melhor resolução dos microscópios eletrônicos é devida aos
comprimentos de onda mais curtos dos elétrons; os comprimentos de onda dos elétrons são
cerca de 100 mil vezes menores que os comprimentos de onda da luz visível. As imagens
produzidas por microscópios eletrônicos são sempre em preto e branco, mas podem ser
coloridas artificialmente para acentuar certos detalhes.
Ao invés de usar lentes de vidro, um microscópio eletrônico utiliza lentes
eletromagnéticas para focalizar um feixe de elétrons na amostra. Existem dois tipos de
microscópios eletrônicos: o microscópio eletrônico de transmissão e o microscópio eletrônico
de varredura.
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Fornece imagens tridimensionais impressionantes das amostras. Um canhão de
elétrons produz um feixe de elétrons finamente focalizados, denominado feixe eletrônico
primário. Esses elétrons passam através de lentes eletromagnéticas e são dirigidos à
superfície da amostra. O feixe primário de elétrons arranca elétrons da superfície da
amostra, e os elétrons secundários produzidos são transmitidos a um coletor de elétrons,
amplificados e usados para produzir uma imagem em uma tela ou chapa fotográfica. Essa
imagem é chamada de micrografia eletrônica de varredura. Esse microscópio é
especialmente útil no estudo das estruturas de superfície de células intactas e vírus. Na
prática, ele pode determinar objetos tão próximos quanto 10 nm, e os objetos geralmente
são ampliados de 1.000 a 10.000×.
Preparação de amostras para microscopia óptica
Como a maioria dos micro-organismos aparece quase incolor quando observada através
de um microscópio óptico padrão, muitas vezes devemos prepará-los para a observação. Uma
das formas pelas quais isso pode ser é através da coloração da amostra. A seguir,
discutiremos vários procedimentos de coloração diferentes.
A maioria das observações iniciais dos microrganismos é feita por meio de preparações
coradas. Coloração significa simplesmente corar os micro-organismos com um corante que
enfatiza certas estruturas. Porém, antes que os micro-organismos possam ser corados, devem
ser fixados (aderidos) à lâmina do microscópio. A fixação simultaneamente mata os micro-
organismos e os fixa na lâmina. Ela também preserva várias partes dos micróbios em seu
estado natural com apenas um mínimo de distorção.
Como a maioria dos micro-organismos aparece quase incolor quando observada através
de um microscópio óptico padrão, muitas vezes devemos prepará-los para a observação. Uma
das formas pelas quais isso pode ser é através da coloração da amostra. A seguir,
discutiremos vários procedimentos de coloração diferentes.
A maioria das observações iniciais dos microrganismos é feita por meio de preparações
coradas. Coloração significa simplesmente corar os micro-organismos com um corante que
enfatiza certas estruturas. Porém, antes que os micro-organismos possam ser corados, devem
ser fixados (aderidos) à lâmina do microscópio. A fixação simultaneamente mata os micro-
organismos e os fixa na lâmina. Ela também preserva várias partes dos micróbios em seu
estado natural com apenas um mínimo de distorção.
Coloração de Gram
A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista dinamarquês Hans Christian
Gram. Ela é um dos procedimentos de coloração mais úteis, pois classifica as bactérias em dois grandes
grupos: gram-positivas e gram-negativas.
Neste procedimento:
1. Um esfregaço fixado pelo calor é recoberto com um corante básico púrpura, geralmente o cristal
violeta. Uma vez que a coloração púrpura impregna todas as células, ela é denominada coloração
primária.
2. Após um curto período de tempo, o corante púrpura é lavado, e o esfregaço é recoberto com iodo, um
mordente. Quando o iodo é lavado, ambas as bactérias gram-positivas e gram-negativas aparecem em
cor violeta escuro ou púrpura.
3. A seguir, a lâmina é lavada com álcool ou uma solução de álcool-acetona. Essa solução é um agente
descolorante, que remove o púrpura das células de algumas espécies, mas não de outras.
4. O álcool é lavado, e a lâmina é então corada com safranina, um corante básico vermelho. O esfregaço
é lavado novamente, seco com papel e examinado microscopicamente.
O corante púrpura e o iodo se combinam no citoplasma de cada bactéria, corando-a de
violeta escuro ou púrpura. As bactérias que retêm essa cor após a tentativa de descolori-las
com álcool são classificadas como gram-positivas; as bactérias que perdem a cor violeta
escuro ou púrpura após a descoloração são classificadas como gram-negativas. Como as
bactérias gram negativas são incolores após a lavagem com álcool, elas não são mais
visíveis. É por isso que o corante básico safranina é aplicado; ele cora a bactérias gram-
negativas de rosa. Os corantes como a safranina, que possuem uma cor contrastante com a
coloração primária, são denominados contra-corantes. Como as bactérias gram-positivas
retêm a cor púrpura original, não são afetadas pelo contracorante safranina.
As bactérias gram-negativas contém uma camada de lipopolissacarídeo (lipídeos e
polissacarídeos) como parte de sua parede celular. Quando aplicados a células gram-positivas e
gram-negativas, o cristal violeta e o iodo penetram facilmente nas células. Dentro das mesmas, o
cristal violeta e o iodo se combinam para formar o CV-I. Esse complexo é maior que a molécula de
cristal violeta que penetram na célula e, devido a seu tamanho, não pode ser removido da camada
intacta de peptideoglicano das células gram-positivas pelo álcool. Consequentemente, as células
gram-positivas retêm a cor do corante cristal violeta. Nas células gram-negativas, contudo, a
lavagem com álcool rompe a camada externa de lipopolissacarídeo, e o complexo CV-I é removido
através da camada delgada de peptidoglicano. Como resultado, as células gram-negativas
permanecem incolores até serem contra coradas com a safranina, quando adquirem a cor rosa.
Fatores necessários para o crescimento
Os fatores necessários para o crescimento microbiano podem ser
divididos em duas categorias principais: físicos e químicos. Os fatores
físicos incluem temperatura, pH e pressão osmótica. Os fatores químicos
incluem fontes de carbono, nitrogênio, enxofre, fósforo, oxigênio,
elementos traços e fatores orgânicos de crescimento.
Temperatura
A maioria dos microrganismos cresce bem nas temperaturas ideais para os seres
humanos. Contudo, certas bactérias são capazes de crescer em extremos de temperatura
que certamente impediriam a sobrevivência de quase todos os organismos eucarióticos.
Os microrganismos são classificados em trêsgrupos principais com base em sua
faixa preferida de temperatura: em psicrófilos (crescem em baixas temperaturas),
mesófilos (crescem em temperaturas moderadas) e termófilos (crescem em altas
temperaturas).
A temperatura mínima de crescimento é a menor temperatura na qual a espécie
pode crescer. A temperatura ótima de crescimento é a temperatura na qual a espécie
cresce melhor. A temperatura máxima de crescimento é a maior temperatura na qual o
crescimento é possível.
A refrigeração é o método mais comum de preservação dos alimentos. Esse método
tem como base o princípio de que as velocidades de reprodução microbiana decrescem em
baixas temperaturas. Embora os micro-organismos sobrevivam mesmo em temperaturas
próximas do congelamento (podem ficar totalmente dormentes), eles gradualmente
diminuem seu número. Algumas espécies diminuem mais rapidamente que outras. Os
psicrotróficos na realidade não crescem bem em temperaturas baixas, exceto quando
comparados com outros micro-organismos; contudo, em um determinado período, eles são
capazes de deteriorar lentamente o alimento. Essa deterioração pode tomar a forma de
micélio fúngico, limo na superfície do alimento ou alterações de sabor ou cor nos alimentos.
Os psicrotróficos na realidade não crescem bem em temperaturas baixas, exceto
quando comparados com outros micro-organismos; contudo, em um determinado período,
eles são capazes de deteriorar lentamente o alimento.
Os mesófilos, com uma temperatura ótima de crescimento de 25 a 40°C, são os microrganismos
mais comuns. Os organismos que se adaptaram a viver dentro dos corpos de animais geralmente têm
uma temperatura ótima próxima daquela de seus hospedeiros. A temperatura ótima para a maioria das
bactérias patogênicas é de cerca de 37°C, e as estufas para culturas clínicas em geral são ajustadas
nessa temperatura. Os mesófilos incluem a maioria dos organismos deteriorantes e patogênicos.
pH
Maioria das bactérias cresce melhor em uma faixa estreita de pH perto da
neutralidade, entre pH 6,5 e 7,5. Poucas bactérias crescem em um pH ácido abaixo de 4.
Essa é a razão pela qual muitos alimentos como o chucrute, os picles e muitos queijos são
protegidos da deterioração pelos ácidos produzidos pela fermentação bacteriana. No
entanto, algumas bactérias, chamadas de acidófilas, são resistentes à acidez. Um tipo de
bactéria quimioautotrófica, encontrada na água de drenagem das minas de carvão e
que oxida enxofre para formar ácido sulfúrico, pode sobreviver em pH 1. Os fungos e as
leveduras crescem em uma faixa maior de pH que as bactérias, mas o pH ótimo dos
fungos e das leveduras geralmente é menor que o bacteriano, entre pH 5 e 6. A
alcalinidade também inibe o crescimento microbiano, mas raramente é utilizada para
preservar os alimentos.
Quando bactérias são cultivadas no laboratório, elas com frequência
produzem ácidos que algumas vezes interferem com o seu próprio
crescimento. Para neutralizar os ácidos e manter o pH apropriado, tampões
químicos são incluídos no meio de cultura. As peptonas e os aminoácidos
atuam como tampões em alguns meios, e muitos meios também contêm sais
de fosfato. Os sais de fosfato têm a vantagem de exibir o seu efeito de tampão
na faixa de pH de crescimento da maioria das bactérias. Eles também não são
tóxicos; de fato, eles fornecem fósforo, um nutriente essencial.
Pressão Osmótica
Os microrganismos obtêm a maioria dos seus nutrientes da água presente no seu meio
ambiente. Portanto, eles requerem água para seu crescimento, sendo que sua composição é de
80 a 90% de água. Pressões osmóticas elevadas têm como efeito remover a água necessária
para a célula. Quando uma célula microbiana está em uma solução cuja concentração de
solutos é mais elevada que dentro da célula (o ambiente é hipertônico), a água atravessa a
membrana celular para o meio com a concentração mais elevada de soluto. Essa perda
osmótica de água causa uma plasmólise, ou encolhimento do citoplasma celular.
A importância desse fenômeno é que o crescimento da célula é inibido assim que a
membrana plasmática se separa da parede celular. Portanto, a adição de sais (ou outros
solutos) em uma solução, e o aumento resultante na pressão osmótica, pode ser utilizada para
preservar alimentos.
Alguns micro-organismos, chamados de halófilos extremos, são tão adaptados a
concentrações elevadas de sais que acabam de fato requerendo sua presença para que ocorra
seu crescimento. Nesse caso, eles podem ser denominados halófilos obrigatórios. Os
organismos de águas salinas como o Mar Morto requerem frequentemente cerca de 30% de sal,
e a alça de inoculação (equipamento usado no laboratório para manipulação de bactérias)
utilizada para transferência deve ser mergulhada em uma solução saturada de sal. Mais comuns
são os halófilos facultativos, que não requerem concentrações elevadas de sal, mas são
capazes de crescer em concentrações de até 2% de sal, o que inibe o crescimento de muitos
organismos. Algumas espécies de halófilos facultativos podem tolerar mesmo 15% de sal.
ARTIGO INTERESSANTE
OLIVEIRA, Lilian C.G. et al . Halotolerant bacteria in the São Paulo Zoo composting process and their hydrolases and bioproducts.
Braz. J. Microbiol., São Paulo , v. 46, n. 2, p. 347-354, June 2015 . Available from
<http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1517-83822015000200347&lng=en&nrm=iso>. access on 06 Apr. 2021.
http://dx.doi.org/10.1590/S1517-838246220130316.
Se a pressão osmótica é anormalmente baixa (o ambiente é hipotônico) - tal como na
água destilada, por exemplo – a água tende a entrar na célula em vez de sair. Alguns micro-
organismos que têm uma parede celular relativamente frágil podem ser lisados com esse
tratamento.
Biofilmes
Na natureza, os micro-organismos raramente vivem em colônias isoladas de uma única espécie,
como vemos no laboratório. Mais tipicamente, eles vivem em comunidades chamadas de biofilmes.
Os biofilmes residem em uma matriz feita
essencialmente de polissacarídeos, mas contendo
também DNA e proteínas, com frequência chamada
de limo. Um biofilme também pode ser considerado
um hidrogel, um polímero complexo contendo uma
quantidade de água que corresponde a várias vezes
seu peso seco.
Os biofilmes geralmente são fixados em
superfícies como uma pedra em um lago, um dente
humano ou uma membrana mucosa.
Meio de Cultura
O material nutriente preparado para o crescimento de microrganismos em um laboratório é
chamado de meio de cultura. Algumas bactérias podem crescer bem em qualquer meio de cultura;
outras requerem meios especiais, e outras ainda não podem crescer em qualquer dos meios não
vivos até agora desenvolvidos. Os microrganismos introduzidos em um meio de cultura para iniciar
o crescimento são chamados de inóculo. Os microrganismos que crescem e se multiplicam dentro
ou sobre um meio de cultura são denominados cultura.
Ele deve conter também uma quantidade de água suficiente, um pH apropriado e um nível
conveniente de oxigênio ou talvez nenhum. O meio deve ser estéril – isto é, deve inicialmente não
conter micro-organismos vivos – dessa forma a cultura conterá somente os microrganismos (e sua
descendência) que foram introduzidos. Finalmente, a cultura em crescimento deve ser incubada
em temperatura apropriada.
Quando se deseja o crescimento das bactérias em meio sólido, um agente solidificante como
o ágar é adicionado ao meio. Um polissacarídeo complexo derivado de uma alga marinha, o ágar
tem sido utilizado há muito tempo para deixar alimentos como geleias e sorvetes mais espessos.
Poucos microrganismos podem degradar o ágar, o que permite que ele permaneça sólido. Além
disso, o ágar se liquefaz a cerca de 100°C (o ponto de ebulição da água) e ao nível do mar ele
permanece líquido até a temperatura diminui até cerca de 40°C.
Os meios com ágar geralmente são contidos em tubos de ensaio ou placas de Petri. Os
tubos de ensaio são chamados de inclinados quando a solidificaçãoé feita com o tubo inclinado
em um ângulo de modo que uma grande área de superfície esteja disponível para o crescimento.
Quando o ágar é solidificado em um tubo mantido na vertical, ele é chamado de profundo. As
placas de Petri, denominadas em homenagem a seu inventor, são placas rasas com uma tampa
que as recobre até o fundo para evitar contaminações; quando preenchidas, são chamadas de
culturas sólidas em placas de Petri.
Para sustentar o crescimento microbiano, um meio deve fornecer uma fonte de energia,
assim como fontes de carbono, nitrogênio, enxofre, fósforo e quaisquer outros fatores orgânicos
de crescimento que o organismo seja incapaz de sintetizar. Um meio quimicamente definido é
aquele cuja composição exata é conhecida.
Meio Complexos
Nos meios complexos, as necessidades de energia, carbono, nitrogênio e enxofre dos micro-
organismos em cultura são fornecidas essencialmente pelas proteínas. Uma proteína é uma
molécula grande e relativamente insolúvel que alguns micro-organismos podem utilizar
diretamente, mas uma digestão parcial por ácidos ou enzimas reduz a proteína em cadeias de
aminoácidos mais curtas chamadas de peptonas. Esses fragmentos pequenos e solúveis podem
ser digeridos pela maioria das bactérias.
Vitaminas e outros fatores orgânicos de crescimento são fornecidos pelos extratos de carne
e de levedura. As vitaminas solúveis e os minerais das carnes e das leveduras são dissolvidos na
água de extração, que é então evaporada para concentrar esses fatores. (Esses extratos também
fornecem nitrogênio orgânico e compostos de carbono.) Os extratos de levedura são
particularmente ricos em vitaminas B. Se um meio complexo apresenta forma líquida, ele é
chamado de caldo nutriente. Quando ágar é adicionado, ele é chamado de ágar nutriente.
Meios e Métodos para o Crescimento Anaeróbico
A cultura de bactérias anaeróbicas apresenta um problema particular. Como os anaeróbios
podem ser mortos pela exposição ao oxigênio, meios especiais, chamados de meios redutores,
devem ser utilizados. Esses meios contêm ingredientes, como o tioglicolato de sódio, que
combinam-se quimicamente com o oxigênio dissolvido e o eliminam no meio de cultura. Para
cultivar e manter culturas puras de anaeróbios obrigatórios, os microbiologistas utilizam meios
redutores armazenados em tubos de ensaio firmemente tampados. Esses meios são aquecidos
rapidamente antes de ser utilizados, para eliminar o oxigênio absorvido.
Meios de Cultivo Seletivo e Diferencial
Os meios seletivos são elaborados para impedir o crescimento de bactérias indesejadas e
favorecer o crescimento dos microrganismos de interesse.
Os meios diferenciais facilitam a diferenciação das colônias de um microrganismo desejado em
relação a outras colônias crescendo na mesma placa. De maneira similar, culturas puras de
microrganismos têm reações identificáveis com meios diferenciais em tubos ou placas.
EXEMPLO: O ágar hipertônico manitol contém 7,5% de cloreto de sódio, impedindo o crescimento de
organismos competidores e, portanto, selecionando ou favorecendo o crescimento de S. aureus. Esse
meio salino também contém um indicador de pH que muda de cor se o manitol do meio é fermentado
a ácido; as colônias fermentadoras de manitol de S. aureus são assim diferenciadas das colônias de
bactérias que não fermentam o manitol. As bactérias que crescem em concentração elevada de sal e
fermentar o manitol podem ser facilmente identificadas pela mudança de coloração
Meios de Enriquecimento
Como as bactérias em pequeno número podem ser perdidas, em particular se outras
bactérias estiverem presentes em maior número, algumas vezes é necessário utilizar uma cultura
de enriquecimento.
Suponha que queremos isolar de uma amostra de solo um microrganismo que pode crescer
com fenol e que está presente em número menor que outras espécies. Se a amostra de solo é
colocada em um meio líquido de enriquecimento no qual o fenol é a única fonte de carbono e
energia, os micro-organismos incapazes de metabolizar o fenol não irão crescer. O meio de
cultura é incubado durante alguns dias, e então uma pequena quantidade é transferida para outro
frasco do mesmo meio. Após uma série de transferências, a população sobrevivente consistirá
das bactérias capazes de metabolizar o fenol.
Obtenção de Culturas Puras
Uma colônia visível teoricamente vem de um único esporo ou célula vegetativa ou de um
grupo dos mesmos micro-organismos juntos em agregados ou cadeias. As colônias microbianas
frequentemente têm aparência diferente, o que permite distinguir um micro-organismo do outro As
bactérias devem ser espalhadas de maneira suficientemente ampla na placa para que as colônias
possam ser separadas umas das outras.
A maioria dos trabalhos de microbiologia requer culturas puras ou clones da bactéria. O
método de isolamento mais comumente utilizado para obter culturas puras é o método de
esgotamento por estrias. Uma alça de inoculação estéril é mergulhada dentro de uma cultura
mista, que contém mais de um tipo de micro-organismo, e é semeada em estrias na superfície de
um meio nutritivo. Ao longo da estria, as bactérias são depositadas quando a alça entra em
contato com o meio.
Preservação de Culturas Bacterianas
A refrigeração pode ser utilizada para o armazenamento de culturas bacterianas por curtos
períodos. Dois métodos comuns de preservação de culturas microbianas por longos períodos são o
congelamento em baixa temperatura e a liofilização. O congelamento em baixa temperatura é um
processo no qual uma cultura pura de microrganismos é colocada em um líquido de suspensão e
rapidamente congelada em uma faixa de temperatura de –50°C a –95°C. A cultura normalmente pode ser
descongelada e cultivada mesmo após vários anos. Durante a liofilização (congelamento-dessecação),
uma suspensão de micro-organismos é rapidamente congelada em uma faixa de temperatura de –54°C a
–72°C, e a água é removida por alto vácuo (sublimação). Ainda sob vácuo, o container é selado,
derretendo o vidro com uma chama de alta temperatura. O pó obtido desse processo, contendo os micro-
organismos sobreviventes, pode ser armazenado por anos. Os organismos podem ser reativados a
qualquer momento por hidratação com um meio nutriente líquido apropriado.
Crescimento de Culturas Bacterianas
Tempo de geração
Para o cálculo do tempo de geração das bactérias, consideramos somente a reprodução por divisão
binária, que é o método mais comum. A divisão de uma célula produz duas células, a divisão dessas
duas células produz quatro células, e assim por diante. Quando o número de células em cada geração é
expresso na potência de 2, o expoente reflete o número de duplicações (gerações) que ocorreram.
O tempo necessário para uma célula se dividir (e sua população duplicar) é chamado de tempo de
geração. Ele varia consideravelmente entre os organismos e com as condições ambientais, como a
temperatura. A maioria das bactérias tem um tempo de geração de 1 a 3 horas; outras requerem mais de
24 horas por geração.
Se a fissão binária não é controlada, uma grande quantidade de células será produzida. Se a
divisão ocorre a cada 20 minutos, que é o caso da E. coli em condições favoráveis, após 20 gerações,
uma única célula inicial poderá ter gerado mais de um milhão de células. Esse aumento ocorrerá em
cerca de 7 horas. Em 30 gerações, ou 10 horas, a população poderá ser de um bilhão, tendo atingindo
um número com 21 zeros em 24 horas.
Representação logarítmica das populações bacterianas
Para ilustrar a diferença entre representação gráfica logarítmica e aritmética de populações
bacterianas, analisaremos 20 gerações bacterianas. Em cinco gerações (25), haverá 32 células; em dez
gerações (210), serão 1.024 células, e assim sucessivamente.
Fases de Crescimento
Medida Direta do Crescimento Microbiano
O crescimento de populações microbianas pode ser medido de diversas maneiras. Alguns métodos
medem o número de células, outrosmedem a massa total da população, que muitas vezes é proporcional
ao número de células.
Contagem em placas
O método utilizado com mais frequência para medir populações bacterianas é a contagem em
placas. Uma grande vantagem desse método é que ele mede o número de células viáveis. Uma
desvantagem é que são necessárias 24 horas ou mais para que colônias visíveis sejam formadas.
As contagens em placas consideram que cada bactéria viva cresce e se divide para produzir uma
única colônia. Isso não é sempre verdadeiro, pois as bactérias frequentemente crescem unidas em
agregados ou cadeias.
Portanto, uma colônia muitas vezes resulta não de uma única bactéria, mas de um curto fragmento
de uma cadeia ou de um agregado bacteriano. Para refletir essa realidade, as contagens em placas
muitas vezes são denominadas unidades formadoras de colônias (UFC).
Diluição seriada
Para assegurar que algumas contagens de colônias estejam nessa faixa, o inóculo inicial é diluído
várias vezes, em um processo chamado de diluição seriada.
Incorporação em placas a espalhamento em placas
A contagem em placas é feita pelo método de incorporação em placas ou pelo método de
espalhamento em placas. Essa técnica tem algumas desvantagens, pois alguns microrganismos
relativamente sensíveis ao calor podem ser danificados pelo ágar fundido, sendo incapazes de formar
colônias. Além disso, quando certos meios diferenciais são utilizados, a aparência diferenciada da colônia
na superfície é essencial para diagnóstico.
Filtração
Quando a quantidade de bactérias é muito pequena, como em lagos ou correntes de água
relativamente puras, as bactérias podem ser contadas pelo método de filtração.
Nessa técnica, pelo menos 100 mL de água passam através de uma membrana filtrante fina com
poros estreitos o suficiente para não deixar que as bactérias passem, ficando assim retidas na superfície
do filtro. Esse filtro é transferido para uma placa de Petri contendo um suporte embebido em um meio
líquido nutriente, que permite que as colônias se desenvolvam a partir das bactérias retidas na superfície
do filtro. Esse método é aplicado frequentemente para a detecção e o registro de bactérias coliformes,
que são indicadoras de contaminação fecal em alimento ou água
Contagem microscópica direta
No método conhecido como contagem
microscópica direta, um volume conhecido
de uma suspensão bacteriana é colocado
em uma área definida da lâmina
microscópica.
Uma lâmina especialmente
desenvolvida chamada de contador de
células Petroff-Hausser também é utilizado
para contagens microscópicas diretas.
Determinação do Número de Bactérias por Métodos Indiretos
Não é sempre necessário contar as células microbianas para estimar seu número. Na pesquisa e
na indústria, o número e a atividade dos micro-organismos também são determinados por alguns dos
métodos seguintes.
Turbidimetria
Para alguns tipos de experimentos, estimar a turbidimetria é uma maneira de monitorar o
crescimento bacteriano. À medida que as bactérias se multiplicam em um meio líquido, o meio se torna
turvo ou opaco com as células. O instrumento utilizado para medir a turdidez é um espectrofotômetro (ou
colorímetro). No espectrofotômetro, um feixe de luz passa através de uma suspensão de bactérias até um
detector fotossensível
Controle do Crescimento Microbiano
Esterilização é a remoção ou destruição de todas as formas de vida microbiana. O aquecimento é
o método mais comum usado para matar microrganismos, incluindo as formas mais resistentes, como os
endósporos. Agentes utilizados em processos de esterilização são denominados esterilizantes. Líquidos
ou gases podem ser esterilizados por filtração.
A esterilização completa muitas vezes não é necessária em outras situações. Por exemplo, as
defesas normais do corpo podem lidar com alguns micro-organismos que penetram em uma ferida
cirúrgica. Um copo ou um garfo em um restaurante necessita apenas de um controle microbiano
suficiente para prevenir a transmissão de micro-organismos possivelmente patogênicos de uma pessoa
para outra.
As pessoas pensam que os alimentos enlatados à venda em supermercados são completamente
estéreis. Na realidade, o tratamento com calor requerido para assegurar a esterilidade absoluta iria
degradar o alimento desnecessariamente. Em vez disso, os alimentos são submetidos somente ao calor
suficiente para destruir os endósporos de Clostridium botulinum, que pode produzir uma toxina mortal.
Esse tratamento limitado de calor é denominado esterilização comercial. Os endósporos de uma série de
bactérias termofílicas, capazes de causar deterioração dos alimentos, mas não doença em humanos, são
consideravelmente mais resistentes ao calor que C. botulinum. Se estiverem presentes, irão sobreviver,
mas sua sobrevivência normalmente não tem consequência prática; eles não crescerão nas temperaturas
normais de armazenamento do alimento. Se os enlatados de um supermercado fossem incubados em
tem peraturas na faixa de crescimento dessas termófilas (acima de 45°C), uma grande quantidade de
alimentos iria se deteriorar.
O controle voltado para a destruição de microrganismos nocivos é denominado desinfecção. Este
termo normalmente refere-se à destruição de patógenos na forma vegetativa (não formadores de
endósporos), o que não é o mesmo que esterilidade completa. Processos de desinfecção podem ser
realizados com o uso de substâncias químicas, radiação ultravioleta, água fervente ou vapor. Na prática,
o termo é mais comumente aplicado ao uso de um produto químico (um desinfetante) para tratar uma
superfície ou substância inerte. Quando esse tratamento é dirigido a tecidos vivos, é denominado
antissepsia, e o produto químico é então denominado antisséptico. Assim, na prática, uma mesma
substância química pode ser denominada um desinfetante para um determinado uso e um antisséptico
para outro. É claro que muitos produtos apropriados para lavar uma mesa, por exemplo, seriam muito
agressivos para serem usados sobre tecidos vivos.
Existem variações da desinfecção e da antissepsia. Por exemplo, quando alguém precisa receber
uma injeção, a pele é limpa com álcool – o processo de degerminação, que resulta principalmente na
remoção mecânica, em vez da morte, da maioria dos microrganismos em uma área limitada. Os copos,
as louças e os talheres dos restaurantes estão sujeitos à sanitização, que tem a finalidade de reduzir as
contagens microbianas a níveis seguros de saúde pública e minimizar as chances de transmissão de
doença de um usuário para outro. Isso normalmente é obtido por lavagem em altas temperaturas ou, no
caso das louças em um bar, lavagem em uma pia seguida por imersão em um desinfetante químico.
Existem variações da desinfecção e da antissepsia. Por exemplo, quando alguém
precisa receber uma injeção, a pele é limpa com álcool – o processo de degerminação, que
resulta principalmente na remoção mecânica, em vez da morte, da maioria dos
microrganismos em uma área limitada. Os copos, as louças e os talheres dos restaurantes
estão sujeitos à sanitização, que tem a finalidade de reduzir as contagens microbianas a
níveis seguros de saúde pública e minimizar as chances de transmissão de doença de um
usuário para outro. Isso normalmente é obtido por lavagem em altas temperaturas ou, no
caso das louças em um bar, lavagem em uma pia seguida por imersão em um desinfetante
químico.
Esterilização por calor úmido
O calor úmido mata os micro-organismos principalmente pela coagulação proteica (desnaturação),
que é causada pela ruptura de ligações de hidrogênio que mantêm as proteínas em sua estrutura
tridimensional. Esse processo de coagulação é familiar a qualquer pessoa que já observou uma clara de
ovo fritando.
Um tipo de esterilização por calor úmido é a fervura, que mata as formas vegetativas dos patógenos
bacterianos, quase todos os vírus, e os fungos e seus esporos dentro de cerca de 10 minutos,
normalmente muito mais rápido.
Aesterilização confiável com calor úmido requer temperaturas mais elevadas que a da água
fervente. Essas temperaturas elevadas são mais comumente obtidas por vapor sob pressão, em uma
autoclave.
A autoclave é o método preferido de sanitização, a não ser que o material a ser esterilizado possa
ser danificado por calor ou umidade.
Quanto maior a pressão na autoclave, maior a temperatura. Por exemplo, quando o vapor de fluxo
livre a uma temperatura de 100°C é colocado sob uma pressão de 1 atmosfera acima da pressão ao nível
do mar – isto é, cerca de 15 libras de pressão por polegada quadrada (psi) – a temperatura sobe para
121°C. Aumentando a pressão para 20 psi, a temperatura sobe para 126°C.
A autoclave é um método usado para esterilizar meios de cultura, instrumentos, vestimentas,
equipamento intravenoso, aplicadores, soluções, seringas, equipamento de transfusão e diversos outros
itens que podem suportar altas temperaturas e pressões.
Pasteurização
O objetivo ao pasteurizar o leite é eliminar microrganismos patogênicos. O processo também reduz
o número de micro-organismos, prolongando a qualidade do leite quando mantido sob refrigeração.
Atualmente, a maioria dos processos de pasteurização do leite utiliza temperaturas mínimas de
72ºC, mas por apenas 15 segundos. Esse tratamento, conhecido como pasteurização de alta
temperatura e curto tempo (HTST, de high-temperature, short--time), é aplicado enquanto o leite flui
continuamente por uma serpentina. Além de matar os patógenos, a pasteurização HTST diminui as
contagens bacterianas totais; assim, o leite se conserva bem sob refrigeração.
O leite também pode ser esterilizado – algo muito diferente da pasteurização – por tratamentos de
temperatura ultraelevada (UHT, de ultra-high temperature), podendo ser armazenado sem refrigeração
por vários meses
Esterilização por calor seco
O calor seco mata por efeitos de oxidação. Um dos mais simples métodos de esterilização com
calor seco é a chama direta. Um princípio similar é usado na incineração, um modo efetivo de esterilizar e
eliminar papel, copos, sacos e vestimentas contaminadas.
Outra forma de esterilização por calor seco é a esterilização em ar quente. Os itens esterilizados
por esse procedimento são colocados em um forno. Geralmente, uma temperatura de cerca de 170°C
mantida por aproximadamente duas horas assegura a esterilização. Um tempo maior e uma temperatura
mais alta (relativos ao calor úmido) são necessários, pois o calor na água é conduzido mais rapidamente
para um corpo frio do que o calor no ar.
Filtração
A filtração é a passagem de um líquido ou gás por meio de
um material semelhante a uma tela, com poros pequenos o
suficiente para reter os microrganismos. Um vácuo é criado no
frasco coletor, e a pressão do ar força a passagem do líquido
pelo filtro. A filtração é usada para esterilizar os materiais
sensíveis ao calor, como alguns meios de cultura, enzimas,
vacinas e soluções antibióticas.
Os filtros de partículas de ar de alta eficiência (HEPA,
de high-efficiency particulate air) removem quase todos os micro-
organismos maiores que cerca de 0,3 μm de diâmetro.
Métodos Químicos de Controle Microbiano
Os agentes químicos são usados para controlar o crescimento de microrganismos em tecidos vivos
e objetos inanimados. Infelizmente, poucos agentes químicos proporcionam a esterilidade; a maioria
deles meramente reduz as populações microbianas em níveis seguros ou removem as formas
vegetativas de patógenos em objetos. Um problema comum na desinfecção é a seleção de um agente.
Nenhum desinfetante isolado é apropriado para todas as circunstâncias.
Testes de uso-diluição
O padrão atual é o teste de uso-diluição do American Official Analytical Chemist. Cilindros metálicos
ou de vidro (8 mm × 10 mm) são mergulhados em culturas padronizadas das bactérias-teste cultivadas
em meio líquido, removidas e secas a 37°C por um breve período. As culturas se cas são então
colocadas em uma solução do desinfetante na concentração recomendada pelo fabricante e deixadas por
10 minutos a 20°C. Após essa exposição, os cilindros são transferidos a um meio que permitirá o
crescimento de quaisquer bactérias sobreviventes. A efetividade do desinfetante pode então ser
determinada pelo número de culturas que se desenvolverem.
O método de disco-difusão
O método de disco-difusão é usado em laboratórios de ensino, para avaliar a eficácia de um agente
químico. Um disco de papel filtro é embebido em um produto químico e colocado em uma placa de ágar que
foi previamente inoculada e incubada com o organismo-teste. Após incubação, se o produto químico é eficaz,
uma zona clara representando a inibição do crescimento pode ser visualizada em torno do disco.
Tipos de desinfetantes
Fenol e compostos fenólicos
Os compostos fenólicos exercem sua ação lesando as membranas plasmáticas.
Bifenóis
Bifenóis, como o triclosano (venda liberada) e o hexaclorofeno (prescrito), são amplamente usados em
produtos domésticos.
Biguanidas
As biguanidas lesam as membranas plasmáticas das células na forma vegetativa.
Halogênios
Alguns halogênios (iodo e cloro) são usados isoladamente ou como componentes de soluções
inorgânicas ou orgânicas.
Halogênios
★ Alguns halogênios (iodo e cloro) são usados isoladamente ou como componentes de soluções
inorgânicas ou orgânicas.
★ O iodo pode ser combinado com certos aminoácidos para inativar enzimas e outras proteínas
celulares.
★ O iodo está disponível como tintura (em solução com álcool) ou como iodóforo (combinado a uma
molécula orgânica).
★ A ação germicida do cloro baseia-se na formação de ácido hipocloroso quando o cloro é adicionado
à água.
Alcoóis
★ Os alcoóis exercem sua ação desnaturando as proteínas e dissol vendo os lipídeos.
★ Em tinturas, eles aumentam a efetividade de outros produtos químicos antimicrobianos.
★ O etanol aquoso (60 a 95%) e o isopropanol são usados como desinfetantes.
Metais pesados e seus compostos
★ Prata, mercúrio, cobre e zinco são usados como germicidas.
★ Eles exercem sua ação antimicrobiana pela ação oligodinâmica. Quando os íons de metal pesado
se combinam com os grupos sulfidrila (–SH), as proteínas são desnaturadas.
Agentes de superfície
★ Os agentes de superfície reduzem a tensão entre as moléculas de um líquido; os sabões e os
detergentes são exemplos.
★ Os sabões possuem ação germicida limitada, mas auxiliam na remoção dos micro-organismos pela
escovação.
★ Os detergentes ácido-aniônicos são usados para limpeza do equipamento de laticínios.
★ Os quats são detergentes catiônicos unidos ao NH4+.
★ Ao romperem as membranas plasmáticas, eles permitem o vazamento dos constituintes
citoplasmáticos para fora da célula.
Antibióticos
★ A nisina e a natamicina são antibióticos usados para conservar alimentos, especialmente o queijo.
Aldeídos
★ Os aldeídos como o formaldeído e o glutaraldeído exercem seu efeito antimicrobiano pela
inativação das proteínas.
★ Eles estão entre os mais efetivos desinfetantes químicos.
Esterilização química
★ O óxido de etileno é o gás mais frequentemente usado para a esterilização.
★ Ele penetra na maioria dos materiais e mata todos os micro-organismos por desnaturação das
proteínas.
As aulas são baseadas a partir da extração do material atualizado dos principais livros de microbiologia e
conteúdos online, passando por uma triagem crítica e responsável de modo a trazer as informações mais atualizadas e
condizentes com a conteúdo.
 Manual de métodos de análise Microbiológica de Alimentos e água / Neusely da Silva (et al.) / 4. Ed. / São Paulo /
Livraria Varela / 2010.
 Microbiologia dos alimentos / Irineide Teixeira Carvalho / Recife / EDUFRPE / 2010.
 Biotecnologia: Ensino e Divulgação / Maria Antonia Malajovich / 2ª Edição / Rio de Janeiro / 2016.
 Microbiologia / Gerard J. Tortora (et al.) / 12. ed. / Porto Alegre / Artmed / 2017.
 Microbiologia industrial : bioprocessos : volume 1 / Bernardo Dias Ribeiro(et al.). - 1. ed. - Rio de Janeiro : Elsevier,
2018.
 Khan Academy / acessado em 01.03.2021 / www.khanacademy.org.
 Microrganismos: Relações ecológicas / Microbiologia Geral / Departamento de Fitopatologia e Nematologia / Escola
Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” / acessado em 01.03.2021.
http://www.khanacademy.org/
MUITO OBRIGADO
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