Purificação Proteínas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS 
PROCESSOS FERMENTATIVOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS HIPOTÉTICAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PALMAS – TO 
2020
CECÍLIA MARQUES TENÓRIO PEREIRA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS HIPOTÉTICAS 
 
Trabalho apresentado à disciplina de Processos 
Fermentativos no Programa de Pós-Graduação em 
Ciência e Tecnologia de Alimentos da 
Universidade Federal do Tocantins, como parte 
das exigências avaliativas da disciplina sob a 
orientação do Prof. Dr. Fabrício de paul e do Prof. 
Dr. Alex Fernando de Almeida. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PALMAS – TO 
2020
SUMÁRIO 
 
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 3 
2. OJETIVOS ..................................................................................................................................... 4 
3. METODOLOGIA ......................................................................................................................... 4 
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................................. 6 
5. CONCLUSÃO ............................................................................................................................. 10 
REFERENCIAS .................................................................................................................................. 10 
 
3 
 
1. INTRODUÇÃO 
As proteínas são compostas por 20 aminoácidos (AA) unidos por ligações peptídicas, 
combinadas em diferentes formas e quantidades. Destes 20 AA, 9 são considerados como AA 
essenciais, ou seja, não podem ser sintetizados pelo corpo, devendo desta forma serem obtidos 
pela dieta (MORAN, 2013). Segundo Blanco e Bressani (1991), a qualidade da proteína é em 
referência à sua capacidade de satisfazer os requerimentos nutricionais do homem por AA 
essenciais e nitrogênio não-essencial, para realizar a síntese proteica. 
As proteínas desempenham papéis significativos em todos os organismos, e a 
compreender suas estruturas, assim como as funções das proteínas, é essencial para esclarecer 
a natureza da vida. Para conhecer as propriedades de uma proteína desejada, a purificação da 
proteína é a primeira etapa fundamental e premissa a ser conduzida (CHEN et. al, 2019). 
O principal objetivo do processo de purificação das proteínas tem como a obtenção de 
uma amostra para melhor compreensão de suas características estruturais e bioquímicas, além 
de um produto com maior atividade específica para aplicação em diversos processos 
(KOBLITZ et al., 2004). Assim, a purificação rápida e econômica de proteínas recombinantes 
representa um desafio persistente no campo da biotecnologia. 
Na fabricação em grande escala de proteínas recombinantes para uso industrial e 
terapêutico, a purificação downstream é muito cara e pode representar até 80% do custo total 
de produção (HEARN; ACOSTA, 2001). O desenvolvimento de métodos simples e confiáveis 
para purificação de proteínas, que podem ser aplicados a produtos arbitrários em escalas de 
laboratório e de fabricação, é, portanto, uma meta importante no desenvolvimento de tecnologia 
de biosseparação (BANKI et al., 2010). Até o momento, muitos estudos estabeleceram várias 
abordagens de purificação de proteínas que se beneficiaram de diferentes marcadores, incluindo 
marcadores de afinidade, marcadores de auto-agregação, ou etiqueta de auto-clivagem (LAN et 
al., 2011). A combinação de etapas de purificação em uma única é uma estratégia para a 
diminuição do número de etapas, como no caso da cromatografia de leito expandido na qual 
realiza simultaneamente a clarificação e a separação das proteínas (ARAÚJO et al., 2016) 
No esquema proposto por Belter (1986), a purificação de biomoléculas exige o emprego 
de muitas técnicas devendo-se buscar a mais apropriada para cada estágio de separação. Assim, 
são empregadas técnicas diferentes na remoção de compostos insolúveis ou clarificação, no 
isolamento do produto ou captura, na purificação intermediária e no polimento (PHARMACIA 
BIOTECH, 1999). 
Apesar da disponibilidade de diferentes métodos de purificação de proteínas, atualmente 
a técnica por cromatografia tem sido utilizada com freqüência devido ao elevado poder de 
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1110/ps.041296305#bib10
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resolução da mesma. A escolha do tipo de cromatografia depende das características biológicas 
e físico-químicas da molécula da proteína: tamanho (Cromatografia de Filtração em Gel), carga 
elétrica (Cromatografia de Troca Iônica), características de bioespecificidade (Cromatografia 
por Afinidade) e hidrofobicidade (Cromatografia de Interação Hidrofóbica) (QUEIROZ et al., 
2001). 
A disponibilidade de diferentes técnicas cromatográficas com diferentes propriedades 
fornece combinação poderosa para a purificação de qualquer biomolécula (PHARMACIA 
BIOTECH, 1999). A quantidade e tipo de técnicas usadas dependerão da natureza e das 
características das amostras, assim como do grau de pureza desejado no produto final 
(PASECHNIK, PHLS, 1995). 
 
2. OJETIVOS 
Utilizar a ferramenta online “Protein Purification” para realizar a purificação de 
proteínas hipotéticas. 
 
3. METODOLOGIA 
Para a purificação da proteína 10, foi utilizada a versão online grátis da ferramenta 
Protein Purification pertencente a página online http://www.agbooth.com/pp_ajax/ foi 
utilizada. 
A proteína de número dez foi selecionada e as informações iniciais coletadas iniciando 
purificação. Foi escolhida como etapa inicial o Tratamento Térmico, onde foi colocado uma 
temperatura de 50°C, por 120min, conforme é descrito na Figura 1. 
 
Figura 1 – Etapa inicial realizada com Tratamento Térmico, temperatura de 50°C por 120min. 
 
http://www.agbooth.com/pp_ajax/
5 
 
 
A Cromatografia de Interação Hidrofóbica foi realizada em seguida. Foi eluido com um 
gradiente decrescente de concentração de sal de Fenil-Sepharose CL4B (Figura2A), utilizando 
2,0 como o início e 0,0 como o fim, para os limites do gradiente molar (Figura 2B). 
 
Figura 2 – Cromatografia de Interação Hidrofóbica com Fenil-Sepharose CL4B (a) e limites utilizados para o 
gradiente molar (b). 
 
 
Após aplicar o processo foi identificado onde se encontrava à atividade enzimática e foi 
aplicada a primeira fração em 45 e a última fração em 58 conforme é descrito na Figura 3. 
 
Figura 3 - Atividade enzimática identificada e aplicada a fração. 
 
 
Por último, foi feita a Filtração em Gel, utilizando o meio Sephacryl S-200 HR (Figura 
4A). Após aplicar o processo foi identificado onde se encontrava à atividade enzimática e foi 
a 
a 
b 
6 
 
aplicada a primeira fração em 55 e a última fração em 68 conforme é descrito na Figura 4B. Foi 
verificado se a proteína foi purificada e as informações coletadas. 
 
Figura 4 - Aplicação da Filtração em Gel com Sephacryl S-200 HR (a) e atividade enzimática identificada e 
aplicada a fração (b). 
 
 
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
A proteína 10 tem a atividade enzimática estável a temperatura até 50ºC com valores de 
pH entre 3,5 e 11,5. A proteína tinha um teor de 511 mg de proteínas totais, uma quantidade de 
10200 unidades da enzima de interesse, fator de purificação igual a 1, rendimento de 100% e 
custo zero (Figura 5). 
 
Figura 5 - Dados da proteína 10 
 
 
Na Figura 6 é demonstrado os resultados da purificação com Tratamento Térmico. Após 
realizar a primeira purificação houve redução no teor de proteína, de 551mg para 234,7mg de 
a 
a 
b 
7 
 
proteínas totais, as unidades de enzimas permaneceram o mesmo valor de 10200, assim como 
o valor de rendimento não foi afetado pelo processo de purificação, continuando a apresentar 
um rendimentode 100%, e por último o fator de purificação saltou de 1 para 2,2. Esses 
resultados obtidos, significam que a escolha do processo foi correto e também apresentam um 
ótimo rendimento. 
 
Figura 6 - Resultado da purificação com Tratamento Térmico. 
 
 
Para a verificação se houve a purificação foi efetiva na proteína, foi realizada uma 
análise eletroforética em 1D, e pode-se observar que a molécula ainda não estava totalmente 
purificada, já apresentou algumas bandas no SDS PAGE 1D com massas moleculares 
significativamente distintas e com variação de relação entre o pico de atividade e o pico 
cromatográfico (Figura 7). 
 
Figura 7 - Gel SDS PAGE 1D, com as bandas distintas indicando que não ocorreu a purificação. 
 
8 
 
 
Para os resultados da segunda purificação, utilizando a Cromatografia de Interação 
Hidrofóbica, percebemos que houve grande redução no teor de proteína, de 234,7mg para 
73,1mg de proteínas totais, as unidades de enzimas obtiveram um pequeno declínio de 10200 
para 9915, e o seu valor de rendimento também sofreu uma leve alteração com processo de 
purificação, passando a apresentar um rendimento de 97,2%. Por último, o fator de purificação 
saltou de 2,2 para 6,8, indicando que a enzima está sendo purificada (Figura 8), e fazendo-se 
necessário a conferência com a análise eletroforética para confirmar se houve purificação. 
 
Figura 8 - Resultado da purificação com Cromatografia de Interação Hidrofóbica. 
 
 
Figura 9 - Gel SDS PAGE 1D, com as bandas distintas indicando que não ocorreu a purificação. 
 
 
9 
 
A análise eletroforética em 1D foi realizada, e pode-se observar que a molécula ainda 
não estava totalmente purificada, já que apresentou três bandas no SDS PAGE 1D, mas nota-
se que o método de Cromatografia de Interação Hidrofóbica foi eficiente, pois houve uma 
grande redução na presença das bandas no SDS PAGE 1D (Figura 9). Com este resultado 
somente não foi possível obter a purificação total da enzima, então, prosseguiu-se para o 
próximo método. 
 
Figura 10 - Resultado da purificação com Filtração de Gel. 
 
 
Para os resultados da purificação com Filtração em Gel, notamos uma redução no teor 
de proteína, de 73,1mg para 33mg de proteínas totais, as unidades de enzimas obtiveram um 
pequeno declínio de 9915 para 9861,5, e o seu valor de rendimento também sofreu uma leve 
alteração com processo de purificação, passando a apresentar um rendimento de 96,7%. Por 
último, o fator de purificação saltou de 6,8 para 15, indicando que a enzima está purificada 
(Figura 10), devido à alta diferença no fator de purificação. A purificação foi confirmada com 
a análise eletroforética. 
A purificação foi confirmada a partir do PAGE 1D onde apenas uma banda de proteína 
pode ser observada (Figura 11). Podemos observar que a purificação ocorreu sem haver um 
rendimento brusco da proteína. 
 
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Figura 11 - Gel SDS PAGE 1D, com as bandas distintas indicando que ocorreu a purificação. 
 
 
A enzima 10 foi purificada no terceiro método utilizado, sendo necessário para sua 
purificação os métodos de Tratamento Térmico, Cromatografia de Interação Hidrofóbica. e 
Filtração de Gel, o processo apresentou um excelente rendimento de 96,7 %, significando que 
houveram poucas perdas no processo e os métodos escolhidos foram eficientes e apresentaram 
bons resultados. 
 
5. CONCLUSÃO 
A purificação da proteína 10, hipotética, analisada no presente trabalho obteve 
resultados satisfatórios, nos quais a purificação ocorreu totalmente, sem que houvesse a 
presença de contaminantes. Conclui-se que para que haja uma completa purificação da proteína, 
é necessário que haja um estudo prévio das características da molécula-alvo. Para que a escolha 
do método que será utilizado, proporcione os melhores rendimentos, pureza e menores gastos. 
 
REFERENCIAS 
ARAÚJO, N. K. DE et al. International Journal of Biological Macromolecules Single-step 
purification of chitosanases from Bacillus cereus using expanded bed chromatography. 
International Journal of Biological Macromolecules, v. 82, p. 291–298, 2016. 
 
BANKI, M. R.; GERNGROSS, T. U.; WOOD, D. W. Novel and economical purification of 
recombinant proteins: intein-mediated protein purification using in vivo polyhydroxybutyrate 
(PHB) matrix association Protein Sci., 14 (2010), pp. 1387-1395. 
 
BLANCO, A.; BRESSANI, R. Biodisponibilidad de aminoácidos in el frijol (Plhaseolus 
vulgaris). Archivos Latinoamericano de Nutrición, v. 41, n. 1, p. 38-51, 1991. 
 
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CHEN, Z. et al. A novel protein purification strategy mediated by the combination of CipA and 
Ssp DnaB intein. Journal of Biotechnology, 2019. 
 
HEARN, M.T.; ACOSTA, D. 2001. Applications of novel affinity cassette methods: Use of 
peptide fusion handles for the purification of recombinant proteins. J. Mol. Recognit. 14: 323–
369. 
 
KOBLITZ MGB, PASTORE M.G. Purificação parcial, por dois diferentes métodos 
cromatográficos, da lipase produzida por Rhizopussp. Ciência e Tec. de Alim., v.24, p.287-
292, 2004. 
 
LAN, D. et al. An improved nonchromatographic method for the purification of recombinant 
proteins using elastin-like polypeptide-tagged proteases. Analytical Biochemistry, 2011. 
 
MORAN, L.A.; HORTON, H.R.; SCRIMGEOUR, K.G.; PERRY, M.D. Amino acids and the 
primary structure of proteins. Biochemistry São Paulo: Pearson Education of Brazil; 2013. p. 
56-85. 
 
PASECHNIK, V.A.; PHLS, J.M. Large-scale extraction and purification of enzymesand other 
proteins. In: HANDBOOK of enzyme biotechnology. New York: Wiseman,1995. p.31-82 
 
PHARMACIA BIOTECH. Protein purification handbook. Sweden, 1999. p. 97. 
 
QUEIROZ, J. A.; TOMAZ, C. T.; CABRAL, J. M. S. Hydrophobic interation chromatography 
of proteins. J. Biotechnol., Oxford, v.87, p.143-159, 2001.