pigmentos 2

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS 
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS 
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
EXTRAÇÃO, MICRONIZAÇÃO E ESTABILIZAÇÃO DE PIGMENTOS 
FUNCIONAIS: CONSTRUÇÃO DE UMA UNIDADE MULTIPROPÓSITO 
PARA DESENVOLVIMENTO DE PROCESSOS COM FLUIDOS 
PRESSURIZADOS 
 
 
Diego Tresinari dos Santos 
 
Orientador: Profa. Dra. Maria Angela de Almeida 
Meireles. 
 
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de 
Alimentos da Universidade Estadual de Campinas, 
para Obtenção do Título de Doutor em Engenharia 
de Alimentos. 
 
CAMPINAS-SP 
Fevereiro de 2011 
 ii 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA 
BIBLIOTECA DA FEA – UNICAMP 
 
 
 Título em inglês: Extraction, micronization and stabilization of functional pigments: 
 construction of multipurpose unit for pressurized fluid process 
 development 
 Palavras-chave em inglês (Keywords): Stabilization, Extraction, Pressurized Fluids, 
 Micronization, Functional pigments 
 Titulação: Doutor em Engenharia de Alimentos 
 Banca examinadora: Maria Angela de Almeida Meireles 
 Silvânia Regina Mendes Moreschi 
 Carlos Raimundo Ferreira Grosso 
 Reinaldo Camino Bazito 
 Juliana Martin do Prado 
 Data da Defesa: 22/02/2011 
 Programa de Pós Graduação em Engenharia de Alimentos 
 
 Santos, Diego Tresinari dos 
Sa59e Extração, micronização e estabilização de pigmentos funcionais: 
construção de uma unidade multipropósito para desenvolvimento de 
processos com fluidos pressurizados / Diego Tresinari dos Santos. -- 
Campinas, SP: [s.n], 2011. 
 
 
 Orientador: Maria Angela de Almeida Meireles 
 Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas. Faculdade 
de Engenharia de Alimentos. 
 
 
 1. Estabilização. 2. Extração. 3. Fluidos Pressurizados. 4. 
Micronização. 5. Pigmentos funcionais. I. Meireles, Maria Angela 
de Almeida. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de 
Engenharia de Alimentos. III. Título. 
 
 cars/bibfea 
 iii 
 
Este exemplar corresponde à redação final da tese defendida em 22/02/2011 por Diego 
Tresinari dos Santos aprovado pela comissão julgadora em 22/02/2011. 
 
________________________________________________ 
Profa. Dra. Maria Angela de Almeida Meireles 
FEA / UNICAMP 
Orientador 
 
________________________________________________ 
Profa. Dra. Silvânia Regina Mendes Moreschi 
Universidade Tecnológica Federal do Paraná 
Membro 
 
________________________________________________ 
Prof. Dr. Carlos Raimundo Ferreira Grosso 
FEA / UNICAMP 
Membro 
 
________________________________________________ 
Prof. Dr. Reinaldo Camino Bazito 
IQ / USP 
Membro 
 
________________________________________________ 
Dra. Juliana Martin do Prado 
FEA / UNICAMP 
Membro 
 
________________________________________________ 
Dra. Carmen Lucia Queiroga 
CPQBA / UNICAMP 
Suplente 
 
________________________________________________ 
Dr. Flávio Cortiñas Albuquerque 
CENPES / PETROBRÁS 
Suplente 
 
________________________________________________ 
Profa. Dra. Miriam Dupas Hubinger 
FEA / UNICAMP 
Suplente 
 iv 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Todas as inovações eficazes são surpreendentemente simples. 
Na verdade, o maior elogio que uma inovação pode receber é haver quem diga: 
isto é óbvio. Por que não pensei nisso antes? 
 
Peter Drucker 
 v 
 
AGRADECIMENTOS 
 
Á Deus, por tudo que me há propiciado seja profissionalmente ou pessoalmente. 
 
À UNICAMP, por toda a sua estrutura. 
 
Ao CNPq, pela concessão da bolsa e financiamento deste projeto de pesquisa. 
 
À CAPES, pelo auxílio financeiro (PROEX) para participação no 10 º Congresso Brasileiro 
de Polímeros em Foz do Iguaçu-PR. 
 
À Profa. Dra. Maria Angela de Almeida Meireles, pela brilhante orientação, confiança, 
entusiasmo e exemplo como orientadora, pesquisadora e professora, bem como aos 
ensinamentos de não mensurável valor transmitidos a mim de ordem profissional e pessoal. 
 
Ao Pesquisador Ariovaldo Astini, pela amizade e valiosa contribuição de ordem técnica e 
intelectual durante o desenvolvimento deste projeto de pesquisa. 
 
Aos Pesquisadores Prof. Dr. Elton Franceschi, Prof. Dr. Paulo de Tarso Vieira e Rosa e aos 
membros da banca examinadora, pelas sugestões e ensinamentos fundamentais para a 
realização deste trabalho. 
 
Às Pesquisadoras Profa. Dra. Marisa Beppu e Dra. Carmem Queiroga, por disponibilizarem 
seus laboratórios para a realização de alguns experimentos referentes a este projeto de 
pesquisa. 
 
À minha amiga, parceira de dança, investidora, “marida” e Pesquisadora Ms. Juliana 
Queiroz Albarelli, pelas inúmeras “trocas de idéias” sobre o desenvolvimento desta tese e de 
outros trabalhos que desenvolvemos em parceria, bem como por ter contribuído 
 vi 
 
significativamente no desenvolvimento dos experimentos relacionados à estabilização dos 
extratos antociânicos. 
 
Aos colegas de trabalho Priscilla Veggi, Rodrigo Cavalcanti, Helmut Navarro e Carolina 
Albuquerque, pelo ânimo e disponibilidade de desenvolvermos alguns trabalhos em 
paralelo que resultaram e ainda resultarão em algumas publicações. 
 
Aos Pesquisadores e amigos Prof. Dr. Silvio Silvério da Silva, Prof. Dr. Attílio Converti, 
Prof. Dr. Victor Haber Pérez, Dr. Boutros Fouad Sarrouh, Profa. Dra. Lilian Masson, Prof. 
Dr. Michael Oelgemöller e Profa. Dra. Maria José Cocero, que com seus valiosos 
ensinamentos e conselhos contribuíram para a construção do profissional que me tornei. 
 
À minha Mãe, por ter sempre se preocupado prioritariamente com a minha educação e 
formação, as quais foram os alicerces para a chegada no patamar que estou, bem como pelo 
amor incondicional. 
 
Ao meu Pai, à minha Vó, Tio Fernando, Tia Maria, Tia Flor e a todos os familiares que, 
mesmo de longe, participaram me apoiando e incentivando em todos os momentos. 
 
Aos amigos e colegas do DEA pelas horas agradáveis que compartilhamos. 
 vii 
 
ÍNDICE 
RESUMO ........................................................................................................................ XVII 
ABSTRACT ..................................................................................................................... XIX 
CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO E OBJETIVOS ............................................................. 1 
1.1 Introdução ....................................................................................................................... 1 
1.2 Objetivos da Pesquisa ..................................................................................................... 3 
1.2.1 Geral ...................................................................................................................... 3 
1.2.2 Específicos ............................................................................................................. 3 
1.3 Estrutura da Tese de Doutorado ................................................................................... 4 
CAPÍTULO 2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................. 9 
2.1. Pigmentos Funcionais ....................................................................................................9 
2.1.1 Flavonóides ......................................................................................................... 10 
2.1.2 Carotenóides ........................................................................................................ 13 
2.2. Métodos de Extração ................................................................................................... 15 
2.2.1 Extração com Fluidos Pressurizados .................................................................. 17 
2.2.1.1 Extração com Líquidos Pressurizados .......................................................... 18 
2.2.1.2 Extração com CO2 supercrítico .................................................................... 19 
2.2.2 Métodos de Extração Assistida ........................................................................... 20 
2.2.2.1. Com ultrassom ............................................................................................. 20 
2.2.2.2. Com CO2 a alta pressão ............................................................................... 21 
2.3. Formação de Partículas .............................................................................................. 22 
2.4.1 Para Extração ..................................................................................................... 23 
2.4.1.1 Para Extração com Líquidos Pressurizados .................................................. 25 
2.4.1.2 Para Extração com CO2 Supercrítico ........................................................... 25 
2.4.1.3 Para Extração assistida com ultrassom ......................................................... 26 
2.4.1.4 Para Extração assistida com CO2 a alta pressão ........................................... 27 
2.4.2 Para Formação de Partículas ............................................................................. 28 
2.4.2.1 Para Formação de Partículas Via SAS ......................................................... 28 
2.4.2.2 Para Formação de Partículas Via RESS ....................................................... 29 
Referências .......................................................................................................................... 29 
CAPÍTULO 3 - DETALHAMENTO DA CONSTRUÇÃO E FUNCIONAMENTO DA 
UNIDADE MULTIPROPÓSITO ..................................................................................... 37 
CAPÍTULO 4 - ANTIOXIDANT PIGMENT EXTRACTION USING A HOME-
MADE PRESSURIZED SOLVENT EXTRACTION SYSTEM ................................... 43 
Key words ............................................................................................................................ 44 
Abstract ............................................................................................................................... 44 
 viii 
 
4.1 Introduction .................................................................................................................. 44 
4.2 Materials and methods ................................................................................................. 47 
4.2.1 Plant Material ..................................................................................................... 47 
4.2.1 Annatto seeds ................................................................................................... 47 
4.2.2 Jabuticaba skins ............................................................................................... 47 
4.2.2 Extraction Procedures ......................................................................................... 48 
4.2.3 Extract Characterization ..................................................................................... 51 
4.2.3.1 From Jabuticaba skins .................................................................................. 51 
4.2.3.1.1 Anthocyanin content .............................................................................. 51 
4.2.3.1.2 Thin-Layer Chromatography (TLC) ...................................................... 52 
4.2.4 Statistical Analysis ............................................................................................... 52 
4.3 Results and discussion .................................................................................................. 53 
4.3.1 Obtaining Annatto seed extracts ......................................................................... 53 
4.3.2 Obtaining Jabuticaba skin extracts ..................................................................... 56 
4.4 Conclusions ................................................................................................................... 59 
Acknowledgements ............................................................................................................. 59 
References ........................................................................................................................... 59 
CAPÍTULO 5 - PRESSURIZED LIQUID EXTRACTION OF PHENOLIC 
COMPOUNDS FROM JABUTICABA SKINS: OPTIMIZATION STUDY ............... 61 
Key words ............................................................................................................................ 62 
Abstract ............................................................................................................................... 62 
5.1 Introduction .................................................................................................................. 62 
5.2 Material and methods .................................................................................................. 65 
5.2.1 Plant Material ..................................................................................................... 65 
5.2.2 Extraction Procedures ......................................................................................... 65 
5.2.3 Extract Characterization ..................................................................................... 67 
5.2.4 Statistical Analysis ............................................................................................... 69 
5.3 Results and discussion .................................................................................................. 70 
5.3.1 Effects of process variables on the extraction yield ............................................ 70 
5.3.2 Effects of process variables on the recovery of anthocyanins ............................. 71 
5.3.3 Effects of process variables on the recovery of phenolic compounds ................. 74 
5.3.4 Optimization of the extraction process ................................................................ 77 
5.4 Conclusions ................................................................................................................... 82 
Acknowledgements ............................................................................................................. 83 
References ........................................................................................................................... 83 
 ix 
 
CAPÍTULO 6 - OPTIMIZATION OF BIOACTIVE COMPOUNDS EXTRACTION 
FROM JABUTICABA (MYRCIARIA CAULIFLORA) SKINS ASSISTED BY HIGH 
PRESSURE CO2 ................................................................................................................. 87 
Key words ............................................................................................................................ 88 
Abstract ............................................................................................................................... 88 
6.1 Introduction .................................................................................................................. 89 
6.2 Material and methods .................................................................................................. 91 
6.2.1 Plant material ......................................................................................................91 
6.2.2 High Pressure Carbon Dioxide Assisted-Extraction (HPCDAE) system ............ 91 
6.2.3 Extraction Procedures ......................................................................................... 92 
6.2.4 Extract Characterization ..................................................................................... 95 
6.2.5 Statistical analysis ............................................................................................... 97 
6.2.6 Determination of experimental extraction kinetics curves and parameters ........ 97 
6.3 Results and discussion .................................................................................................. 97 
6.3.1 Effects of process variables on recovery of anthocyanins ................................... 97 
6.3.2 Effects of process variables on recovery of phenolic compounds ..................... 101 
6.3.3 Optimization of the extraction process .............................................................. 105 
6.3.4 Experimental extraction kinetics curves using optimum conditions ................. 108 
6.4 Conclusions ................................................................................................................. 112 
Acknowledgements ........................................................................................................... 114 
References ......................................................................................................................... 114 
CAPÍTULO 7 - MICRONIZATION AND ENCAPSULATION OF FUNCTIONAL 
PIGMENTS USING SUPERCRITICAL CARBON DIOXIDE .................................. 117 
Key words .......................................................................................................................... 118 
Abstract ............................................................................................................................. 118 
7.1 Introduction ................................................................................................................ 119 
7.2 Materials and methods ............................................................................................... 121 
7.2.1 Materials ............................................................................................................ 121 
7.2.2 Micronization process via SAS .......................................................................... 124 
7.2.3 Encapsulation process via SAS ......................................................................... 127 
7.2.4 Encapsulation process via RESS ....................................................................... 128 
7.2.5 Characterization and Analysis .......................................................................... 130 
7.2.5.1.1 Determination of Precipitation Yield - PY (%) .................................. 131 
7.2.5.1.2 Determination of Encapsulation Efficiency (EE (%)) ......................... 131 
7.3 Results and discussion ................................................................................................ 132 
7.3.1 Micronization process via SAS .......................................................................... 132 
7.3.2 Encapsulation process via SAS ......................................................................... 138 
 x 
 
7.3.3 Encapsulation process via RESS ....................................................................... 142 
7.4 Conclusions ................................................................................................................. 145 
Acknowledgements ........................................................................................................... 147 
References ......................................................................................................................... 147 
CAPÍTULO 8 - STABILIZATION OF ANTHOCYANIN EXTRACT FROM 
JABUTICABA SKINS BY ENCAPSULATION USING SUPERCRITICAL CO2 AS 
SOLVENT ......................................................................................................................... 153 
Key words .......................................................................................................................... 154 
Abstract ............................................................................................................................. 154 
8.1 Introduction ................................................................................................................ 154 
8.2.2 Anthocyanin Extraction ..................................................................................... 156 
8.2.3 Encapsulation of Anthocyanin Extract .............................................................. 156 
8.2.3.1 By Rapid Expansion of Supercritical Solution (RESS) process ................ 156 
8.2.3.1.1 Evaluation of the antioxidant activity of the encapsulated anthocyanin 
extract after RESS process ..................................................................................... 161 
8.2.3.2 By conventional method ............................................................................. 161 
8.2.4 Anthocyanin Stabilization Studies ..................................................................... 162 
8.2.4.1 Free and encapsulated extract degradation studies ..................................... 162 
8.2.4.2 Thermal analysis of free and encapsulated extracts ................................... 164 
8.2.5 Anthocyanin Extract Release Studies ................................................................ 164 
8.2.6 Statistical Analysis ............................................................................................. 164 
8.3 Results and discussion ................................................................................................ 165 
8.3.1 Encapsulation of anthocyanin extract by RESS process ................................... 165 
8.3.2 Encapsulation of anthocyanin extract by conventional method ....................... 169 
8.3.3 Anthocyanin stabilization by encapsulation ...................................................... 170 
8.3.4 Release studies ................................................................................................... 173 
8.4 Conclusions ................................................................................................................. 175 
Acknowledgements ........................................................................................................... 176 
References ......................................................................................................................... 176 
CAPÍTULO 9 - CONCLUSÕES GERAIS ..................................................................... 181 
SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS .......................................................... 185 
MEMÓRIA DO PERÍODO DO DOUTORADO .......................................................... 187 
PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................... 189 
APÊNDICE I - ARTIGO DE REVISÃO - JABUTICABA AS A SOURCE OF 
FUNCTIONAL PIGMENTS ........................................................................................... 193 
 xi 
 
APÊNDICE II – DETALHAMENTO DO PROCEDIMENTO DE CÁLCULO DA 
CONCENTRAÇÃO DE ANTOCIANINAS E FENÓIS ............................................... 201 
APÊNDICE III - ARTIGO DE REVISÃO - CAROTENOID PIGMENTS 
ENCAPSULATION: FUNDAMENTALS, TECHNIQUES AND RECENT TRENDS
 ............................................................................................................................................ 207 
APÊNDICE IV - MANUAL DE OPERAÇÃO DA UNIDADE MULTIPROPÓSITO
 ............................................................................................................................................ 219 
 
LISTA DE TABELASTabela 2.2.1.1 - Constantes críticas de alguns fluidos com interesse em extração (MENDES 
et al., 2003) ........................................................................................................................... 17 
Table 4.3.1.1 - Percentage of Residual Extract (%) deposited in the exit tubing line when 
using different SFE systems/configurations. ........................................................................ 55 
Table 5.2.2.1 - The experimental design of phenolic compound extraction from jabuticaba 
skins ...................................................................................................................................... 66 
Table 5.3.4.1 - Optimum PLE conditions for the extraction yields, anthocyanins and total 
phenols from jabuticaba skins .............................................................................................. 77 
Table 5.3.4.2 - Predicted and experimental values of responses under optimum PLE 
conditions (50 bar, temperature of 80 °C and static extraction time of 9 min) and 
experimental values responses obtained by Conventional Low Pressure Liquid Extraction 
(LPLE) .................................................................................................................................. 79 
Table 6.3.1.1 - 23 full factorial design for HPCD Assisted-Extraction from jabuticaba skins 
and the total anthocyanin and phenolic contents of the extracts .......................................... 99 
Table 6.3.1.2 - Regression coefficients of the model for the response variables ............... 101 
Table 6.3.3.1 - Predicted and experimental values of response variables under optimum 
HPCDAE conditions (at 117 bar, temperature of 80 °C, of 20 % and 20 minutes of 
extraction) and experimental values of response variables obtained by control HPCDAE 
experiment (at atmospheric pressure, temperature of 80 ºC and 20 minutes of extraction) 
and by PLE experiment (at 117 bar, temperature of 80 ºC, 20 minutes of extraction and 
flow rate of 1 mL of acidified water/min) .......................................................................... 108 
Table 6.3.4.1 - Experimental values of the steady-state extraction Y*, the time t* to reach 
the Y* and the mass transfer rate M* for the recovery of anthocyanins and phenolic 
compounds .......................................................................................................................... 111 
 
LISTA DE FIGURAS 
Figura 2.1.1.1 - Estrutura base dos flavonóides. .................................................................. 11 
Figura 2.1.1.2 - Cascas de jabuticaba. .................................................................................. 12 
 xii 
 
Figura 2.1.2.1 - Estrutura do β-caroteno ............................................................................... 13 
Figura 2.1.2.2 - Sementes de urucum. .................................................................................. 15 
Figura 2.2.1.2.1 - Diagrama de fase pressão-temperatura do dióxido de carbono ............... 20 
Figura 2.4.1.1.1 - Equipamento comercial para extração com líquidos pressurizados. a) 
ASE® 150; b) ASE® 350 (DIONEX, 2010) .......................................................................... 24 
Figura 2.4.1.1.2 - Equipamento comercial para extração com líquidos pressurizados 
(FLUID MANAGEMENT SYSTEMS, 2010) ..................................................................... 24 
Figura 2.4.1.2.1 - Equipamento comercial para extração com CO2 supercrítico (APPLIED 
SEPARATIONS, 2010) ........................................................................................................ 26 
Figura 2.4.1.3.1 - Equipamento comercial para extração assistida com ultrassom 
(HIELSCHER, 2010) ........................................................................................................... 27 
Figura 2.4.2.1.1 - Equipamento comercial para formação de partículas via SAS (THAR 
TECHNOLOGIES, 2010) .................................................................................................... 28 
Figura 2.4.2.2.1 - Fluxograma da unidade experimental comercial da Thar Technologies 
RESS-100. 1 - Reator; 2 - Agitador; 3 – Termostato; 4, 7 e 8 - válvulas; 5 -Medidor de 
fluxo; 6 - Bomba de alta pressão; 9 - Dispositivo de expansão; 10 - Trocador de calor para 
aquecimento; 11 - Câmara de expansão; 12 - Trocador de calor para resfriamento; 13 - 
Computador (GIL’MUTDINOV et al., 2009). ..................................................................... 29 
Figura 3.1 - Foto da parte estrutural da unidade. .................................................................. 38 
Figura 3.2 - Fotos da unidade multipropósito. A - Vista de frente da unidade; B - Sistema 
ultrassônico quando acoplado à unidade; C - Vista do sistema de aquecimento do vasos de 
pressão menor: D - Vista lateral da unidade. ........................................................................ 40 
Figura 3.3 - Foto da serpentina imersa no banho termostatizado de resfriamento. .............. 42 
Figure 4.2.2.1 - Schematic diagram of the home-made pressurized solvent extraction 
system. 1 CO2 cylinder; 2 CO2 filter; 3 Manometers; 4 Valves; 5 Thermostatic bath; 6 CO2 
Pump; 7 Back pressure regulator; 8 HPLC pump; 9 Solvent resevoir; 10 Extraction cell; 11 
Micrometric valve with a heating system; 12 Temperature controller; 13 Sampling bottle. 48 
Figure 4.2.2.2 - Schematic diagram of the home-made pressurized solvent extraction 
system. 1 CO2 cylinder; 2 CO2 filter; 3 Manometers; 4 Valves; 5 Thermostatic bath; 6 CO2 
Pump; 7 Back pressure regulator; 8 HPLC pump; 9 Solvent reservoir; 10 Extraction cell; 11 
Ultrasound bath; 12 Heating bath; 13 Micrometric valve with a heating system; 14 
Temperature controller; 15 Sampling bottle. ........................................................................ 50 
Figure 4.3.1.1 - Recovery of pigments from Annatto seeds as a function of time using 
different SFE systems/configurations: ■ Commercial SFE; □ Home-made SFE using 
electric heating; ● Home-made Ultrasound Assisted SFE; ○ Home-made SFE using water 
bath heating. ......................................................................................................................... 54 
Figure 4.3.1.2 - Extraction yields (%) (after 240 min) using different SFE 
systems/configurations. ........................................................................................................ 55 
 xiii 
 
Figure 4.3.2.1 - Thin-layer chromatography (TLC) plates (1 - Extract obtained at 30 
MPa/333 K run 1; 2 – Extract obtained at 30 MPa/333 K run 2; a) Revealed using DPPH 
reagent on visible light; b) Revealed using Natural products (NP) reagent on light (365 nm); 
c) Revealed using anisaldehide-sulphuric acid reagent on visible light; d) Revealed using 
anisaldehide-sulphuric acid reagent on ultraviolet light (365 nm). ...................................... 58 
Figure 5.2.2.1 - Pressurized liquid extraction set-up. ........................................................... 66 
Figure 5.3.1 - Three-dimensional response surfaces of the influence of extraction 
temperature and static extraction time on the extraction yield. ............................................ 70 
Figure 5.3.2.1 - Effect (p<0.05) of extraction variables on the recovery of anthocyanins: a) 
at 50-100 bar, 40-80 ºC and 3-9 min; b) at 80-120 ºC and 9-15 min at a fixed extraction 
pressure of 50 bar (1, pressure; 2, temperature; 3, static time)............................................. 72 
Figure 5.3.2.2 - Three-dimensional response surfaces of the influence of temperature and 
static extraction time on recovery of anthocyanins .............................................................. 73 
Figure 5.3.3.1 - Effect (p<0.05) of extraction variables on the recoveryof total phenolic 
compounds: a) at 50-100 bar, 40-80 ºC and 3-9 min; b) at 80-120 ºC and 9-15 min at a 
fixed extraction pressure of 50 bar (1, pressure; 2, temperature; 3, static time). ................. 75 
Figure 5.3.3.2 - Three-dimensional response surfaces of the influence of temperature and 
static extraction time on recovery of total phenolic compounds. ......................................... 76 
Figure 5.3.4.1 - Kinetics curves: a) overall extraction yield; b) recovery of anthocyanins; c) 
recovery of total phenolic compounds under optimum PLE conditions (50 bar, temperature 
of 80 °C and 9 min of static extraction time). ...................................................................... 81 
Figure 6.2.1 - Diagram of High Pressure Carbon Dioxide Assisted-Extraction (HPCDAE) 
system. 1 CO2 cylinder; 2 CO2 filter; 3 Manometers; 4 Valves; 5 Thermostatic bath; 6 
Pump; 7 Back pressure regulator; 8 Heating bath; 9 High pressure vessel; 10 
Thermocouple; 11 Temperature controllers; 12 Micrometric valve with a heating system. 92 
Figure 6.3.1.1 - Three-dimensional response surfaces of the influence of extraction pressure 
and temperature on recovery of anthocyanins. ................................................................... 100 
Figure 6.3.1.2 - Two-dimensional response surfaces of the influence of extraction pressure 
and temperature on recovery of anthocyanins. ................................................................... 100 
Figure 6.3.2.1 - Three-dimensional response surfaces of the influence of extraction pressure 
and temperature on the recovery of phenolic compounds. ................................................. 103 
Figure 6.3.2.2 - Two-dimensional response surfaces of the influence of extraction pressure 
and temperature on the recovery of phenolic compounds. ................................................. 104 
Figure 6.3.3.1 - Three-dimensional response surfaces of the influence of the extraction 
variables on the desirability. ............................................................................................... 106 
Figure 6.3.3.2 - Profiles of the predicted values and desirability of the extraction variables.
 ............................................................................................................................................ 106 
 xiv 
 
Figure 6.3.4.1 - Kinetics curves for the recovery of anthocyanins a) under optimum 
HPCDAE conditions (117 bar, temperature of 80 °C and of 20 %; b) obtained by control 
HPCDAE experiment (at atmospheric pressure, temperature of 80 ºC and 20 minutes of 
extraction) and c) PLE experiment (at 117 bar, temperature of 80 ºC, 20 minutes of 
extraction and flow rate of 1 mL/min of acidified water/min). .......................................... 109 
Figure 6.3.4.2 - Kinetics curves for the recovery of phenolic compounds a) under optimum 
HPCDAE conditions (117 bar, temperature of 80 °C and of 20 %; b) obtained by control 
HPCDAE experiment (at atmospheric pressure, temperature of 80 ºC and 20 minutes of 
extraction) and c) PLE experiment (at 117 bar, temperature of 80 ºC, 20 minutes of 
extraction and flow rate of 1 mL/min of acidified water/min). .......................................... 110 
Figure 7.2.1.1 - SEM micrograph of unprocessed quercetin sample. ................................ 122 
Figure 7.2.1.2 - SEM micrograph of unprocessed β-carotene sample. .............................. 122 
Figure 7.2.1.3 - SEM micrograph of unprocessed rutin sample. ........................................ 124 
Figure 7.2.2.1 - Schematic diagram of the SAS apparatus. 1 CO2 cylinder; 2 CO2 filter; 3 
manometers; 4 valves; 5 thermostatic bath; 6 CO2 pump; 7 back pressure regulator; 8 
solution reservoir; 9 solution pump; 10 thermocouple; 11 precipitation vessel; 12 heating 
bath; 13 temperature controllers; 14 micrometric valve with a heating system; 15 glass 
flask; 16 glass float rotameter; 17 flow totalizer. ............................................................... 126 
Figure 7.2.4.1 - Schematic diagram of the RESS apparatus. 1 CO2 cylinder; 2 CO2 filter; 3 
manometers; 4 valves; 5 thermostatic bath; 6 CO2 pump; 7 back pressure regulator; 8 pre-
expansion vessel; 9 micrometric valve with a heating system; 10 temperature controller; 11 
nozzle; 12 expansion vessel. ............................................................................................... 129 
Figure 7.3.1.1.1 - SEM micrograph of quercetin micronized particles obtained by SAS 
process. ............................................................................................................................... 133 
Figure 7.3.1.1.2 - SEM micrograph of quercetin micronized particles obtained by 
conventional process........................................................................................................... 133 
Figure 7.3.1.1.3 - Size distribution of quercetin particles obtained by SAS and conventional 
processes. ............................................................................................................................ 135 
Figure 7.3.1.2.1 - SEM micrograph of β-carotene micronized particles obtained by SAS 
process. ............................................................................................................................... 136 
Figure 7.3.2.1.1 - Optical micrographs of: 1) PEG sample; 2) bixin-rich extract 
encapsulated in PEG by SAS process (CO2 flow rate of 0.6 kg.h-1; mass ratio between core 
material and PEG of 1:10); 3) rutin encapsulated in PEG by RESS process (mass ratio 
between core material and PEG of 1:10); 4) anthocyanin-rich extract encapsulated in PEG 
by RESS process (mass ratio between core material and PEG of 1:10)............................. 140 
Figure 7.3.2.1.2 - SEM micrographs of: 1) bixin-rich extract encapsulated in PEG by SAS 
process (CO2 flow rate of 0.6 kg.h-1; mass ratio between core material and PEG of 1:10); 
2) rutin encapsulated in PEG by RESS process (mass ratio between core material and PEG 
of 1:2); 3) rutin encapsulated in PEG by RESS process (mass ratio between core material 
 xv 
 
and PEG of 1:10); 4) anthocyanin-rich extract encapsulated in PEG by RESS process (mass 
ratio between core material and PEG of 1:10). .................................................................. 141 
Figure 8.8.2.3.1.1 - Schematic diagram of the RESS apparatus. 1 CO2 cylinder; 2 CO2 
filter; 3 manometers; 4 valves; 5 thermostatic bath; 6 CO2 pump; 7 back pressure regulator; 
8 pre-expansion vessel; 9 micrometric valve with a heating system; 10 temperature 
controller; 11 nozzle; 12 expansion vessel. ........................................................................ 158 
Figure 8.2.3.2.1 - Encapsulation by entrapment in Ca-alginate beads. .............................. 162 
Figure 8.3.1.1 - Optical micrographs of unprocessed PEG (a), Encapsulated anthocyanin 
extract – T: 313.15 K; P: 100 bar (b), Encapsulated anthocyanin extract – T: 323.15 K; P: 
100 bar (c) ........................................................................................................................... 166 
Figure 8.3.1.2 - Influence of different proportions of anthocyanin extract:PEG on the 
percentage of encapsulated (gray bars); encapsulation efficiency (black bars) ................. 168 
Figure 8.3.1.3 - Antioxidant activity of encapsulated anthocyanin extracts obtained using 
different operating RESS conditions (gray symbols), the anthocyanin extract (♦) and pure 
synthetic BHT (■); without any antioxidant compound (▲) ............................................. 169 
Figure 8.3.3.1 - Degradation of free anthocyanin extract at different environments. ........ 170 
Figure 8.3.3.2 - Degradation of encapsulated anthocyanin extract at different environments 
by RESS process and conventional method. ......................................................................171 
Figure 8.3.4.3 - DSC thermograms of free anthocyanin extract, Ca-alginate beads, PEG, 
anthocyanin extract encapsulated in Ca-alginate beads and anthocyanin extract 
encapsulated in PEG. .......................................................................................................... 173 
Figure 8.3.4.1 - The cumulative release of anthocyanin extract from the encapsulated 
systems obtained by RESS process and conventional method at pH 1.4 and temperature 37 
ºC. ....................................................................................................................................... 174 
Figura A1- Esquema das transformações estruturais das antocianinas em função do pH 
gerando soluções coloridas. ................................................................................................ 201 
Figura A2- Espectro de varredura para os extratos de casca de jabuticaba obtidos utilizando 
diferentes métodos de extrações. ........................................................................................ 203 
Figura A3 - Curva de calibração previamente construída de ácido gálico (AG) ............... 206 
 
 
 xvi 
 
NOMENCLATURAS/ABREVIATURAS 
 
 
RESS - Rapid Expansion of Supercritical Solutions 
 
SAS - Supercritical fluid Anti-Solvent 
 
SSI - Supercritical Solvent Impregnation 
 
PGSS - Particles from Gas Saturated Solutions 
 
SFEE - Supercritical Fluid Extraction of Emulsions 
 
GRAS - Generally Recognised as Safe 
 
PEG - PolyEthylene Glycol 
 
SFE - Supercritical Fluid Extraction 
 
PLE - Pressurized Liquid Extraction 
 
USFE - Ultrasound-Assisted Supercritical Fluid Extraction 
 
LPLE - Low Pressure Liquid Extraction 
 
ASE – Accelerated Solvent Extraction 
 
PSE - Pressurized Solvent Extraction 
 
RSM - Response Surface Methodology 
 
HPCDAE - High Pressure Carbon Dioxide Assisted Extraction 
 
SCFs - SuperCritical Fluids 
 
 xvii 
 
RESUMO 
A indústria de alimentos está constantemente à procura de compostos que apresentam 
propriedades físicas e químicas para melhorar seus produtos. A maioria destes compostos 
são aditivos com propriedades antioxidantes, corantes ou aditivos com efeitos positivos 
sobre a saúde humana. Aditivos naturais são sempre preferíveis aos compostos sintéticos. 
Flavonóides e carotenóides são duas das principais classes de pigmentos funcionais pelas 
quais as indústrias de alimentos, cosmética e farmacêutica têm apresentado maior interesse. 
No entanto, estes compostos apresentam uma série de limitações ao serem aplicados em 
produtos processados. Diversos fatores, tais como luz, temperatura, pH, entre outros, 
desencadeiam a degradação oxidativa destes pigmentos funcionais limitando não só a 
aplicação final destes, mas também restringindo toda a cadeia do processo: desde a escolha 
do método de extração do pigmento da fonte vegetal até o tratamento que o produto 
formulado irá sofrer após a sua formulação passando pela escolha do método de redução do 
tamanho e/ou encapsulação das partículas visando a melhora da taxa de dissolução, 
biodisponibilidade e estabilidade destes compostos. Tecnologias de extração, micronização 
e estabilização de pigmentos funcionais por encapsulação em matrizes poliméricas 
utilizando fluidos pressurizados podem representar uma alternativa ambientalmente correta, 
uma vez que estão incluídas no conceito de "química verde" e do desenvolvimento 
sustentável, e economicamente viável em relação aos respectivos métodos convencionais, 
onde grandes quantidades de solventes orgânicos, longos tempos de processo e altas 
temperaturas são requeridas, o que pode promover a degradação, isto é, perda de cor e 
capacidade antioxidante, condições estas normalmente utilizadas nos processos 
convencionais. Adicionalmente, processos de extração e formação de partículas utilizando 
fluidos supercríticos permitem um fácil e eficiente controle do processo através de 
pequenas variações nas condições de operação (Pressão, Temperatura, etc.). Apesar de 
comercialmente encontrarem-se disponíveis equipamentos distintos para cada processo 
mencionado uma unidade para pesquisa que possibilite o estudo de diferentes processos 
com fluidos pressurizados proporcionaria uma melhor relação custo-benefício associada a 
esta tecnologia. Portanto, uma unidade multipropósito para o desenvolvimento de processos 
com fluidos pressurizados que possibilite a extração e formação de partículas de pigmentos 
 xviii 
 
funcionais, bem como de outros compostos bioativos em um único equipamento foi 
projetada, construída e testada. Processos de extração utilizando CO2 supercrítico ou 
líquidos pressurizados como solventes, assistidos por dióxido de carbono a alta pressão; de 
formação de partículas encapsuladas ou não via RESS (Rapid Expansion of Supercritical 
Solutions) e SAS (Supercritical fluid Anti-Solvent) foram desenvolvidos na unidade 
multipropósito produzindo resultados semelhantes aos obtidos por equipamentos similares, 
reprodutíveis e melhores do que quando utilizando processos convencionais. 
 
Palavras-chave: Estabilização, Extração, Fluidos Pressurizados, Micronização, Pigmentos 
Funcionais. 
 xix 
 
ABSTRACT 
The food industry is continuously searching compounds that present physical and chemical 
properties to improve their products. Most of them are additives with antioxidant 
properties, colorants or additives with positive effects to human health. Natural additives 
are always preferred to synthetic compounds. Flavonoids and carotenoids are two of the 
major functional pigments class that food, cosmetic and pharmaceutical industries are more 
interested recently. Nevertheless, these compounds present a series of limitations when 
applied to processed products. Several factors, such as light, temperature, pH, among 
others, trigger the oxidative degradation of theses functional pigments limiting not only 
their final applications, but also restricting all the process chain: from the choice of the 
extraction method of the pigment from the vegetable source, passing through the choice of 
the particle reduction and/or encapsulation technique aiming the improvement of the 
dissolution rate, biodisponibility and stability of these compounds. Technologies for 
extraction, micronization and stabilization of functional pigments into polymeric matrices 
using supercritical fluids may represent an environmentally friend alternative, once they are 
inserted in the concept of green chemistry and sustainable development, and economically 
viable comparing to conventional methods, wherein large amounts of organic solvents, long 
process time and high temperatures are required, that can promote degradation, i. e., color 
and antioxidant activity loss, conditions normally employed on conventional processes. 
Moreover, extraction and particle formation processes utilizing supercritical fluids permit 
an easy and efficient process control with little variation on operational conditions 
(Pressure, Temperature, etc.). Despite distinct commercial equipments are available to carry 
out each mentioned process a unit for research that can be used to carry out different 
processes with pressurized fluids would lead to a better cost-benefit relation associated to 
this technology. Therefore, a multipurpose unit to develop processes with pressurized fluids 
that can be used for extraction and particle formation purposes of functional pigments, as 
well as of other bioactive compounds using the same apparatus was designed, constructed 
and tested. Extraction processes using supercritical CO2, employing pressurized liquid 
solvents, assisted by high pressure carbon dioxide; particle formation processes to obtain 
encapsulated or non encapsulatedparticles via RESS (Rapid Expansion of Supercritical 
 xx 
 
Solutions) and SAS (Supercritical Anti-Solvent) were done using the multipurpose unit 
producing comparable experimental results to those obtained by similar equipments. Good 
reproducibility and better results than those obtained using conventional processes were 
observed employing our home-made apparatus. 
 
Keywords: Stabilization, Extraction, Pressurized Fluids, Micronization, Functional 
Pigments. 
 
 
1
CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO E OBJETIVOS 
1.1 Introdução 
O aumento da preocupação dos consumidores sobre o uso de aditivos sintéticos 
em produtos tem impulsionado as indústrias alimentícias, de cosméticos e farmacêutica em 
direção à substituição destes aditivos por produtos naturais. Entretanto, dificuldades têm 
sido encontradas devido, principalmente, à instabilidade destes compostos. Um exemplo 
são os pigmentos funcionais extraídos de fontes vegetais, tais como as antocianinas e 
carotenóides (KONG et al., 2003; MIKI, 1991). 
Os flavonóides e os carotenóides são responsáveis por uma grande variedade de 
cores presentes em vegetais, flores, frutas e produtos derivados. Oriundos do metabolismo 
secundário das plantas, ambas as classes de compostos são de grande importância para a 
sobrevivência delas, bem como quando ingeridos são responsáveis por diversos benefícios 
à saúde devido às suas atividades biológicas. Entre tais benefícios encontram-se a redução 
da incidência de muitas doenças oxidativas, inflamatórias, entre outras (REYNERTSON et 
al., 2008; ARTS; HOLLMAN, 2005). 
Diversos fatores, tais como luz, temperatura, pH, entre outros, desencadeiam a 
degradação oxidativa destes pigmentos funcionais (SANTOS; MEIRELES, 2009, 2010) 
limitando não só a aplicação final destes, mas também restringindo toda a cadeia do 
processo: desde a escolha do método de extração do pigmento da fonte vegetal até o 
tratamento que o produto final irá sofrer após a sua formulação, passando pela escolha do 
método de redução do tamanho (micronização) e/ou encapsulação das partículas visando a 
melhora da taxa de dissolução, biodisponibilidade e estabilidade destes compostos. 
O projeto de processos industriais, sob a ótica da sustentabilidade, visa 
alterações substanciais na indústria atual. Para tanto, é exigido o desenvolvimento de novos 
processos baseados em matérias-primas renováveis, na utilização mínima necessária de 
energia e solventes sem restrições ambientais. Neste contexto, as tecnologias baseadas na 
utilização de fluidos pressurizados parecem oferecer soluções para essas demandas. 
Tecnologias de extração de antocianinas e carotenóides utilizando fluidos 
pressurizados podem representar uma alternativa ambientalmente correta e 
 
 
2
economicamente viável em relação aos métodos convencionais de extração onde grandes 
quantidades de solventes, longos tempos de extração e altas temperaturas são requeridas, o 
que pode promover a degradação destes compostos durante o processo extrativo (JU; 
HOWARD, 2003; NOBRE et al., 2006). 
 Uma vez extraídos os pigmentos, pré-tratamentos destes aditivos podem ser 
realizados visando uma maior dissolução e/ou proteção/estabilização destes através de, 
respectivamente, técnicas de micronização e encapsulação em matrizes poliméricas 
(SELIM; TSIMIDOU; BILIADERIS, 2000). Técnicas utilizando fluidos pressurizados 
acima da condição crítica (conhecidos como fluidos supercríticos) permitem os objetivos 
requeridos sem levar o aditivo às condições que podem ocasionar sua degradação, isto é, 
perda de cor e capacidade antioxidante, condições estas normalmente utilizadas nos 
processos convencionais. Adicionalmente, processos de precipitação utilizando fluidos 
supercríticos permitem um fácil controle da formação de partículas através de pequenas 
variações nas condições de operação (Pressão, Temperatura, Relação Pigmento: Material de 
Encapsulação, etc.) (MATTEA; MARTÍN; COCERO, 2008). 
Diferentes processos de encapsulação que usam fluidos supercríticos, bem 
como equipamentos para a realização destes processos, têm sido desenvolvidos. Estes 
processos podem ser classificados de acordo com a função do fluido supercrítico no 
processo: solvente [“Rapid Expansion of Supercritical Solutions” (RESS)]; “Supercritical 
Solvent Impregnation” (SSI); soluto [“Particles from Gas Saturated Solutions” (PGSS)] ou 
anti-solvente [“Supercritical Anti-Solvent” (SAS); “Supercritical Fluid Extraction of 
Emulsions” (SFEE)] (MARTÍN; COCERO, 2008). 
Geralmente, tanto para os processos de extração com fluidos pressurizados, 
quanto para os processos de precipitação, solventes GRAS (“Generally Recognised as 
Safe”) são preferidos, sendo dióxido de carbono, água e etanol os mais utilizados. Apesar 
de, comercialmente, encontrarem-se disponíveis equipamentos distintos para cada processo, 
uma unidade para pesquisa que possibilite o estudo de diferentes processos com fluidos 
pressurizados proporcionaria uma melhor relação custo-benefício associada a esta 
tecnologia. 
 
 
3
1.2 Objetivos da Pesquisa 
1.2.1 Geral 
Construir e validar uma unidade multipropósito para o desenvolvimento de 
processos com fluidos pressurizados que possibilite a extração, micronização e 
encapsulação de pigmentos funcionais, bem como de outros compostos bioativos em um 
único equipamento. 
 
1.2.2 Específicos 
o Obter extratos ricos nos pigmentos antocianinas e em outros compostos 
antioxidantes a partir de cascas de jabuticaba utilizando a unidade construída para 
estudar os seguintes métodos: Extração com Líquidos Pressurizados utilizando 
etanol ou água acidificada como solvente; Extração Assistida por CO2 a Alta 
Pressão utilizando água acidificada como solvente, comparando os resultados com 
os obtidos utilizando o método convencional de Percolação em Leito Fixo; 
o Verificar a viabilidade técnica da extração supercrítica assistida por ultrassom na 
unidade construída, utilizando a extração de pigmentos carotenóides de sementes de 
urucum por CO2 supercrítico como processo de extração modelo; 
o Verificar a viabilidade técnica da encapsulação/co-precipitação de extrato rico em 
carotenóides oriundo de sementes de urucum, com o polímero polietilenoglicol 
(PEG) via SAS, utilizando a unidade construída e CO2 supercrítico como anti-
solvente; 
o Verificar a viabilidade técnica da encapsulação/co-precipitação de extrato 
antociânico de casca de jabuticaba e do pigmento funcional também da classe dos 
flavonóides rutina, com o polímero polietilenoglicol (PEG) via RESS utilizando a 
unidade construída e CO2 supercrítico como solvente e etanol como co-solvente; 
o Otimizar o processo de encapsulação/co-precipitação de extrato antociânico de 
casca de jabuticaba com o polímero polietilenoglicol (PEG) via RESS, utilizando a 
unidade construída e CO2 supercrítico como solvente e etanol como co-solvente, 
comparando os resultados relacionados à estabilidade com os obtidos pelo método 
 
 
4
convencional de gelificação iônica utilizando o biopolímero alginato como material 
de encapsulação. Adicionalmente, também se objetivou analisar a influência dos 
parâmetros de processo pressão e temperatura na estabilidade do extrato 
antociânico. 
 
 1.3 Estrutura da Tese de Doutorado 
Esta Tese de Doutorado está dividida em 8 capítulos da seguinte forma: 
O Capítulo 1 (Introdução) insere o leitor ao tema central desta tese, 
colocando, de forma sucinta, os pontos mais relevantes. 
O Capítulo 2 (Revisão da literatura) contextualiza o leitor no estado da arte 
referente a este trabalho de tese. 
O Capítulo 3 detalha a construção e o funcionamento da unidade 
multipropósito. 
O Capítulo 4 traz o artigo intitulado“Antioxidant pigment extraction using a 
home-made pressurized solvent extraction system”, que compara os resultados em termos 
de eficiência de extração utilizando CO2 supercrítico puro, obtidos pela unidade 
multipropósito com os obtidos por uma unidade de extração supercrítica comercial, com a 
finalidade de validação da unidade construída. Para tanto, foram utilizadas como fontes 
vegetais modelos duas fontes ricas em pigmentos funcionais: sementes de urucum e cascas 
de jabuticaba. Adicionalmente, neste capítulo, a viabilidade técnica de se desenvolver 
processos de extrações fracionadas e extrações com fluidos pressurizados assistida com 
ultrassom foi verificada. De uma maneira geral, este capítulo relata uma etapa fundamental 
para o sucesso no desenvolvimento do restante do trabalho, uma vez que os resultados 
obtidos demonstraram que a unidade construída no desenvolvimento de extrações 
utilizando fluidos pressurizados produz resultados similares aos obtidos por equipamentos 
comerciais, bem como resultados reprodutíveis. 
O trabalho seguinte foi explorar a potencialidade de obtenção de extratos ricos 
em antocianinas utilizando a unidade multipropósito validada conforme descrito no capítulo 
anterior. Neste contexto, o artigo apresentado no Capítulo 5, intitulado “Pressurized liquid 
 
 
5
extraction of phenolic compounds from jabuticaba skins: optimization study”, investiga a 
influência das variáveis: Pressão, Temperatura e Tempo de Extração Estática, e otimiza o 
processo de extração de antocianinas e outros compostos fenólicos de cascas de jabuticaba 
utilizando etanol pressurizado. Ao final, os resultados obtidos empregando condições 
otimizadas foram comparados aos obtidos utilizando o método convencional à baixa 
pressão de percolação em leito fixo. 
O artigo apresentado no Capítulo 6, intitulado “Optimization of bioactive 
compounds extraction from jabuticaba (Myrciaria cauliflora) skins assisted by high 
pressure CO2”, traz os resultados obtidos para a extração de antocianinas e outros 
compostos fenólicos de cascas de jabuticaba também utilizando a unidade construída, 
porém agora configurada para desenvolver uma metodologia de extração diferente, 
chamada de extração assistida com CO2 a alta pressão. Neste trabalho é investigada a 
influência das variáveis: Pressão, Temperatura e Relação entre o Volume de Matéria-prima 
+ Solvente e o Volume de CO2 dentro da célula extratora na extração de antocianinas e 
outros compostos fenólicos. Ao final, foi realizada uma comparação dos resultados obtidos 
empregando condições otimizadas com os obtidos desenvolvendo a metodologia de 
extração com líquidos pressurizados também utilizando esta unidade com o mesmo 
solvente (Água acidificada) nas mesmas temperatura e pressão. 
 Continuando com a mesma abordagem descrita no Capítulo 4, de verificar se a 
unidade construída produz resultados similares aos obtidos por equipamentos similares 
(validação da unidade multipropósito construída), o Capítulo 7 traz o artigo intitulado 
“Micronization and encapsulation of functional pigments using supercritical carbon 
dioxide” que apresenta um estudo comparativo das partículas formadas pela unidade 
construída com as formadas por outros equipamentos de outros grupos de pesquisa. 
Adicionalmente, neste capítulo foi estudada a viabilidade técnica de se desenvolver 
processos de formação de partículas encapsuladas de extrato de sementes de urucum 
(obtidos conforme descrito no Capítulo 4), de extrato de cascas de jabuticaba (obtidos 
conforme descrito no Capítulo 5) e de pigmento rutina puro utilizando como material de 
encapsulação polietilenoglicol (PEG). 
 
 
6
Uma vez demonstrada a potencialidade de formação de partículas encapsuladas 
de extrato de cascas de jabuticaba empregando a unidade multipropósito no Capítulo 7 este 
processo foi mais bem explorado no Capítulo 8, bem como foi verificado o potencial de 
aumento de estabilidade deste extrato quando protegido por matrizes poliméricas. O artigo 
intitulado “Stabilization of anthocyanins from jabuticaba skins by encapsulation using 
supercritical CO2” analisa também a influência dos parâmetros de processo pressão e 
temperatura na estabilidade do extrato antociânico. Ao final, foi realizada uma comparação 
dos resultados obtidos empregando condições otimizadas com os obtidos utilizando o 
método convencional à baixa pressão gelificação iônica. De uma maneira geral, este 
capítulo encerra os objetivos previstos para este trabalho de tese, fechando o ciclo de 
validação-experimentação dos processos de extração e formação de partículas que a 
unidade multipropósito pode desenvolver. 
O Capítulo 9 (Conclusões gerais) discorre sobre os principais resultados 
obtidos em cada um dos artigos apresentados nesta tese. 
O Apêndice I traz um artigo de revisão sobre as antocianinas, discorrendo 
sobre a estrutura química, propriedades benéficas à saúde e principais fontes de obtenção 
destes compostos, enfatizando que para o Brasil as cascas de jabuticaba podem ser uma 
potencial fonte destes pigmentos instáveis. Já o Apêndice II traz o detalhamento do 
procedimento de cálculo para a determinação da concentração de antocianinas e compostos 
fenólicos presentes nos extratos obtidos neste trabalho. O Apêndice III traz um artigo de 
revisão sobre os métodos de formação de partículas que discorre sobre as vantagens e 
limitações dos principais métodos empregados atualmente, descrevendo como cada 
processo é desenvolvido, bem como enfatizando a potencialidade de utilizar os métodos 
que empregam fluidos supercríticos na formação de partículas encapsuladas em matrizes 
poliméricas. Finalmente, o Apêndice IV traz o manual de operação da unidade 
multipropósito construída, detalhando o procedimento adotado para o desenvolvimento dos 
processos estudados nesta tese, bem como os procedimentos para a realização de outros 
processos que a unidade possibilita desenvolver. 
 
 
7
Nesta Tese de Doutorado, o desenvolvimento dos capítulos e apêndices 
apresenta-se através de artigos publicados/submetidos ou a serem submetidos a periódicos. 
Permissões para a utilização dos artigos publicados em periódicos foram devidamente 
obtidas com as respectivas editoras, previamente. 
 
 
 
8
 
 
9
CAPÍTULO 2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 
2.1. Pigmentos Funcionais 
Existe grande interesse sobre as propriedades benéficas que os componentes 
nutracêuticos presentes em alimentos propiciam à saúde humana (PALIYATH, 2003). Têm 
sido adquirido conhecimento científico a respeito dos ingredientes presentes nos alimentos 
que ingerimos, com potencial para prevenir e tratar doenças específicas. Paralelo a isto, 
novas tecnologias, como a biotecnologia e a engenharia genética especificamente, têm 
criado uma era onde descobertas científicas e produtos inovadores são cada vez mais 
comuns. Estes desenvolvimentos têm resultado num aumento do número de produtos 
potencialmente nutricionais com benefícios para a saúde, produtos estes chamados de 
“alimentos funcionais”. Os alimentos funcionais, além do valor nutritivo básico, contêm um 
equilíbrio próprio de ingredientes, os quais podem ajudar diretamente na prevenção e 
tratamento de doenças (GOLDBERG, 1994). As substâncias bioativas presentes nos 
alimentos funcionais representam constituintes “extranutricionais” naturalmente presentes 
em pequenas quantidades na matriz do alimento (KITTS, 1994). 
Estas substâncias bioativas são pertencentes ao grupo dos compostos do 
metabolismo secundário de plantas, também chamados de compostos fitoquímicos, e 
podem ser definidos como substâncias derivadas de plantas que são altamente ativas do 
ponto de vista nutricional, fisiológicoe/ou medicinal (GOLDBERG, 1994). 
Os pigmentos naturais presentes naturalmente em alimentos proporcionam cor, 
contribuindo para seu aspecto visual, atributo que está diretamente relacionado à aceitação 
deste alimento pelos consumidores (CLYDESDALE, 1993). O consumo de um alimento 
que possui em sua composição aditivos corantes naturais é associado à imagem de um 
alimento de qualidade e saudável; além dos corantes sintéticos possuírem a tendência de 
serem vistos como indesejáveis e prejudiciais, alguns são responsabilizados por reações 
alergênicas e de intolerância (MONTES et al., 2005). Pigmentos das classes dos 
flavonóides e carotenóides têm sido relacionados a importantes funções e ações 
fisiológicas, podendo ser considerados promotores da saúde humana. A ingestão de frutas e 
vegetais está sendo associada com a diminuição do desenvolvimento de doenças crônico-
 
 
10
degenerativas tais como câncer, inflamações, doenças cardiovasculares, catarata, 
degeneração macular, entre outras (KONG et al., 2003; KRINSKY, 1994). De forma geral, 
as propriedades antioxidantes destes compostos parecem ser a chave para a elucidação dos 
mecanismos envolvidos nestas ações. 
 
2.1.1 Flavonóides 
 Os flavonóides são pigmentos naturais presentes nos vegetais que desempenham um 
papel fundamental na proteção contra agentes oxidantes, como por exemplo, os raios 
ultravioleta, a poluição ambiental, substâncias químicas presentes nos alimentos, entre 
outros. Eles atuam como agentes terapêuticos num elevado número de patologias, tais como 
arteriosclerose, cancer, etc (PASSAMONTI et al., 2009). 
Dado que não podem ser sintetizados pelo nosso organismo, sendo 
representativos da parte não energética da dieta humana, os flavonóides são obtidos através 
da ingestão de alimentos que os contenham. Exemplos de fontes de flavonóides são frutas, 
verduras, cerveja, vinho, chá e soja. A maioria dos flavonóides presentes no vinho provém 
da uva, especialmente da pele (KOSMIDER; OSIECKA, 2004). 
Os flavonóides apresentam uma estrutura química base C6-C3-C6 (dois anéis 
benzênicos – A e B – ligados através de um anel pirano – C (Figura 2.1.1.1). Dependendo 
da substituição e do nível de oxidação no anel C, os flavonóides podem ser divididos em 14 
classes, sendo os que se incluem na dieta humana divididos essencialmente em 6 grupos 
(PASSAMONTI et al., 2009; KOSMIDER; OSIECKA, 2004; ERLUND, 2004): 
• Flavanóis – possuem um grupo hidroxila na posição 3. Exemplos: catequina, 
epicatequina. 
• Flavonóis – possuem um grupo carbonila na posição 4, um grupo hidroxila 
na posição 3 e uma ligação dupla entre as posições 2 e 3. Exemplos: 
quercetina, kaempferol, quercitagetina, etc. 
• Flavonas – possuem um grupo carbonila na posição 4 e uma ligação dupla 
entre as posições 2 e 3. Exemplos: rutina, apigenina, luteoleína, etc. 
 
 
11
• Antocianidinas – possuem um grupo hidroxila na posição 3 e duas ligações 
duplas: uma entre o átomo de oxigênio e o carbono 2 e outra entre os 
carbonos 2 e 3. Exemplos: cianidinas, petunidinas, malvidina, etc. 
• Isoflavonóides – possuem um grupo carbonila na posição 4 e o anel B 
encontra-se ligado ao restante da molécula através do carbono 3. Podem 
ainda possuir uma ligação dupla entre os carbonos 2 e 3. Exemplos: 
genisteína, coumestrol, etc. 
• Flavononas – possuem um grupo carbonila na posição 4. Exemplos: 
miricetina, hesperidina, etc. 
 
Figura 2.1.1.1 - Estrutura base dos flavonóides. 
 
Dentro da mesma classe, os flavonóides diferem na substituição dos anéis A e 
B. Estes se encontram na natureza sob a forma de glicosídeos, o que promove uma melhor 
absorção intestinal e uma maior biodisponibilidade destes compostos. Os glicosídeos 
formam-se através da união de resíduos de D-glicose à posição 3 ou à posição 7 destes 
flavonóides, sendo a primeira substituição a mais freqüente. Outros resíduos de açúcares, 
que também podem se encontrar ligados a este tipo de compostos, são a D-galactose, a L-
ramnose, a L-arabinose, a D-xilose e o ácido D-glucurônico (ERLUND, 2004). 
As antocianinas são um dos exemplos de flavonóides encontrados na natureza 
sob a forma de glicosídeos. Antocianinas são compostos derivados das antocianidinas. Nas 
antocianinas, uma ou mais hidroxilas das posições 3, 5 e 7 estão ligadas a açúcares, aos 
 
 
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quais podem estar ligados ácidos fenólicos. Os diferentes grupos R e R´ ligados nas 
posições 3´e 5´ e açúcares ligados nas posições 3, 5 e 7, assim como os ácidos a eles 
ligados, caracterizam os diferentes tipos de antocianinas, sendo que a mais comum é a 
cianidina-3-glicosídeo (SANTOS; MEIRELES, 2009). Maiores detalhes sobre as 
antocianinas: estrutura química, instabilidade, propriedades benéficas à saúde e principais 
fontes de obtenção destes compostos são encontrados no Apêndice I desta tese. Neste 
Apêndice também é demonstrado que, para o Brasil, as cascas de jabuticaba (Figura 
2.1.1.2) podem ser uma potencial fonte destes pigmentos. 
Diversos fatores, tais como luz, temperatura, pH, entre outros, desencadeiam a 
degradação oxidativa das antocianinas, sendo estes compostos mais estáveis em meios 
ácidos do que em alcalinos. A natureza da estrutura iônica das antocianinas possibilita 
mudanças na estrutura molecular de acordo com o pH, resultando diferentes cores. Em pH 
< 3, a antocianina cianidina-3-glicosídeo, por exemplo, existe primariamente como uma 
estrutura molecular que resulta na cor vermelha. Aumentando-se os valores de pH do meio, 
novas formas moleculares são produzidas, resultando em cores que vão desde o violeta a 
uma forma incolor. Zhang et al. (2010) sugere que a degradação da cianidina-3-glicosídeo 
se inicia devido a facilidade de se hidrolisar o grupo glicosídeo ligado a estrutura base. Um 
esquema das transformações estruturais das antocianinas em função do pH gerando 
soluções coloridas é apresentado no Apêndice II. 
 
Figura 2.1.1.2 - Cascas de jabuticaba. 
 
 
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Além da identificação dos tipos de antocianinas presentes nos extratos, a 
determinação da sua concentração, bem como de outros compostos co-extraídos, é de 
extrema importância, pois elas estão associadas às funções biológicas destes extratos. Para 
a determinação da concentração dos flavonóides antocianinas nos extratos, os métodos 
baseados nas transformações estruturais das antocianinas em função do pH, gerando 
soluções coloridas, têm propiciado resultados confiáveis, sendo o método denominado de 
método do pH diferencial descrito por Giusti e Wrolstad (2001) um dos mais utilizados. 
Maiores informações sobre o procedimento de cálculo deste método são encontradas no 
Apêndice II desta tese. Neste Apêndice também é descrito como é feito o cálculo da 
concentração de compostos fenólicos presentes nos extratos (incluindo a concentração de 
antocianinas e outros compostos fenólicos co-extraídos). 
 
2.1.2 Carotenóides 
Os carotenóides são uma classe de compostos lipofílicos amplamente 
conhecidos pelo seu poder corante que pode variar do amarelo ao vermelho. A sua estrutura 
básica é um tetraterpeno com 40 átomos de carbono, formado por oito unidades 
isoprenóides de cinco carbonos, ligados de tal forma que a molécula é linear com simetria 
invertida no centro. A principal característica dos carotenóides é um sistema de ligações 
duplas conjugadas, que corresponde ao cromóforo, e que permite a estes compostos 
absorver luz na região do visível, como pode ser observado na estrutura do β-caroteno 
(Figura 2.1.2.1) (MIKI, 1991). 
 
Figura 2.1.2.1 - Estrutura do β-caroteno 
 
 
 
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Os carotenóides são inicialmente divididos em dois grandes grupos, os 
carotenos que quimicamente são hidrocarbonetos, e as xantofilas que sãoderivados 
oxigenados. Neste último grupo estão incluídos pigmentos que possuem em sua estrutura 
grupos hidroxílicos, carbonílicos, carboxílicos e/ou epóxidos. Podendo ser também 
acíclicos, monocíclicos ou bicíclicos. Muitas outras modificações estruturais ainda são 
possíveis, permitindo obtenção de uma diversidade de compostos (BRITTON, 1995). 
Alguns dos tipos de carotenóides mais amplamente distribuídos na natureza são: β-
caroteno, licopeno, luteína, zeaxantina, bixina, entre outros (MCCLEMENTS et al., 2009; 
ALBUQUERQUE; MEIRELES, 2010). 
A significância dos carotenóides não é somente devido às suas propriedades 
corantes, eles também são muito importantes para a saúde. Estes compostos também 
desempenham importante papel nutricional como precursores de vitamina A, além de 
outras ações, tais como proteção contra alguns tipos de câncer, doenças cardiovasculares, 
cataratas, degeneração macular e melhoria do sistema imunológico (GOUVEIA; EMPIS, 
2003; ROBERT et al., 2003). 
Edge, McGarvey e Truscott (1997) associaram, em seus estudos, as funções 
biológicas dos carotenóides em seres humanos. De acordo com estes autores, esses 
compostos podem ser importantes na proteção de células atuando como antioxidantes 
contra radicais livres e seqüestrando oxigênio singlete devido ao seu longo sistema de 
ligações duplas conjugadas. 
Pigmentos das classes dos carotenóides, assim como os da classe dos 
flavonóides, têm sua degradação oxidativa acelerada pela luz, temperatura e/ou pH extremo 
na presença de oxigênio (SANTOS; MEIRELES, 2010). 
Comercialmente, uma das fontes vegetais de pigmentos mais amplamente 
utilizadas pela indústria de alimentos é o urucum (Bixa orellana), correspondendo em torno 
de 90% do total de consumo de corantes naturais no Brasil, e em torno de 70% de corantes 
naturais mundialmente empregados em alimentos (CONSTANT; STRINGHETA; SANDI, 
2002). No Brasil, o urucum é uma espécie economicamente importante e ocorre em todas 
as regiões brasileiras e sua disseminação em diversas regiões do mundo está relacionada 
 
 
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com a procura por corante natural pelas indústrias de medicamentos, cosméticos, têxteis e 
principalmente alimentar (FRANCO et al., 2008). 
Urucum (Bixa orellana L.) é uma arvore tropical cujas sementes são ricas no 
pigmento da classe dos carotenóides conhecido como bixina, o qual é somente encontrado 
nesta fonte vegetal. Quimicamente bixina (C25H30O4) é um mono-metil ester do ácido 
dicarboxílico norabixina, um outro importante pigmento encontrado nas sementes de 
urucum (Figura 2.1.2.2). Entre outras aplicações, estes corantes são usados pela indústria 
alimentícia para melhorar queijos, margarinas e manteigas (ANDERSON et al., 1997). 
 
Figura 2.1.2.2 - Sementes de urucum. 
 
2.2. Métodos de Extração 
Existem, na literatura, várias metodologias de obtenção de extratos de vegetais, 
utilizando vários solventes, empregando ou não altas pressões e temperaturas ou até mesmo 
associando metodologias no intuito de obter um ou mais extratos com o perfil fitoquímico 
desejável, com alto rendimento e que não possua características indesejáveis como a 
presença de compostos co-extraídos como ceras e clorofila e a presença residual de 
solventes (BRAGA, 2005). A seguir são descritos alguns métodos que foram utilizados na 
obtenção de extratos ricos em antocianinas e no carotenóide bixina. 
O solvente mais utilizado na extração de antocianinas é o metanol, apesar da 
sua toxicidade. Entretanto, para algumas aplicações onde o aspecto quantitativo não é 
 
 
16
prioritário, etanol e água também têm sido utilizados. A limitação do uso de etanol e água 
está relacionada com a menor eficiência na extração de antocianinas (TERCI, 2004). Estas 
metodologias, também chamadas de convencionais, implicam na co-extração de compostos 
não fenólicos como açúcares, ácidos orgânicos e proteínas, requerendo uma subseqüente 
purificação destes extratos, uma vez que estes processos geralmente apresentam baixa 
seletividade (CASTAÑEDA-OVANDO et al., 2009). 
Comumente, métodos de extração convencionais, tais como soxhlet, por 
agitação, por percolação em leito fixo, entre outros, são utilizados nos processos de 
extração de antocianinas, entretanto, estes métodos geralmente consomem muito tempo e 
grande quantidade de solventes e podem degradar estes compostos durante o processo 
extrativo. Segundo Pinedo (2007), a hidrólise completa dos açúcares ligados a antocianinas, 
açúcares que propiciam melhor estabilidade dos pigmentos após a extração, ocorre em 1 
hora a 333,15 K na presença de etanol acidificado com 1% de HCl. 
Visando eliminar estas limitações, métodos de extrações rápidas que utilizam 
fluidos pressurizados têm sido empregados com sucesso para a obtenção de extratos ricos 
em antocianinas (ARAPITSAS; TURNER, 2008). Também, a utilização de tratamentos 
com ultrassom e CO2 a alta pressão, auxiliares ao processo extrativo de antocianinas, tem 
demonstrado melhorar o desempenho da extração, aumentando rendimento, reduzindo o 
tempo de extração, etc. (CAI et al., 2003; XU et al., 2010). 
Extratos comerciais de sementes de urucum são obtidos utilizando vários 
processos, tais como extração com óleos vegetais, com solução alcalina e com solventes 
orgânicos: clorofórmio, diclorometano, acetona e metanol (PRESTON; RICKARD, 1980). 
As preparações de extratos ricos em pigmentos têm as desvantagens de conterem pequenas 
concentrações do composto bioativo alvo (bixina), bem como apresentar solvente tóxico no 
produto final. Suspensões de extratos de urucum em óleos vegetais são mais concentradas, 
mas podem conter produtos de degradação devido ao fato de altas temperaturas (> 100 ºC) 
serem empregadas nestes processos, afetando a qualidade do extrato (MCKEOWN; 
MARK, 1962; REITH; GIELEN, 1971). 
 
 
17
Visando eliminar estas limitações, o emprego de fluidos pressurizados em 
condições supercríticas como solventes de extração na obtenção de extratos ricos no 
carotenóide bixina tem se demonstrado uma potencial opção (MENDES et al., 2003). 
A alta seletividade do processo de extração supercrítica, através de pequenas 
alterações nas variáveis do processo (pressão e temperatura), aliada à eliminação de 
solventes residuais no produto final e ao uso de baixas temperaturas ao se utilizar CO2 
supercrítico puro na obtenção de extratos ricos em bixina a partir de sementes de urucum, 
têm sido as principais justificativas para a utilização deste método de extração em 
substituição aos métodos convencionais (ANDERSON et al., 1997; NOBRE et al., 2006; 
SILVA et al., 2008). 
 
2.2.1 Extração com Fluidos Pressurizados 
Os fluidos supercríticos caracterizam-se por a sua temperatura e pressão serem 
superiores aos correspondentes valores críticos. Acima do ponto crítico, deixa de haver 
tensão superficial e separação entre as fases líquida e gasosa em equilíbrio, formando-se 
uma única fase supercrítica, cujas propriedades são intermediárias daqueles dois estados. 
Abaixo do ponto crítico o fluido pode existir como um líquido ou como um vapor 
(SANDLER, 1989). A Tabela 2.2.1.1 registra a pressão e temperatura críticas de alguns 
fluidos com interesse em processos de extração. 
 
Tabela 2.2.1.1 - Propiedades críticas de alguns fluidos com interesse em extração (MENDES 
et al., 2003) 
Fluido Tc (ºC) Pc (bar) 
Etileno 9,4 50,4 
Dióxido de carbono 31,1 73,8 
Etano 32,4 48,8 
Óxido nitroso 36,6 72,4 
Propano 96,8 42,5 
 
 
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Etanol 240,9 61,4 
Benzeno 289,1 48,9 
Tolueno 318,8 41,0 
Água 401,3 221,2 
 
Nas proximidades da região crítica, os fluidos não apenas são solventes eficazes 
para a extração de compostos bioativos de fontes