purificação de proteínas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI
ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA
PURIFICAÇÃO DE BIOPRODUTOS
DOCENTE: Dr. ALEX FERNANDO
ACADEMICOS: BIANCA MORAES DA SILVA
ISABELA M. A. S. BASTOS
JULHO, 2018. 
PURIFICAÇÃO DAS PROTEINAS GENÉRICAS 
SUMÁRIO 
Introdução 
Objetivos 
Materiais e Métodos
Resultados e Discussão
Conclusão
Referências 
Introdução 
Downstream
Características da molécula
Grau de purificação
Uso de diversas operações unitárias
Etapas de purificação:
Separação
Purificação de baixa resolução
Purificação de alta resolução 
Operações para acondicionamento
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Clarificação: separação as células do meio de cultivo 
CENTRIFUGAÇÃO
FILTRAÇÃO CONVENCIONAL
Intracelulares
MECANICOS
ENZIMATICOS
QUIMICOS
Introdução 
ESTRATÉGIAS 
PROPRIDADES FISICO-QUIMICAS
Diferenças essas como: 
Localização (intra ou extracelular);
Massa molecular;
Carga elétrica;
Hidrofobicidade; 
Solubilidade;
Afinidade por ligantes específicos 
Introdução 
PURIFICAÇÃO DE BAIXA RESOLUÇÃO
Os métodos de baixa resolução são aplicados com o objetivo de separar à proteína de interesse de contaminantes que possuam propriedades químicas e físicas consideravelmente distintas. 
Os principais métodos utilizados para esta etapa da purificação são:
Precipitação
Separação por Membranas 
 Separação Líquido – Líquido. 
Introdução 
Precipitação 
A precipitação é um método no qual consiste basicamente na formação de particulados proteicos insolúveis em decorrência de perturbações à solução de caráter física ou química. 
As proteínas, que acabam precipitando,
são posteriormente recuperadas por separação sólido-líquido
Utilização de:
Sais 
Solventes 
Introdução 
PURIFICAÇÃO DE ALTA RESOLUÇÃO
Os métodos de alta resolução utilizam de diferenças físico químicas entre as moléculas (proteína de interesse dos contaminantes) para realizar a separação e concentrar a proteína o máximo possível.
são utilizados métodos de cromatografia líquida preparativa, onde não há a destruição da amostra. 
A cromatografia de troca iônica, tem como princípio básico a competição entre aqueles íons de interesse e os íons contaminantes pelos grupos carregados da matriz da fase estacionária. 
Para realizar a purificação das proteínas e conseguir um índice de recuperação, são utilizados métodos de cromatografia líquida preparativa, onde não há a destruição da amostra
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PURIFICAÇÃO DE ALTA RESOLUÇÃO
O método baseia-se na interação hidrofóbica ou na associação entre proteínas e ligantes hidrofóbicos
Tem o princípio em que as moléculas sofrem partição, em virtude das diferenças no tamanho das espécies, entre um solvente e uma fase estacionária de porosidade definida.
Cromatografia de interação hidrofóbica
Cromatografia de exclusão molecular
Princípio básico a utilização da especificidade da biomolécula alvo, com algum substrato, inibidor ou anticorpo, que é utilizado, imobilizado na fase estacionária para interagir com a molécula de interesse
Cromatografia de afinidade
OBJETIVOS 
Purificação de três proteínas genéricas
No programa Protein purification disponibilizado no site online www.agbooth.com
Fazendo uso de técnicas de precipitação e cromatografia
Levando em consideração as características especificas de cada molécula
Obter o maior rendimento e fator de purificação a partir das técnicas de purificação empregadas
Materiais e métodos 
Fonte: www.agbooth.com (Free online version) 
Proteínas 2, 11 e 15
Foram purificadas três proteínas genéricas obtidas no programa Protein purification que está disponível na plataforma online www.agbooth.com na versão gratuita (Free online version). Para escolher a proteína de interesse, clicou-se no ícone Start e depois em Default mixture a ser purificada por diferentes métodos e as proteínas purificadas foram 2, 11e 15.
Materiais e métodos 
A proteína 2 possui uma atividade enzimática estável por várias horas em temperaturas até 60ºC e em valores de pH entre 5 e 10.5. 
Materiais e métodos 
Materiais e métodos 
Resultados e Discussão
Proteína 2 
Resultados e Discussão
Proteína 2 
 Figura 1. SDS-PAGE da proteína 2 (1D e 2D) e imunoenzimático após a cromatografia de exclusão molecular
Resultados e Discussão
Proteína 2 
Figura 2. Perfil cromatográfico da proteína 2 submetida a cromatografia de exclusão molecular.
Resultados e Discussão
Proteína 11 
Resultados e Discussão
Proteína 11 
Figura 3. SDS-PAGE da proteína 11 (1D e 2D) e imunoenzimático após a cromatografia de exclusão molecular
Resultados e Discussão
Proteína 11 
Figura 4. Perfil cromatográfico da proteína 11 submetida a cromatografia de troca iônica aniônica 
Figura 5. Perfil cromatográfico da proteína 11 submetida a cromatografia de exclusão molecular 
Resultados e Discussão
Proteína 15 
Resultados e Discussão
Proteína 15 
Figura 6. SDS-PAGE da proteína 15 (2D) após a cromatografia de troca iônica 
Resultados e Discussão
Proteína 15 
Figura 7. Perfil cromatográfico da proteína 15
Conclusão
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 A purificação das proteínas 11 e 15 foram eficientes, já que foi possível alcançar quase 100% de rendimento, 99.8% e 99.2%, respectivamente;
 Além disso, podemos verificar que, em cada etapa de purificação houve o enriquecimento da amostra, com fatores de purificação variando de 1.8 a 42.3 para estas proteínas. 
 Já a proteína 2, foi parcialmente purificada, por falta de outras técnicas neste programa Protein Purification capazes de separar contaminantes com características físico-químicas semelhantes. 
 
Conclusão
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É de grande importância destacar que alguns processos de purificação de biomoléculas são onerosos e exigem um longo prazo de purificação, porém a eficiência destes métodos justifica sua grande aplicação;
Há também a necessidade de otimizar o processo de purificação dessas proteínas genéricas, reduzindo o tempo e custos, que podem ser obtidos por meio de métodos alternativos ou novas tecnologias.
 Isto pode ser visto nas amostras aplicadas a cromatografia de exclusão molecular para a proteína 11, onde foram gastos apenas 8 horas de operação e para a precipitação com sulfato de amônio aplicada à proteína 15, onde foram gastos apenas 2 horas. 
Referências
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BALDASSO, C. Concentração purificação e fracionamento das proteínas do soro lácteo através da tecnologia de separação por membranas. Porto alegre, 2008.
 
CARVALHP, R. J. Produção e purificação de um fragmento recombinante da proteína A de superfície do caldo 3 (PspA3) de Streptococcus pneumoniae em Escherichia coli. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009.
 
KOBLITZ, M.G. Purificação parcial, por dois diferentes métodos cromatográficos, da lipase produzida por. Rhizopus sp. Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 24(2): 287-292, abr.-jun. 2004.
LIMA, M.R. et al. Purificação de ricina a partir de saturação com sulfato de amônio. Universidade Estadual do Ceará, 2004.
 
PADILHA, G.S. Caracterização, purificação e encapsulamento de lipase de burkholderia cepacia. Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas. Campinas – São Paulo, maio de 2010.
	
SILVA, L.H.M. Sistemas aquosos bifásicos: fundamentos e aplicações para partição/purificação de proteínas. Quim. Nova, Vol. 29, No. 6, 1345-1351, 2006. Departamento de Química, Centro de Ciências Exatas e Tecnológicas, Universidade Federal de Viçosa, 36571-000 Viçosa - MG, Brasil.
 
ZUÑIGA, P. et al, 2003 Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology 158 editado por S.G. Amara, E. Bamberg, B. Fleischmann, T. Gudermann, S.C. Hebert, R. Jahn.
 ANDREW BOOTH, 2014.Disponibilizado no site: www.agbooth.com acesso em: 29 de junho de 2018
OBRIGADA!
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