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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS – UFT CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI CURSO: ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS GENÉRICAS Discentes: Isabela M. A. S. Bastos Bianca Moraes Docente: Prof. Dr. Alex Fernando GURUPI-TO 2018 1. INTRODUÇÃO O aumento de trabalhos na área de purificação de biomoléculas vem aumentando gradualmente no decorrer dos anos, seja com estudos com o objetivo de aprimorar as técnicas de purificação e diminuir os custos como também na facilidade e velocidade de purificação das moléculas. Para dar início em um processo de purificação é necessário o uso de uma série de etapas e procedimentos que visem a separação da molécula de interesse, de forma que, dependerá do grau de purificação em que se deseja que o produto chegue, quanto também do conhecimento das características específicas da proteína que se está trabalhando, esses processos faze, uso de diversas operações unitárias características, se necessário para melhor purificação. A obtenção do extrato é uma etapa complexa na qual deve se ter conhecimento das características da molécula como se é uma molécula intracelular ou se ela é liberada durante o processo de produção e quanto as particularidades do meio de cultura. Assim sendo, para um grupo de biomoléculas, deve-se se utilizar etapas de purificação específicas de com acordo com o alvo requerido (ZUÑIGA et al, 2003; MENEGATTI et al, 2012). Embora não haja uma forma padrão de se seguir um processo de purificação de bioprodutos, pode-se estabelecer etapas que abranjam da melhor forma o processo as quais são: separação de células e seus fragmentos do meio de cultivo, purificação de baixa resolução, depois purificação de alta resolução e por fim, operações para acondicionamento final do produto (BALDASSO, 2008) A aplicação das etapas cromatográficas de forma ordenada, na busca da otimização, contribui para a redução de etapas e perdas no processo. Deste modo, a viabilidade de um processo fermentativo está intimamente relacionada à diminuição dos custos de purificação e redução das perdas da biomolécula-alvo durante a sua recuperação (PADILHA, 2010) As estratégias para desenvolvimento de processos de purificação baseiam-se nas diferenças entre as propriedades físico-químicas do produto de interesse e as das impurezas, diferenças essas como: localização (intra ou extracelular), massa molecular, carga elétrica, hidrofobicidade, solubilidade, afinidade por ligantes específicos (CARVALHO, 2009). 1.1 SEPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO PROTEICA 1.1.1 Clarificação Uma das primeiras etapas de um processo de purificação também conhecido como “downstream processing”, consiste no processo de clarificação do meio fermentado, na qual são separadas as células do meio de cultivo, que pode se dar por: centrifugação, filtração convencional ou tangencial. Após essa etapa, para os produtos intracelulares, se faz necessário o emprego de técnicas de rompimento celular com o objetivo de liberar a proteína-alvo para o sobrenadante. As células são comumente rompidas por métodos como: homegenização, ultra-som, métodos enzimáticos ou métodos químicos (SILVA, 2006). 1.1.2 Purificação de Baixa Resolução Os métodos de baixa resolução são aplicados com o objetivo de separar à proteína de interesse de contaminantes que possuam propriedades químicas e físicas consideravelmente distintas. Esses métodos possuem um menor custo quando comparado aos de alta resolução. O grande objetivo dessa etapa é a redução significativa do volume da amostra e das impurezas presentes, o que facilita a posterior utilização de procedimentos mais sensíveis, por melhorar os resultados e reduzir os custos de operação destes. Os principais métodos utilizados para esta etapa da purificação são: Precipitação, Separação por Membranas e a Separação Líquido – Líquido. 1.1.3 Precipitação A precipitação é um método no qual consiste basicamente na formação de particulados protéicos insolúveis em decorrência de perturbações à solução de caráter física ou química. As proteínas, que acabam precipitando, são posteriormente recuperadas por separação sólido-líquido. É importante ressaltar que o uso dos métodos de precipitação embora seja extremamente eficiente ele ocasiona alterações conformacionais nas proteínas envolvidas, influenciando assim diretamente a função desempenhada pelas mesmas. Por isso, o emprego só é ideal quando as modificações protéicas são reversíveis (PADILHA, 2010). 1.1.4 Precipitação por sais A utilização de sais para induzir a precipitação das proteínas baseia se no princípio de aumento da hidrofobicidade de seus grupos, através da neutralização das cargas presentes na sua superfície e pela redução da camada de solvatação dos íons A medida que pequenas quantidades de sal são adicionadas à solução contendo proteínas, ocorre uma interação destas com as cargas provenientes da dissociação do sal e diminuição da interação inter-proteínas, aumentando a solubilidade no meio aquoso. Porém, em condições de elevada força iônica, decorrente da adição de grandes quantidades de sal, verifica-se um efeito oposto. As moléculas de água, interagem mais fortemente com os íons provenientes da dissociação do sal, promovendo desta forma, a desidratação das proteínas. Durante esse processo, a interação inter-proteínas se torna mais forte, diminuindo a solubilidade das mesmas em meio aquoso e, consequentemente, a ocorrência de precipitação das proteínas. Esse processo é também conhecido por "salting-out" (LIMA et al., 2004) E na precipitação por salting-in, devido à desestabilização proteica ocasionada pela insuficiência das forças de repulsão, a diminuição da concentração de sais promove interações iônicas e a associação proteica, dada a superfície bastante hidrofóbica das mesmas, que possuem baixa interação com o solvente. 1.1.5 Precipitação pela Temperatura Buscando uma manutenção funcional das proteínas as etapas de purificação são realizadas em temperaturas baixas, em torno de 0 a 4°C. Porem temperaturas próximas a 40°C a estabilidade das mesmas diminuem consideravelmente. A elevação da temperatura de uma solução proteica fomenta a desnaturação das cadeias polipeptídicas presentes por meio da perda conformacional nativa destas e pela consequente exposição de seus grupos hidrofóbicos que acabam se relacionando com outras espécies formando agregados insolúveis. De forma que, a depender da proteína ela terá variações diferentes quanto as variações de temperatura, e assim possibilitando a exploração para o tratamento. 1.1.6 Purificação de Alta Resolução Os métodos de alta resolução utilizam de diferenças físico químicas entre as moléculas (proteína de interesse dos contaminantes) para realizar a separação e concentrar a proteína o máximo possível. Diferentes estratégias de purificação podem ser montadas a partir da caracterização físico-química das proteínas em estudo dentre os métodos de alta resolução estão as cromatografias, que podem ser gasosas ou líquidas. Para realizar a purificação das proteínas e conseguir um índice de recuperação, são utilizadosmétodos de cromatografia líquida preparativa, onde não há a destruição da amostra. A cromatografia de troca iônica, tem como princípio básico a competição entre aqueles íons de interesse e os íons contaminantes pelos grupos carregados da matriz da fase estacionária. A molécula de proteína tem em sua superfície grupamentos com cargas positivas e negativas, onde a carga líquida depende da proporção entre suas cargas (KOBLITZ et al., 2004). A cromatografia de interação hidrofóbica é uma técnica com ampla aplicação, não sendo limitada apenas à separação de biomoléculas. O método baseia-se na interação hidrofóbica ou na associação entre proteínas e ligantes hidrofóbicos imobilizados em suporte sólido. A fase estacionaria e formada por grupamentos apolares e as soluções proteicas quando em altas concentrações salinas expõem seus grupamentos hidrofóbicos, sendo assim adsorvidas pela resina (KOBLITZ et al., 2004). A cromatografia de exclusão molecular também conhecida como filtração em gel é uma das cromatografias mais tradicionais onde tem o princípio em que as moléculas sofrem partição, em virtude das diferenças no tamanho das espécies, entre um solvente e uma fase estacionária de porosidade definida (CARVALHO, 2009). A cromatografia de afinidade, é extremamente utilizada apesar de possuir custos elevados, a mesma tem como princípio básico a utilização da especificidade da biomolécula alvo, com algum substrato, inibidor ou anticorpo, que é utilizado, imobilizado na fase estacionária para interagir com a molécula de interesse. Um exemplo clássico desse tipo de cromatografia e a afinidade por metais realizada em resina quelante, utilizada para separar proteínas com cauda de histidina que apresentam alta afinidade por metais (CARVALHO, 2009). 2. OBJETIVO Purificação de três proteínas genéricas, obtidas no programa Protein purification disponibilizado no site online www.agbooth.com, fazendo uso de técnicas de precipitação e cromatografia, levando em consideração as características especificas de cada molécula, para decidir qual melhor método a ser aplicado, e obter o maior rendimento e fator de purificação a partir das técnicas de purificação empregadas. 3. MATERIAIS E MÉTODOS Foram purificadas três proteínas genéricas obtidas no programa Protein purification que está disponível na plataforma online www.agbooth.com na versão gratuita (Free online version). Para escolher a proteína de interesse, clicou-se no ícone Start e depois em Default mixture a ser purificada por diferentes métodos e as proteínas purificadas foram 2, 11e 15. 3.1 Purificação da Proteína 2 A proteína 2 possui uma atividade enzimática estável por várias horas em temperaturas até 60ºC e em valores de pH entre 5 e 10.5. Para que ela fosse purificada, foi utilizado o tratamento térmico (método de baixa resolução) à 60°C, durante 120 minutos e uma filtração em gel (método de alta resolução- cromatografia de exclusão molecular) utilizando uma matriz Sephacryl S-200 HR. 3.1 Purificação da Proteína 11 A proteína 11 possui atividade enzimática estável por várias horas em temperaturas à 50ºC e em valores de pH entre 3 e 11. Para purificação dessa proteína utilizou-se um tratamento térmico à 50°C, durante 120 minutos, uma cromatografia de troca iônica, utilizando uma matriz de troca aniônica (DEAE-celulose), um gradiente de sal (0 a 3.0) e tampão (pH=5.5) e uma filtração em gel utilizando uma matriz Sephacryl S-200 HR. A proteína 15 possui atividade enzimática estável por várias horas à 40ºC e em valores de pH entre 4.5 e 9.5. Para purificar essa proteína utilizou-se uma precipitação com sulfato de amônio - (NH₄)₂SO₄ à 50% de saturação, uma filtração em gel utilizando uma matriz Sephacryl S-200 HR e uma cromatografia de troca iônica, utilizando uma matriz de troca catiônica (CM-celulose), um gradiente de sal (0 a 2.0) e tampão (pH=6.5). Em cada etapa de purificação dessas proteínas, foi obtido um pool de frações,que apresentaram uma maior atividade enzimática e após foi realizado o SDS-PAGE (1D e 2D) e um ensaio imunoenzimático para apurar se as proteínas realmente foram purificadas, bem como, a quantidade de proteína em miligramas (mg) e unidades de enzima obtidas em unidades (Units), o rendimento do processo em porcentagem (%), o enriquecimento que é o fator de purificação e o custo em horas por 100 unidades (h/100U). 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Purificação da Proteína 2 A proteína 2 por ser estável em temperaturas até 60°C, foi realizado primeiramente o tratamento térmico, reduzindo os contaminantes presentes juntamente com essa proteína, isto pode ser observado pela redução na quantidade de proteínas de 511.0 para 60.4, tendo um fator de purificação de 8.5, atividade enzimática constante, custo de 0.012 h/100U e um rendimento de 100% , representado na Tabela 1. Obteve-se o SDS-PAGE da proteína 2 (1D e 2D) e imunoenzimático após a tratamento térmico que pode ser verificado na Figura 1. Portanto, restou-se apenas um contaminante e pôde ser separado utilizando uma filtração em gel (cromatografia de exclusão molecular). A matriz utilizada foi a Sephacryl S-200 HR, que apresenta uma faixa de peso molecular entre 500 e 250kDa, representado na Figura 2, e após o ensaio imunoenzimático, obteve-se o peso molecular da proteína 2 que foi de aproximadamente 50kDa, representado na Figura 1. Como resultado obtivemos uma atividade enzimática de 8399.8, um rendimento de 100%, um fator de purificação de 12,1 e um custo de 0.095 h/100U e representado na Tabela 1. Obteve-se o SDS-PAGE da proteína 2 (1D e 2D) e imunoenzimático após a filtração em gel, que pode ser verificado na Figura 3. Foram necessárias aproximadamente 8 horas para completar esta etapa. Após a realização das etapas apresentadas acima, obteve-se também o perfil cromatográfico submetido a exclusão molecular, verificado na Figura 4. A curva azul visualizada nesta figura representa as leituras espectrofotométricas a 280 nm que foi realizada pelo programa e de cada fração retirada da coluna cromatográfica. Já a curva em vermelho é a atividade enzimática da proteína de interesse (8400U) que foram utilizadas 20 frações (15-35) e resultando numa atividade específica de 199.52 U/mg de proteínas. Observa-se que um dos contaminantes foi eluido, porém a proteína ainda não pode ser purificada, já que o gel apresenta 2 bandas de proteínas com massas moleculares diferentes (SDS-PAGE 1D), porém valores de pH semelhantes (SDS-PAGE 2D), verificado na Figura 3. A separação da proteína de interesse não ocorreu da proteína de menor peso molecular (30kda) após a exclusão molecular, devido as duas terem um ponto isoelétrico semelhantes, de aproximadamente 7.0, entretanto ocorreu a separação parcialmente e utilizando um gel inserindo um anticorpo a molécula-alvo foi purificada totalmente. Tabela 1. Métodos utilizados na purificação da proteína 2; Proteínas totais; Atividade enzimática e específica, rendimento, fator de purificação e custo Método Proteína total (mg) Enzima (unidades) Atividade específica (U/mg) Rendimento (%) Fator de purificação Custo (h/100U) Início 511.0 8400.0 16.44 100.0 1.0 0 Tratamento térmico 60.4 8400.0 139.07 100.0 8.5 0.012 Filtração em gel 42.1 8399.8 199.52 100.0 12.1 0.095 Figura 1. SDS-PAGE da proteína 2 (1D e 2D) e imunoenzimático após a tratamento térmico. Figura 2. Características das matrizes utilizadas em cromatografia de exclusãomolecular. Fonte: <http://www.agbooth.com/pp_tut_online/Protein2.html>. Figura 3. SDS-PAGE da proteína 2 (1D e 2D) e imunoenzimático após a cromatografia de exclusão molecular Figura 4. Perfil cromatográfico da proteína 2 submetida a cromatografia de exclusão molecular. 4.2 Purificação da Proteína 11 A proteína 11 também é estável, porém em temperaturas até 50°C e foi utilizado o tratamento térmico que reduziu os contaminantes presentes juntamente com essa proteína, podendo ser observado pela redução na quantidade de proteínas de 511.0 para 234.7 , na qual, obteve-se uma atividade enzimática constante (3300 U), rendimento de 100%, um fator de purificação de 2.2, e um custo de 0.030 h/100U, representado na Tabela 2. Após foi utilizada uma cromatografia de troca iônica (alta resolução), com matriz de DEAE-celulose (Dietilaminoetil celulose), trocadora de ânions, um tampão com pH=5,5 e gradiente salino de 0 à 3.0, onde obteve-se um fator de 25.8 e um custo de 0.0242 h/100U e uma atividade enzimática de 3299.7 U, sendo necessário cerca de 8 horas para a realização dessa etapa. Portanto, restou-se apenas um contaminante e pôde ser separado utilizando uma filtração em gel (cromatografia de exclusão molecular). A matriz utilizada foi a Sephacryl S-200 HR, que apresenta uma faixa de peso molecular entre 500 e 250kDa, representado na Figura 2, e após o ensaio imunoenzimático, obteve-se o peso molecular da proteína 11 que foi de aproximadamente 20kDa, representado na Figura 5. Como resultado obtivemos uma atividade enzimática de 3299.7, proteínas totais de 12.1, um rendimento de 100%, um fator de purificação de 42.3 e um custo de 0.456 h/100U, representado na Tabela 2, sendo necessários 15 horas para a realização dessa etapa. Obteve-se o SDS-PAGE da proteína 11 (1D e 2D) e imunoenzimático após a filtração em gel, que pode ser verificado na Figura 5 que mostra que a cromatografia de exclusão molecular foi eficiente na retirada de contaminantes. Devido ao fato da molécula-alvo apresentar ponto isoelétrico de aproximadamente 5.0 distintos da outra molécula (contaminante), visualizado na Figura 6, pôde-se purificar a proteína utilizando a cromatografia de exclusão molecular. Com isso, os contaminantes foram adsorvidos e a proteína de interesse foi eluída nas últimas frações (segundo pico). Após a realização das etapas apresentadas acima, obteve-se também o perfil cromatográfico submetido a troca iônica e exclusão molecular, verificado na Figura 7 e 8 respectivamente. A curva azul visualizada nestas figuras representa as leituras espectrofotométricas a 280 nm que foi realizada pelo programa e de cada fração retirada da coluna cromatográfica. Já a curva em vermelho é a atividade enzimática da proteína de interesse (3299.7 e 3292.5 U respectivamente). Na cromatografia de troca iônica foram utilizadas frações de 45 à 50, resultando numa atividade específica de 166.65 U/mg de proteínas e na cromatografia de exclusão molecular foram utilizadas frações de 70 à 85, resultando numa atividade especifica de 272.11 U/mg de proteínas. Podemos observar pelo cromatograma da Figura 7, que o pico onde se encontra atividade enzimática não está bem definido, ou seja, ainda há contaminantes na amostra proteica, já na Figura 8, o pico onde se tem atividade enzimática está bem definido, sendo assim a proteína foi purificada. Tabela 2. Métodos utilizados na purificação da proteína 11; Proteínas totais; Atividade enzimática e específica, rendimento, fator de purificação e custo Método Proteína total (mg) Enzima (unidades) Atividade específica (U/mg) Rendimento (%) Fator de purificação Custo (h/100U) Início 511.0 3300 6.46 100 1.0 0 Tratamento térmico 234.7 3300 14.06 100 2.2 0.030 Troca Iônica 19.8 3299.7 166.65 100 25.8 0.242 Filtração em gel 12.1 3292.5 272.11 99.8 42.3 0.456 Figura 5. SDS-PAGE da proteína 11 (1D e 2D) e imunoenzimático após a cromatografia de exclusão Figura 6. SDS-PAGE da proteína 11 (2D) após a cromatografia de troca iônica Figura 7. Perfil cromatográfico da proteína 11 submetida a cromatografia de troca iônica aniônica Figura 7. Perfil cromatográfico da proteína 11 submetida a cromatografia de exclusão molecular 4.3 Purificação da Proteína 15 A primeira etapa do processo de purificação dessa proteína foi a precipitação com sulfato de amônio (50%), onde houve uma redução de 234 mg de proteínas , o rendimento se manteve à 100%, um fator de purificação de 1.8, a atividade enzimática se manteve e o custo foi de 0.065 h/100U, totalizando aproximadamente 2 horas de operação para essa etapa (Tabela 3) Após foi realizada uma cromatografia de exclusão molecular utilizando a matriz Sephacryl S-200 HR, que apresenta uma faixa de peso molecular entre 500 e 250kDa, representado na Figura 2, e após o ensaio imunoenzimático, obteve-se o peso molecular da proteína 15 que foi de aproximadamente 15 kDa, representado na Figura 9, sendo necessário aproximadamente 9 horas para a realização desta etapa. Pela figura 09 podemos observar que a purificação pela cromatografia de exclusão molecular não foi eficaz, pois há outros contaminantes que também foram purificados junto com a proteína de interesse e por isso precisou ser realizado outra cromatografia. Pela figura 10 e 11, podemos observar que ao realizar a cromatografia de troca iônica (pH do tampão = 6.5 e gradiente de sal de 0 a 2 e matriz CM-celulose) foi eficaz para a proteína ser purificada totalmente mostrando que a purificação foi eficaz., sendo necessário aproximadamente 41 horas para a realização desta etapa. Além disso, podemos observar que o ponto isoelétrico da proteína é aproximadamente 7.5 (Figura 10). Na cromatografia de exclusão molecular foram utilizadas frações de 45 a 58, resultando numa atividade específica de 59.86 U/mg de proteínas e na cromatografia de troca iônica foram utilizadas frações de 50 a 60, resultando numa atividade específica de 100.2 U/mg de proteínas. Podemos observar pelo cromatograma da Figura 11, que o pico da cromatografia da exclusão molecular, onde se encontra atividade enzimática não está bem definido, ou seja, ainda há contaminantes na amostra proteica, já na mesma figura, mas na cromatografia de troca iônica , o pico onde se tem atividade enzimática está bem definido, sendo assim a proteína foi purificada. Tabela 3. Métodos utilizados na purificação da proteína 15; Proteínas totais; Atividade enzimática e específica, rendimento, fator de purificação e custo Método Proteína total (mg) Enzima (unidades) Atividade específica (U/mg) Rendimento (%) Fator de purificação Custo (h/100U) Início 511.0 3100 6,07 100 1.0 0 Precipitação 277.0 3100 11,19 100 1.8 0.065 Filtração em gel 51.4 3077.0 59,86 99.3 9.9 0.292 Troca iônica 30.7 3073.7 100,12 99.2 16.5 1.334 Figura 9. SDS-PAGE da proteína 15 (1D e 2D) e imunoenzimático após a cromatografia de exclusão molecular Figura 10. SDS-PAGE daproteína 15 (2D) após a cromatografia de troca iônica Figura 11. Perfil cromatográfico da proteína 15; Métodos de purificação utilizados. 5. CONCLUSÃO A purificação das proteínas 11 e 15 foram eficientes, já que foi possível alcançar quase 100% de rendimento, 99.8% e 99.2%, respectivamente. Além disso, podemos verificar que, em cada etapa de purificação houve o enriquecimento da amostra, com fatores de purificação variando de 1.8 a 42.3 para estas proteínas. Já a proteína 2, foi parcialmente purificada, por falta de outras técnicas neste programa Protein Purification capazes de separar contaminantes com características físico-químicas semelhantes. É de grande importância destacar que alguns processos de purificação de biomoléculas são onerosos e exigem um longo prazo de purificação, porém a eficiência destes métodos justifica sua grande aplicação. Isto pode ser visto nas amostras aplicadas a cromatografia de exclusão molecular para a proteína 11, onde foram gastos apenas 8 horas de operação e para a precipitação com sulfato de amônio aplicada à proteína 15, onde foram gastos apenas 2 horas. Há também a necessidade de otimizar o processo de purificação dessas proteínas genéricas, reduzindo o tempo e custos, que podem ser obtidos por meio de métodos alternativos ou novas tecnologias. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS SILVA, L.H.M. Sistemas aquosos bifásicos: fundamentos e aplicações para partição/purificação de proteínas. Quim. Nova, Vol. 29, No. 6, 1345-1351, 2006. Departamento de Química, Centro de Ciências Exatas e Tecnológicas, Universidade Federal de Viçosa, 36571-000 Viçosa - MG, Brasil. ZUÑIGA, P. et al, 2003 Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology 158 editado por S.G. Amara, E. Bamberg, B. Fleischmann, T. Gudermann, S.C. Hebert, R. Jahn. KOBLITZ, M.G. Purificação parcial, por dois diferentes métodos cromatográficos, da lipase produzida por. Rhizopus sp. Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 24(2): 287- 292, abr.-jun. 2004. CARVALHP, R. J. Produção e purificação de um fragmento recombinante da proteína A de superfície do clado 3 (PspA3) de Streptococcus pneumoniae em Escherichia coli. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009. PADILHA, G.S. Caracterização, purificação e encapsulamento de lipase de burkholderia cepacia. Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas. Campinas – São Paulo, maio de 2010. LIMA, M.R. et al. Purificação de ricina a partir de saturação com sulfato de amônio. Universidade Estadual do Ceará, 2004. BALDASSO, C. Concentração purificação e fracionamento das proteinas do soro lácteo através da tecnologia de separação por membranas. Porto alegre, 2008.
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